文摘

神经挤压伤是一个行之有效的axonotmetic模型在实验再生研究调查各种药物治疗的影响。猴头菌属erinaceus是一个温带蘑菇,但现在被种植在热带马来西亚。在这项研究中,我们调查的水提物的活性h . erinaceus新鲜的果期的身体在促进功能恢复后在成年雌性Sprague-Dawley axonotmetic腓神经损伤大鼠每日口服。目的是调查可能使用这种蘑菇治疗受伤的神经。功能恢复行走的评估行为实验的跟踪分析。腓侧的功能指数(PFI)确定手术前和手术后大鼠表现出复苏的迹象。组织学检查进行腓神经和免疫荧光染色的神经肌肉接头结合silver-cholinesterase污渍。PFI的分析表明,回归大鼠后肢功能发生前的水提物或mecobalamin(积极控制)组与阴性对照组相比。轴突再生和神经移植肌伸肌肌腱牵向前运动终板的开发的水提物或mecobalamin组大鼠比阴性对照组。这些数据表明,每日口服水提取物h . erinaceus新鲜的果期身体可以促进大鼠腓神经受伤的再生恢复的早期阶段。

1。介绍

是常见的周围神经问题,包括大范围的创伤性损伤、疾病、肿瘤和医源性损伤。创伤性损伤的发病率估计每年超过500 000个病人(1]。周围神经受伤导致部分或全部损失的电动机,感觉和身体的自主功能涉及的领域。神经挤压伤是足够的调查的固有细胞和分子事件介入周围神经再生,并评估因素,如药物可能增加的速度再生和神经移植的有效性1]。众所周知,在受伤后由于组织破坏,氧自由基增加,导致组织损伤(2]。

传统上,功能性神经缺陷弥补了许多方法,包括神经传递、神经移植、人工神经导管桥接和end-to-side neurorrhaphy [3]。然而,这些方法只提供一个再生的环境对受伤的神经。复苏的功能取决于各种地方和系统性因素。再生轴突的残端神经远端神经受伤的树桩是最重要的因素之一,在外围组织的再生。最近的研究表明,局部应用神经营养因子可以增强受损神经元的存活和再生损伤轴突的老鼠在中枢和周围神经系统(4]。然而,当地的治疗并不是一个理想的治疗模式。另一方面,系统管理的有益作用在轴突再生神经营养因子在很大程度上限制了酶促降解。此外,神经营养因子系统交付给意想不到的副作用,如循环的毒性蛋白(5]。因此,重要的是要探究物质可以产生neurotrophin-like没有毒性问题对轴突再生的影响。

药用蘑菇有一个非常传统的亚洲国家,而其使用在西半球过去几十年以来一直只略微增加。科学杂志称为国际期刊的药用蘑菇,几本书和评论关于药用蘑菇,蘑菇和生物活性化合物和国际会议关于这个话题证实这一趋势6]。原则上,整个蘑菇(主要是子实体),提取(从子实体或菌丝体)和孤立的化合物是适合使用。获得的材料可以收集来自野外,种植蘑菇子实体或农场和收获的栽培与液体或固体基质发酵的菌丝体。准备的提取可以提取蘑菇(干和新鲜)合适的溶剂。纯化合物可以通过隔离从自然或种植材料或化学合成(6]。

的药用价值猴头菌属erinaceus(牛。:Fr)珀耳斯。(h . erinaceus),也被称为狮子的鬃毛,猴子的脑袋,猴头蘑,好色之徒的胡子,Pom Pom布兰科,Igelstachelbart和Yamabushitake众所周知几百年来在传统中国和日本烹饪和草药治疗各种人类疾病。果期的身体是由许多成分如多糖、蛋白质、凝集素、酚类、hericenones, erinacines和萜类化合物。这些组件的一些生物活性也一直在研究[7]。

的最有前途的活动h . erinaceus神经生长因子的刺激(神经生长因子)合成的hericenones果期身体和erinacines从菌丝体8]。一个exo-polysaccharide来自h . erinaceus促进神经细胞分化和生存9]。神经营养活动源自干果期的尸体h . erinaceus也一直在研究大鼠海马神经元片(10,11]。提取的h . erinaceus促进培养的小脑细胞的正常发育,并演示了一个监管影响髓鞘创世纪的过程在体外髓损伤后(12]。轴突的髓鞘是一个结构组件,这是非常重要的动作电位传导神经。髓损伤结构紧凑会导致神经系统的损伤和严重的疾病。我们之前的研究表明,水提物的蘑菇生长在热带环境中可能会刺激神经突神经混合培养细胞的克隆产物NG108-15 [13]。这些发现表明h . erinaceus可能有潜在的刺激神经元再生治疗衰老,阿尔茨海默氏症、中风修复神经创伤,改善肌肉或运动反应途径和认知功能。

药用价值的研究h . erinaceus生长在马来西亚,一个热带国家,是最小的,有待探讨。据我们所知,没有信息的神经再生和修复属性当地种植蘑菇h . erinaceus。因此,这项研究的目的是评估腓神经再生水提物的活动h . erinaceus新鲜的果期的身体在成年女性Sprague-Dawley挤压伤后大鼠。

2。方法

2.1。果期的尸体h . erinaceus和水提物的准备

猴头菌属erinaceus新鲜的果期尸体从蘑菇农场获得海岬圣帕,雪兰莪州,马来西亚。是培养介质包含rubberwood锯末、米糠和碳酸钙的质量比400 ?:? 8 ?:? 5。接种袋被放置在通风良好的蘑菇房子(±2)27日(32±2)°C。300年呢?每800克新鲜子实体?g每袋的衬底产卵后60天内运行(Cheng Poh Guat、个人通信)。新鲜的果期与蒸馏水尸体煮比1:1 30 ?30分钟搅拌,离开了吗?分钟,冷却和过滤14]。

2.2。动物分组的原则

使用老鼠是动物保健和使用委员会批准的医学院,马来亚大学批准文号安娜/ 16/03/2007 MDKN (R)。四十个成年女性Sprague-Dawley老鼠体重180±20吗?g是10大鼠随机分为四组。阴性对照组收到每日口服蒸馏水(10毫升?公斤¹每天体重),实验组接受低或高剂量的水提物新鲜的果期的身体(10或20毫升?公斤¹每天体重)和阳性对照组收到mecobalamin (130 ?g ?公斤¹每天体重)使用不锈钢喂针14天作为手术前预处理。

2.3。外科手术

14天的预处理后,老鼠与腹腔内注射3.5%水合氯醛麻醉(10毫升?公斤¹体重),然后刮洗和消毒溶液为手术前定位。正确的坐骨神经和它的两个主要分支通过臀部muscle-splitting切口暴露。创建一个挤压伤钟表匠钳没有使用好。4 10 ?在10的腓神经?毫米从趾长伸肌肌腱牵向前(EDL)肌肉和完成粉碎的存在证实了一个半透明的乐队在神经(图1)。切口封闭在层与可吸收缝合线(肌肉和皮肤)。所有操作进行正确的肢体和左侧肢体担任不运转的控制。关闭切口和缝合后,兽医伤口粉(兽医英国有限公司)是应用于伤口。手术后,美联储蒸馏水、水提取物或mecobalamin续传另一个20天。所有的老鼠都在观察,随意整个研究获得食物和水。

2.4。后肢复苏的功能评估

2.4.1。行走轨迹分析

老鼠被允许行走轨道调节试验(8.2×42 ?厘米)黑暗的一端。白色办公室剪纸到适当的维度是放置在底部的轨道。大鼠后肢蘸墨,和老鼠被允许走,离开它的后脚打印在纸上(图2)。脚输出得到手术前(0),4天,7、10、14手术后大鼠表现出复苏的迹象。

腓侧的功能指数(PFI)是基于多元线性回归分析的因素来自测量大鼠腓神经损伤患者的行走轨迹。的因素导致了PFI是打印长度系数(PLF)和toe-spread因素(TSF)。成对的测量印刷长度(从脚跟到脚趾)(PL)和toe-spread(距离第一到第五个脚趾)(TS)被不运转的/正常(N)脚和相应的操作/实验(E)脚(15]

确定完全恢复功能,当每个组的PFI趋于稳定或恢复术前的值。

2.5。除腓神经和免疫荧光染色

定性评价腓神经再生神经纤维细丝通过免疫荧光染色。神经纤维细丝是一种中间丝作为支持轴突的细胞骨架细胞质的主要元素。右腓骨的神经解剖出很仔细,他们的近端和远端被确定在手术后14天结束。侧腓骨的神经也获得。一系列20吗?米纵向部分被削减在-20°C和低温恒温器切片机安装在保利-l赖氨酸涂布幻灯片。20的部分与冻结丙酮固定吗?5分钟,然后洗了三次?每个0.01分?米磷酸缓冲盐含有0.3% Triton x - 100(洗涤缓冲)。

评估的腓神经再生,部分在10%的正常羊血清孵化洗涤缓冲缓冲区(阻塞)1 ?在室温下h。部分被孵化兔子anti-neurofilament 200多克隆抗体(1:80稀释阻断缓冲区,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在4°C 20吗?h在湿度室,洗洗涤缓冲和随后进一步反应FITC-conjugated二级抗体羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 160年阻止缓冲区,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下为1 ? h。相同的洗涤过程后,部分与不变色试剂盖玻片。所有部分都检查了尼康Eclipse 80我在荧光显微镜照明使用FITC过滤器和图像分析的尼康成像软件,NIS-Elements。

2.6。神经肌肉接头的微观组织检查

EDL不运转的肌肉和四肢被移除操作手术后14天。肌肉长度被固定在固定休息6 buffered-formol钙吗?cryoprotection h和沉浸在10%蔗糖的解决方案。冻结部分(50 ?米)在低温恒温器减少纵向切片机在-20°C和彩色的神经肌肉接头结合silver-cholinesterase方法(16]。部分被孵化acetylthiocholine碘溶液以乙酰胆碱酯酶染色的运动终板。神经纤维/轴突被10%硝酸银溶液中浸渍染色。这个过程,神经纤维染黑,运动终板在棕色和黄色的肌肉纤维。支配一个终板被认为是polyneuronally当两个或两个以上的轴突接近来自相同或不同的方向,可以分别追踪他们的肌内神经束17]。100年每一块肌肉,运动终板随机检查他们是否联系到一个或多个轴突终端。运动终板的数量是支配polyneuronally表示为侧支配的总数的百分比。

2.7。统计分析

数据的手段受到单向方差分析(方差分析)和意义之间的区别意味着是由邓肯的多个范围测试至少95%显著差异(P< . 05)。

3所示。结果

没有任何迹象表明所有组的老鼠感染或足部溃疡在任何时间在整个实验。正常步态记录为后肢脚趾完全扩散在每组手术。挤压伤的腓神经导致瘫痪肌肉反伊斯兰教英国防御联盟。观察屈曲挛缩(脚)下降由于缺少踝关节背屈。老鼠往往拖脚的背,直到神经纤维的神经移植到EDL肌肉。

3.1。功能恢复增强治疗组

功能评估显示,复苏的水提物组或mecobalamin组开始4天而碎肢负对照组仍不正常。老鼠在负对照组显示凝结的脚趾和拖着受伤的脚(图3(一个))。这些老鼠被记录不可测的轨迹行走。另一方面,水提物组(数字3 (b)和3 (c))或mecobalamin组演示toe-spreading和清晰的脚印在走跟踪(图3 (d))。

对PFI的分析如表所示1表示返回的后肢功能发生14或挤压伤后17天五大鼠各负对照组。大鼠水提物处理经验丰富的函数的返回10到14天在八老鼠和两只老鼠受伤后,分别在低剂量组、高剂量组大鼠和四个或六个。那些对待mecobalamin也经历了函数的返回10到14天在七个老鼠,三个老鼠受伤后,分别。当集团的意思是PFI比较在每个时间间隔,PFI治疗大鼠的均值显著低于阴性对照组0天,7、10、14 (P< . 05)。之间没有显著差异在PFI在低剂量和高剂量组大鼠在任何时间研究(P> . 05)。起初打印长度较短,随着时间的推移会增加恢复正常或功能恢复发生(18]。

3.2。促进腓神经再生治疗组

Anti-neurofilament免疫组织化学是用来比较的腓神经再生四个不同的基团。微观评价轴突被三个人双盲的方式执行。每个腓神经损害分级定性分制评分(19]。正常的神经得到0分(图4(一))。轻微、中等和严重的轴突损伤收到得分为1(数字4 (b)),2(图4 (c))和3(图4 (d)),分别。从每个小组进行评估,以确定轴突神经受伤的比例大于或等于温和(= 2)水平。在正常腓神经部分不运转的肢体,轴突似乎正常形态,安排更多的人口和统一的神经丝疣状。在碎腓神经部分,轴突再生受伤的远端网站可以观察到。再生轴突生长异常,形成团或神经瘤。神经纤维不平行。两只老鼠在低剂量的水提物或mecobalamin组,三只老鼠在高剂量的水提物组和八大鼠负对照组显示中度或严重的轴突损伤后14天的挤压伤。

3.3。改善治疗组神经肌肉接点的发展

开发反伊斯兰教英国防御联盟肌肉的肌肉再生轴突的挤压伤后14天是由一个联合评估silver-cholinesterase污渍。用这种方法在终板的乙酰胆碱酯酶染色,轴突与银浸渍。图5(一个)显示了一个示例的一个正常的联盟不运转的肢体肌肉部分。反伊斯兰教英国防御联盟的电机侧肌肉位于midbelly区域的肌肉。终有椭球形状和cholinesterase-positive斑点是分布在整个侧。

发生的一个重要区别肌肉组织的再生轴突。如图5 (b)包含的阴性对照组,EDL肌肉退化和再生的轴突,和迁移的巨噬细胞清除退化髓鞘和轴突的碎片,这一过程被称为沃勒变性(1]。功能运动神经元之间的连接和EDL肌肉纤维在这个阶段还没有恢复。大鼠治疗水提取物、高密度的再生轴突reinnervating可以观察运动终板(数字5 (c)和5 (d))。这表明重建运动神经元之间的连接和EDL的肌肉纤维,导致功能恢复。mecobalamin组中,轴突束更紧凑和再生过程是更先进的比水提物组(图5 (e))。

在EDL老鼠的肌肉接受低剂量和高剂量的水提取物、19.0%和16.0的肌肉纤维是由一个以上的轴突终末,内向。另一方面,EDL老鼠的肌肉接受mecobalamin支配肌肉纤维的10.2%超过一个轴突。更高比例的polyneuronal神经支配运动终板反伊斯兰教英国防御联盟中发现了老鼠的肌肉比mecobalamin处理(处理水提取P< . 05)。然而,这一现象并没有观察到负对照组沃勒变性仍在发生。

4所示。讨论

周围神经可能会受到各种各样的挤压伤的情况下,包括机动车事故、骨折、脱位和地震等自然灾害20.]。周围神经损伤后,轴突和髓鞘远端损伤退化。退行性产品的合作行动消除去神经的雪旺细胞和巨噬细胞浸润。沃勒变性服务创建一个微环境支持轴突再生。远端神经的雪旺细胞内endoneurial管反分化走向non-myelinating增生性表型过表达生长因子,细胞粘附分子和细胞外基质,促进再生(1]。

与神经横断损伤,神经挤压伤引起更少的严重性,因为它将原始神经纤维周围的雪旺细胞的基底膜完整,因此,尽管破坏轴突气缸,使雪旺细胞提供路径引导再生轴突(21]。虽然碎周围神经解剖保持连续性,自发再生,reinnervate目标组织,时间越长对碎神经reinnervate目标组织,越大的机会永久的目标组织的去神经萎缩。因此,加速神经再生获得满意的功能是至关重要的结果(22]。

相关功能恶化挤压伤后不仅粉碎本身的影响,还包括其他的重要部件,如缺血肢体。在周围神经挤压伤模型所做的研究显示,更好的功能恢复疗法针对缺血再灌注损伤时通过使用抗氧化剂,脂质过氧化反应抑制剂和抗炎剂(23]。有鉴于此,本研究评估的神经再生活动h . erinaceus具有抗氧化活性的另一种草药药物治疗周围神经修复(24]。

评估的功能恢复PFI分数与组织学检查几个再生神经和目标EDL肌肉透露,水提物促进周围神经再生。也指出,水提物的神经保护作用是接近mecobalamin所引起的。

后肢功能,在大鼠坐骨神经及其分支机构可以定量,可靠和容易评估步态分析通过脚打印(18]。周围神经损伤后临床相关的结果最终器官的功能恢复或肌肉神经再生的最终测试。如果恢复之间的身体接触运动神经元及其肌肉,函数通常是恢复(25]。卡尔顿和Goldberg引入PFI (26),后来被贝恩et al。18]。PFI方法适用于评价的完整的腓神经病变产生又短又窄的脚印由于缺少背屈的踝关节和脚趾的延伸25]。虽然每个小组展示了改进对象期间,完成功能恢复才达到负对照组损伤后14天。水提物或mecobalamin提供了一个快捷功能恢复比阴性对照组早4 - 7天。尽管如此,PFI值在所有治疗组的血压无显著差异,表明不同剂量的水提物对功能恢复可能没有显著影响。

许多神经丝immunopositive在腓神经轴突被认为部分的肢体的水提物和mecobalamin组。神经丝的密度immunopositive地区负对照组是大大降低了。事实上,几乎所有的老鼠在这组持续至少中度损伤轴突丧失后14天。

在哺乳动物个体发生的早期阶段,肌肉纤维控制由多个轴突(27]。Polyneuronal神经支配然后被mononeuronal神经支配的肌肉纤维的发展由机械活动(28),因此在大鼠大多数肌肉纤维联系的只有一个轴突的第二周的生活(17]。Polyneuronal神经支配是罕见的在正常骨骼肌。然而,它影响了大量的肌肉纤维和运动神经元在神经部分和再生后的第一个阶段29日]。随着大鼠复苏运动机能,撤军polyneuron将导致mononeuronal神经支配。如果我们把polyneuronal神经支配的百分比来衡量运动终板的成熟,它可以得出结论,腓神经粉碎后成熟的速度加速mecobalamin组相比水提物组。功能连接切断了轴突再生,促进适当的目标神经移植术EDL肌肉加速在治疗组。

天然产物一直在传统上被认为是补救措施由于流行的信念,他们呈现轻微不良反应(30.]。为药用蘑菇一直准备热水提取在中药。用热水提取是酿造茶或煎煮。这个方法是用来准备提取常用的蘑菇包括香菇、灰树花、冬虫夏草、革盖菌属和灵芝。热水提取已被用于所有的知名产品,如香菇多糖和LEM香菇、灰树花D分数和MaitakeGold 404年从灰树花,PSP革盖菌属多色的(31日]。

水提物是由多糖包括酸性杂聚糖ß- - - - - -D葡聚糖和glucuronoxylomannan。多糖执行许多功能在不同的细胞类型如neuritogenesis、周围神经再生和肌肉再生坐骨神经损伤后(32]。此外,从毒理学的角度来看,水更安全比有机溶剂如丙酮、氯仿和甲醇。

糖和多糖含量马来西亚种植h . erinaceus量化了Choong et al。33]。的高效液相色谱法(HPLC)分析热水粗提取液显示阿拉伯糖的主要组件和次要成分葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和脱氧核糖。免费树胶醛醣热水粗提物的存在并没有先前报道。他们的发现表明,当地种植的子实体h . erinaceus不含有多糖成分主要是阿拉伯糖和葡萄糖所来自中国的一些研究[34]。

10的剂量?毫升或20毫升?公斤¹体重每天都是基于重复试验或历史实践。在韩国进行的一项研究中,单、Erinacol反复给药毒性研究的水提取物h . erinaceus培养与艾iwayomogi评估根据“药物毒性试验指南和相关材料”的韩国食品与药品管理局使用Sprague-Dawley老鼠[35]。Erinacol限制剂量的5000 ?毫克公斤提取¹既不引起死亡,临床症状和验尸发现,也不影响身体体重增加和器官重量。10的产量?沸腾后10 g的新鲜子实体?约10毫升蒸馏水?毫升的水提物。十克的新鲜子实体相当于1 ?克的干粉末。因此10或20吗?毫升公斤¹每天体重堪比1000年或2000年?毫克的干粉末每天每公斤体重。在目前的研究中,水提物的剂量没有显示任何直接危险的迹象,表现出在老鼠没有毒性。

对其作用机理,改进后的再生水提物治疗后观察可能要么直接神经营养等因素有关的促销活动或nerve-derived神经营养因子的影响。神经营养因子已经提出或regeneration-promoting因素中起着关键作用的结果,在周围神经系统变性和再生过程,以确保适当的目标组织的神经支配和改善remyelination [36]。它也可能影响血小板的粘附和巨噬细胞等细胞因子的释放肿瘤坏死因子(TNF),导致渗透率降低和组织水肿和更好的毛细血管灌注(图6)。

考虑到天然产物,传统中草药的修复效果,牛膝bidentata布卢姆根水提物在碎兔腓总神经的再生研究了丁et al。37)和碎鼠坐骨神经元et al。22)使用电生理评估和组织学研究。根提取物能促进周围神经再生剂量依赖性的方式。地龙和基数Hedysari水提取物已被证明对运动功能恢复产生积极影响和电导率恢复坐骨神经后夹紧伤害增加再生有髓神经纤维的总数在成年大鼠(38,39]。地龙是寒冷和略咸中药来源于蚯蚓的腹部,同时基数Hedysari的干燥根Hedysarum polybotrysHand.-Mazz。江等人也(40]表明,低聚糖,壳聚糖的生物降解产品,促进周围神经再生与所需的功能恢复大鼠坐骨神经挤压伤模型。

从这项研究中,我们已经表明,水提物h . erinaceus新鲜的子实体,在无毒剂量的10或20 ?毫升?公斤¹每天体重增加周围神经损伤后的恢复速度。然而,治疗不同剂量的水提物在复苏没有统计显著差异评估在行为实验和组织学检查。因此,低剂量的10毫升?公斤¹体重每天就足够了在促进周围神经损伤后功能恢复。病人接受h . erinaceus可能会经历一个更加迅速改善生活质量和更完整的损伤后功能恢复。此外,通过mecobalamin治疗神经损伤引起的副作用,如胃肠道和皮肤问题(41]。模型今后的研究将集中在直接影响的作用机制h . erinaceus在周围神经再生和精炼策略来提高再生。

资金

基础研究资助计划FP023/2008C马来亚大学和研究生科研补助金PS150/2008B;科学、技术和创新,马来西亚对科学基金12-02-03-2050。

确认

技术援助的夫人Robiah Bakar,张夫人可能兴,解剖学系和动物屋的员工我将非常感谢。作者也感激黄泉安京Kiau先生和夫人程Poh Guat维塔Agrotech的连续供应的新鲜h . erinaceus蘑菇。