文摘
严重联合免疫缺陷(SCID)组成的异质群体遗传免疫失调与深刻的细胞和体液免疫缺陷。SCID是最严重的PID和构成儿科急诊。受影响的儿童是很容易被细菌、病毒、真菌和机会性感染危及生命的缺乏造血干细胞移植。我们报告两例SCID。第一个病例是一个女孩出生时患有SCID基于她的家庭历史和淋巴细胞亚群类型。第二个病例是一个四个月大男孩的复发机会性感染,BCGitis,未能茁壮成长,免疫学检查证实SCID表型。两种情况中的基因研究显示小说RAG2基因的突变,c。826 g > A (p.Gly276Ser),在一个纯合状态。这部小说在RAG2基因突变确定在我们的研究可能有助于SCID的早期诊断。
1。介绍
严重联合免疫缺陷(scid)是一组遗传性疾病负责严重障碍导致的免疫系统T细胞和B细胞的缺失或功能障碍源于胸腺和骨髓,从而影响细胞和体液适应性免疫(1]。SCID的发病率和患病率在世界不同地区和不同报告更高的国家高速率的血缘关系。在沙特阿拉伯,报道是2906活产2),(20×)发生率高于美国国家统计局报告的项目(3]。这是最严重的障碍主要免疫缺陷疾病威胁着儿童的生命。实际上,分子缺陷被认为是导致SCID [174]。根据种族,据估计,RAG1/2突变占近50%的患者T-B-NK + SCID [5]。Recombination-activating基因(RAG1/2)导致VDJ(变量、多样性、和加入)重组导致生成不同的抗原受体(6]。零突变导致重度联合免疫缺陷(SCID), B和T细胞的缺失和保留自然杀伤(NK)细胞(T-B-NK +) (7]。
相比之下,hypomorphic抹布突变允许残留突变蛋白的表达和功能,使部分T和B淋巴细胞的发展,可能会导致一系列的表型与著名的免疫失调,如Omenn综合症患者(观察8],漏水的SCID优势的t细胞受体(TCR)γδ+T细胞(9,10),结合免疫缺陷和肉芽肿性疾病和/或自身免疫(11]。
2。材料和方法
2.1。血液样本集合
全血是EDTA-precoated试管收集。
2.2。流式细胞术
从全血血红细胞被使用一个红细胞裂解缓冲。细胞被沾染了fluorochrome-conjugated反CD3, CD4, CD8, CD19, CD16、CD56抗体。收集细胞FACSCanto II流式细胞分析仪(FACSCalibur BD生物科学,圣何塞,CA)与FACSDiva和分析软件。
2.3。基因研究
从300年基因组DNA分离µL使用麦克斯韦16血外周血DNA净化设备(WI Promega,麦迪逊,美国)根据制造商的协议。病人的父母给他们书面和基因研究的知情同意。
10 ng的DNA被用来放大编码区使用离子AmpliSeq™遗传疾病面板(离子激流,热费希尔科学)根据制造商的协议。
样品浓度减少到最后∼100点。乳液聚合酶链反应进行了使用离子的PGM优质的OT2工具包(离子激流™,热费希尔科学)根据制造商的协议。放大和恢复后,离子球质量控制工具(离子激流™,热Fisher)被用来评估样本的质量根据制造商的协议。接下来,浓缩被选择性地完成绑定包含放大的isp库碎片streptavidin-coated磁珠,删除空的isp通过洗涤步骤,变性链允许积极的收集模板示例isp。
测序引物和聚合酶添加到最后浓缩领域isp之前加载到一个离子318芯片根据离子的PGM优质的测序工具包(离子激流™,热费希尔科学)。
个人基因组进行测序的材料(离子激流™,热费希尔科学)。序列变异被认为是真实的,测序覆盖250年作为最低要求。离子AmpliSeq以下PID基因遗传疾病小组目标:为x连锁scid IL2RG RAG1为重度联合免疫缺陷症(RAG2重度联合免疫缺陷症,对1型agammaglobulinemia x连锁,杀人案是Wiskott-Aldrich综合症,和涂画或自身免疫性polyendocrine综合症。
2.4。数据分析
序列数据处理使用洪流套件软件v 5.0.4(离子激流™,热费希尔科学)对齐读取基因组参考(HG19)和生成运行指标,包括芯片装载效率和总阅读数量和质量。数据分析后,单核苷酸变异注释,插入,删除和拼接网站改变是由离子记者服务器系统(技术)和聪明才智变异分析(试剂盒)。
2.5。桑格测序
感兴趣的变体Sanger测序证实了放大PCR产品。
3所示。结果
3.1。临床表现
3.1.1。案例1
病人是一个新生的女性从三度血缘婚姻(图1)。她的家族历史的兄弟姐妹的死亡。第一个哥哥反复呼吸道感染与慢性腹泻和去世,享年4个月没有任何诊断。第二个弟弟被送进重症监护室严重呼吸道感染在6个月的年龄和在入院3天死亡。实验室检查显示淋巴细胞减少,SCID被怀疑。考虑到她的家族历史,我们的病人没有接种疫苗和免疫检查20天(表时完成的1)。
因此,SCID T-B-NK +的诊断成立。她穿上功效作为预防和免疫球蛋白替代每三周。她是免费的从感染到一个半个月的年龄,当她发达口腔鹅口疮,氟康唑治疗。在2个月的年龄,她开发了一个腋窝淋巴腺炎治疗成功与头孢他啶和amikacine,鉴于十天。在三个月的年龄,婴儿接受成功的同一性造血干细胞移植具有良好的结果。四个月具有重要,有一个良好的免疫球蛋白生产100%稳定的淋巴嵌合。在最后随访,病人是5岁,无感染没有GVHD的迹象,和完全接种疫苗。
3.1.2。案例2
病人是一个四个月大的男孩从一级血缘婚姻(图1)。他提出了两个月的年龄慢性腹泻、反复呼吸道感染、口腔鹅口疮,局部区域BCGitis,未能茁壮成长。实验室检查显示出深刻的淋巴细胞减少,胸腺缺席影子在胸部x光片。SCID被怀疑的诊断和免疫学检查(表完成2)。
因此,SCID的诊断成立。他公开将BCGitis (rifampicine isonhiazid,乙胺丁醇)和抗真菌(氟康唑)。他还收到功效作为预防和免疫球蛋白替代每三周。每个感染期积极治疗。由于缺乏造血干细胞移植,他死的年龄1年半。
3.2。基因研究
完整的突变检测RAG2使用个人基因组基因测序材料和离子记者系统和智慧软件然后直接证实了目标为每个病人Sanger测序。
这两个病人RAG2基因的一种变体,c。826 g > A (p.Gly276Ser),在一个纯合状态。此外,对于第一种情况,家庭隔离实现和表现出相同的RAG2基因变体,c。826 g > A (p.Gly276Ser),在父母双方一个杂合的状态。它座落在一个高度保守的核苷酸和氨基酸的位置,用小物理化学交换了氨基酸之间的差异(特v.2.7.1)。软件分析:筛选、polyphen-2和格兰瑟姆表示,这种变体是极具破坏力的得分是0.0,1.0,和56.0,分别;这也是建立损害软件PopViz(图2),加7−得分和CADD得分为26.6。这个变体c。826G > A (p.Gly276Ser) is considered a new mutation that could cause SCID. To date, this variant is not described in the Exome Aggregation Consortium, Exome Sequencing Project, or the 1000 Genomes Browser. To the best of our knowledge, this is the first study, which has revealed such a variant. It is classified as a variant of uncertain significance (class 3) according to the recommendations of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG).
4所示。讨论
RAG1和RAG2蛋白质构成重组酶复杂,它开始VDJ体细胞裂开双链DNA重组的特殊序列,称为复合信号序列(rss),侧翼变量,多样性,加入基因外显子编码的基因免疫球蛋白(Ig)和t细胞受体。这个躯体重组生成一个不同的B细胞和T细胞(14,15]。RAG1/2基因突变导致损失或减少V (D) J重组,因此B - t细胞发展的封锁,这称为重度联合免疫缺陷(SCID)。我们两个患者临床SCID表型表达了一个典型的机会性感染,尤其是在第二种情况下,非常有症状。两个病人有着深远的淋巴细胞减少的数量非常低的CD3 T细胞。软件分析(筛选、polyphen-2格兰瑟姆和PopViz)这部小说表明,突变c。在破布2 826 g > A基因可能是有害的,然后SCID负责。这也是支持的家庭隔离在杂合的状态表现出相同的变异。
5。结论
在本文中,我们报告一个新发现的突变RAG2基因外显子2的c。826 g >一分之一纯合状态。这些结果表明,AmpliSeq库,PGM和离子记者切断系统——基于门店的方法非常有效,快速和廉价。这种方法可能会导致一个更好的病人亲属在风险的管理和遗传咨询。
的利益冲突
作者宣称他们没有商业关系或提交相关的潜在的利益冲突。
作者的贡献
即Benhsaien完成样品的分析、解读数据和写的手稿。f . Ailal负责病人的管理和数据解释。j . Elbakkouri进行免疫分析。k . Elazhary解释数据。a . Badou进行研究设计,数据解释和手稿的评价。a . a . Bousfiha构思研究评估了手稿,手稿和编辑。