通过蛋白质分子建模鉴定ABCD1基因致病变异

摘要

背景。ATP结合盒，亚家族D，构件1（ABCD1）蛋白是过氧异相体半转运蛋白，其允许非常长的链脂肪酸（VLCFA）降解。致病变异ABCD1.导致VLCFA在各种组织和身体流体中累积，导致称为X型肾上腺胁迫张力（X-ALD）的疾病。这种疾病最常由肾上腺皮质不足和高VLCFA浓度标记，并且根据表型，具有不同程度的神经培养。例如，X-Ald的亚艾迪生形式没有神经撞击，而X-Ald的脑形式通常会导致严重的感官损失，运动功能障碍，认知下降和死亡。方法。一种新发现的疑似致病性变异ABCD1.使用我们的蛋白质信息学平台(PIP)进行分析。根据基因检测数据完成个性化的蛋白水平分子研究，补充分析和临床研究。结果。新发成人肾上腺髓神经病变1例ABCD1.呈现了变体。讨论了独特的ABCD1蛋白，并将证据的案例与AMN的现有报告进行了比较。结论。来自多个来源的数据融合以一种综合的方法进行结合，从而丰富了对患者疾病和预后的评估。对该变异进行分子建模，以更好地表征其临床意义并确认其致病性。

1.介绍

atp结合盒，亚家族D，成员1 (ABCD1)蛋白是atp结合盒转运超家族的一部分，它由跨膜蛋白组成，负责在细胞或细胞内结构之间传递脂质、代谢物和其他分子。它被编码为ABCD1.该基因位于Xq28 [OMIM#300371]。ABCD1是一种过氧化物酶体半转运体，通过结合ATP将超长链脂肪酸(VLCFA)导入过氧化物酶体。功能失调性ABCD1无法将VLCFA移动到过氧化物酶体中降解，导致VLCFA在体液和组织中积累[1］.这种异常的VLCFA水平用作X连接腺型育种（X-ALD）的特征生物标志物，最常见的过氧异甲酸异甲型病症[2］.X-ALD是一种遗传条件，主要与脱髓鞘，神经变性和肾上腺皮质不足相关[3.］.超过800个变种已被报告ABCD1.基因[ALD突变数据库]。尽管如此，尚未观察到明显的基因型-表型相关性[4.］.

半合子的男性通常表现出最显著的症状，而杂合子的女性往往在晚年出现较小程度的残疾[2］.三种典型的表型是仅Addison病、肾上腺髓神经病变(AMN)和脑ALD。仅患有Addison病的个体通常在2至7岁之间表现为肾上腺皮质功能不全。神经退行性变最初并不出现，但通常会随着个体年龄的增长而发展[5.］.AMN通常在生命的第三到第四个十年发病，主要影响脊髓[3.］.临床表现常为进行性腿部僵硬和无力。大约2/3的AMN患者存在肾上腺功能不全，其中约一半患者受到大脑变化的影响[3.］.脑ALD是最严重的表型，其中脑脱髓鞘导致听力，视觉，运动功能和认知的快速下降[5.］.最常见于儿童或青少年，这种X-ALD变异常导致症状出现2-4年内死亡[2］.

这份报告详细描述了一个30多岁被诊断为AMN的先诊者的病史。分子分析ABCD1.基因确定了该个体内不确定意义的变体。有趣的是，这种变体已经报道了ALD突变数据库中的致病性，但有关临床案件的信息未公布。我们的临床案件包括在内，以更好地支持这一点的致病性ABCD1.变体。利用蛋白质信息学平台(PIP)进行全面的分子建模，进一步表征该变异的意义，并阐明先证者的诊断。

2.案例研究(临床描述)

先证者为一名31岁男性，因神经系统状况恶化而就诊。这种情况的症状首次出现在2年前，先证者开始越来越频繁地绊倒。他随后会经历全身肌肉无力和僵硬，并伴有进一步的步态障碍。为了解决这个问题，先证者在过去的7个月里一直使用滚动助行器辅助移动。他还出现了尿失禁。此外，他还报告了脑雾、记忆丧失、注意力缺陷、焦虑和疲劳。因此，基本的脑力工作需要更长的时间才能完成。根据先证者的说法，饮酒加剧了这些缺陷。最后，先证者自发病以来减了20磅，尽管大家都在努力，但还是无法恢复体重。这种体重减轻的部分原因是恶心和呕吐的症状，这在早上最常见。

在体检期间，证书无法在不使用手的情况下从坐姿升起。鉴定了轻度分子扰动。视觉固定测试显示不频繁的方波混蛋。平滑的追求是扫视态度，他展示了慢性，全面横向和水平的横向。拉伸反射在上肢是病理上的。该证书还在下肢中具有病理上快速的薄膜脉冲反射，包括脚踝处的持续克隆。存在适度受损的伟大脚趾的预感。在下肢中看到温和的上部运动神经元分布弱点，含有髂烃。脚跟到胫骨测试揭示了Dyssynergia。在偷偷上，证据看着他的脚并用一步的步伐搬到了。 His knees hyperextended, he tended to toe walk, and occasionally he slid his feet. Romberg sign was present. While standing, tremulous movements were present in his legs—predominantly in the quadriceps. The proband turned 360 degrees over 3 trials, which required 9 to 15 steps per turn. His postural reflexes were abnormal, and the “Pull” test was −3.

脑部MRI显示正常，颈椎MRI显示轻度弥漫性脊髓萎缩。没有证据表明亚急性联合变性或其他获得性脊髓疾病(图)1)．他被治疗莱姆病，因为他的莱姆IgM滴度为阳性，​​但没有记录显着的改善。他的脑脊髓液被描述为细胞。艾滋病毒，HTLV1，丙型肝炎，乙型肝炎和缩细胞病毒评价为阴性。无法建立类似症状的家庭历史，因为证书对其医疗历史的了解是有限的（图2)．

先证者的过氧化物酶体脂肪酸谱是在先前的测试和成像后得到的。C26: 0、C24/C22和C26/C22浓度异常，提示x连锁肾上腺脊髓神经病变的半合并症。促肾上腺皮质激素528 pg/mL (RR: 7.2-63)。测序和缺失/重复分析ABCD1.然后完成基因。证书是对不确定意义的变种的嗜血ABCD1., c.1599G > T (p.Lys533Asn)。该变异在ExAC在线数据库中不存在，但在ALD突变数据库中被列为致病。有两种相似的变异，c.1596A>G (p.l is533glu)和c.1598A>G (p.l is533arg)，以前也被报道为具有临床意义[6.那7.］.

3.方法

3．1.结构建模

人类atp结合盒亚家族D成员1 (ABCD1)的序列很可能是一种转运蛋白，它有一个核苷酸结合区域，有一个折叠，可以作为atp结合亚基与atp酶活性。众所周知，正确的二聚反应是形成活性转运体所必需的。ABCD1是ALD亚家族的成员，参与过氧化物酶体脂肪酸进入细胞器。这些过氧化物酶体ABC转运体是“半转运体”，这意味着它们需要一个伴侣半转运体分子——其功能形式总是同型二聚体或异型二聚体。ABCD1被认为是超长链脂肪酸过氧化物酶体转运或分解代谢的关键。已知ABCD1与PEX19相互作用，并由ABCD1.NCBI Reference Accession Sequence: NP_000024: version NP_000024.2，为氨基酸序列编码;并用于计算机辅助建模。对突变体进行蒙特卡罗模拟，允许全长745个氨基酸的局部区域变化。

采用YASARA SSP/PSSM方法建立了蒙特卡罗的x射线精细化[8.-13.］.在YASARA中使用基于知识的势将结构放松为YASARA/Amber力场。用基于知识的势调整侧链和转子，用显式溶剂模拟退火，并使用YASARA的细化协议进行小型平衡模拟[14.］.整个全长结构被建模，填补了x射线的任何缝隙或未解决的部分。

使用Schrodinger的LC-Mod Monte Carlo基模块或NamD2协议完成完成最终模型的细化。这些改进始于yasara生成的初始细化和变体[8.-10.那12.］.重叠区域的叠加和后续的细化得到了ABCD1的完整模型。在r -相关介质下，采用PR共轭梯度对最终结构进行了能量优化。

全长野生型模型（WT）和745个氨基酸（12,221个原子）的所有745个氨基酸（12,201原子）检查原子一致性，用于变体，验证链名，Dihedrals，角度，扭转，非官方的正确性，静电，原子键入和参数。预测二聚体型号，由24,402个原子组成，包括辅因子和离子。每个模型都出口到以下格式：Maestro（MAE）和Yasara（PDB）。模型操作是用Maestro（Macromodel，V98，Schrodinger，LLC，纽约，NY，2010）或视觉分子动力学（VMD）进行了模型操纵[15.］.根据突变位点的长度和C-term距离，重点分析了包含前350个氨基酸的n端区域。

在每个模型上完成了Monte Carlo Dynamics搜索（混合MC或通过增强MDS采样），用于构造采样的每个模型，使用先前在文献中描述的方法[16.-19.］.简单地说，每个ABCD1变异系统使用最陡下降或共轭梯度PR的松弛约束最小化，然后允许进行MC搜索标准，如文献[16.-19.］.在这种情况下，MC的主要目的是检查突变附近区域可能发生的任何构象变异，以及可能对ABCD1与DNA结合或加工的影响。

结果

4．1.结构研究

对于WT与p.K533E的变体，我们从ΔG每氨基酸的能量计算中发现物体的稳定性相对保持不变，因此WT的物体稳定性为114.67千卡/mol^*一个²．变种p.K533E使自由能净增加2.321千卡/aa^*摩尔^*一个²，这可能对当地区域稳定化[16.-18.那20.-23.］.该物体的稳定性是积极的，表明一些动态变化可能与分子模拟构象取样。因此，我们检查了局部留数，并确定了静电计算可能有助于解释函数的变化。给出了完整结构的分子模型及其变体形式(图3.(a)使用我们已建立的最先进的方法[16.-20.那23.-30.］.二聚体模型对功能至关重要，显示了突变位点被变异突变破坏的重要相互作用。

在变体部位（P.K533E）附近的12埃截止区内的局部残留物包括来自两个单体的残基。含有变体（单体1，灰色碳）的单体具有以下附近残留物，具有533相互作用：E471，Q472，I474，I475，E499，Y532，P534，P535和K624（图3.(b))。我们分析了这种变异结构(p.l es533glu)，并从正的赖氨酸(+)电荷翻转到负的谷氨酸(-)，这对邻近的带电残基(上)具有相当大的破坏，表明了更直接的局部环境破坏。特别地，K624、E499和Y532残基被放置在不同的相互作用中(图)3.(b))。当地的ΔG每个氨基酸增加了一个净正值，对应于口袋中不稳定的稳定性，需要更长的动力学来确定总体效果，但可以预期是不稳定的。K533E残基与Q472、I474、I475和E499有有趣的相互作用。K533E位于一个螺旋-螺旋区域，其带电侧链向外定位于相反的带电物种;也有一些螺旋-螺旋相互作用与相邻的螺旋(图3.（乐队3.(c))。相同的残留物涉及该变体，但是该位置改变了包括P534，P535和K624的几个残基（图3.(c))。由于局部结构稳定性的动态行为的变化，这种互动可以解释因功能的变化（图3.(c))。为了进一步分析，我们完成了静电计算(图)4.)．特别地，K624、E499和Y532残基被放置在不同的相互作用中(图)3.(b))。当地的ΔG每个氨基酸增加了一个净正值，对应于口袋中不稳定的稳定性，需要更长的动力学来确定总体效果，但可以预期是不稳定的。

4．2．二聚体形成的影响

使用Poisson-Boltzmann计算来完成映射静电方法，用于在整个745氨基酸结构上进行溶剂化。对两者+ 3 kt / e截止的静电分布对变化的影响非常明显。WT颗粒（所有745AA）显示了K533周围的不同电荷分布，其显示出少量带负电的区域和由于上述螺旋中的富疏水残留物而具有大的中性袋。苏氨酸突变似乎改变了电荷的分布，并将负荷的位置放置在彼此的负面电荷的位置，同时增加中性带电区域的大小（图4.（a）和4.(b))。p.K533E局部区域带电，以匹配阳性赖氨酸残基与邻近的谷氨酸残基(6Å内)(图4.(b))。相反，K533残基具有正电荷，它们受到6 Å内的E471、Q472、I474、I475、E499、Y532、P534、P535和K624残基的影响(图)4.（一种）） [16.-18.那20.-23.］.变种p.K533E似乎对二聚体本身没有任何影响(图3.和4.），由于变型远离单体之间的界面。然而，在局部附近存在显着的破坏，其中赖氨酸本地插入口袋中，其附近的残留物具有相反地充电和接合H键和盐桥相互作用，其损失来自谷氨酸取代的负电荷（数字3.)．

5.讨论

对于AMN患者，目前的治疗选择有限。然而，最近对小鼠模型的研究提出了一个潜在的解决方案。在X-ALD患者中，VLCFAs的积聚伴随着自由基氧浓度的增加。这些自由基导致疾病进展，破坏组织并最终导致神经系统症状的出现。带有X-ALD类似物的小鼠已被成功地用抗氧化剂混合物治疗，使自由基水平得到控制，并阻止了这种致病过程[31］.如果以后的试验继续证明有希望，我们的先验者和其他AMN患者有可能有一天以类似的方式接受治疗。

尽管我们的先证者在ABCD1.，他的病例与典型的AMN表型没有显著差异。症状开始于他的近30岁，正好符合20至40岁的预期年龄范围。AMN通常会累及脊髓，先证者的核磁共振成像证实了这一点。他的腿无力和步态异常是这种疾病的特征，尿失禁也是。呕吐和恶心与肾上腺功能不全有关，而先证者的语言和精神异常可能与大脑变化有关[3.］.尽管如此，必须说病人有同样的症状ABCD1.先证者表达的变异可能会表现出不同的症状致病性变异在ABCD1.很少会导致可预测的表型——即使是家庭成员拥有相同的表型[4.］.

从统计力学计算中得到的蛋白质信息学应用于变体与野生型的分子建模，为我们清楚地指明了正常蛋白质行为在分子水平上的功能障碍，这将影响其功能。例如，我们发现变体p.K533E导致自由能净增加2.321千卡/aa摩尔一个²，这使得当地地区在剩余K533的12Å范围内不稳定。由于通过主链残基和二级结构相互作用的变化(h键网络没有显示)缓解了局部结构变化，使得相关运动在整个结构中传播，进一步阻碍了二聚体的正确形成。

由于我们的概念的罕见ABCD1.变体，商业实验室无法自信地称列变异致病性。此外，后勤挑战和证据的小家庭规模使家庭隔离分析不切实际。因此，这个过程无法完成，以帮助我们更好地了解他变体的重要性。谢天谢地，分子建模为我们提供了另一个机会。蛋白质分子建模支持怀疑，这种变体会在临床上影响蛋白质功能。毫无疑问地毫无疑问，这一变体不会被赋予致病致病性，因为该结构的严重改变是通过PIP分析强烈支持的。

6.结论

总之，我们报告了一个罕见变种的证据ABCD1., c.1599G > T (p.Lys533Asn)。由于缺乏这一变体的信息，基因检测公司无法将他的变体归类为致病性，但分子电荷似乎表明，蛋白质的这一区域从平衡状态明显受到干扰(图)3.(b))。蛋白质建模的利用还提供了用于纳入证据的较大临床图的信息。另外，在ALD突变数据库中列出了该变体致病性的一个实例。合并，这证据允许自信地诊断AMN。我们的证书具有典型的AMN症状，但纯粹的变异性ABCD1.可能导致其他具有此变体的其他人的X-ALD呈现。

缩写

ABCD1.：	ATP结合盒，亚家族D，成员1（基因）
VLCFA:	长链脂肪酸
X-ALD:	x连锁罹
飞行员:	肾上腺素病变。

数据可用性

在稿件中详细说明数据集和材料。

同意

所有程序，均符合人类实验（机构和国家）和1975年赫尔辛基宣言的负责任委员会的道德标准，如2000年（5）所修订的。获取知情同意，从所有患者那里被列入研究中获得。

利益冲突

所有作者都声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

上面的所有作者对工作的概念或设计做出了实质性贡献;或收购，分析或解释工作的数据和起草工作或批判性地修订重要的知识同意，并获得最终批准待发表的版本，并同意对确保工作的所有方面负责负责与工作的任何部分的准确性或完整性有关的问题适当调查和解决。

资金

资金由梅奥诊所的个体化医学中心提供，该中心为完成这项研究提供了资金。

承认

TC感谢杰克逊维尔梅奥诊所个体化医学中心的研究支持。

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