文摘
编程核糖体移码(脉冲)作为一种内在的转化调控机制受雇于一些病毒控制结构和酶蛋白之间的比率。大多数病毒mrna,使用脉冲重复频率适应一个屏蔽基因刺激−1脉冲重复频率。之间的关系的热力学稳定性和移码效率基因没有被完全理解。最近,单分子光谱显示,−1的频率编码脉冲与扰乱基因所需的解除武装,解除工作的,有些消散不可逆由于基因的扭转约束。单分子技术的补充,计算模型提供了洞察核糖体的全球运动,其结构转换在原子移码尚未阐明细节。综上所述,最新进展在生物物理工具可以帮助开发抗病毒治疗中无处不在的−1编码脉冲机制为目标的病毒。
1。介绍编程−1核糖体移码的病毒
信使rna的基因信息解码的核糖体在单位的三核苷酸,密码子,被翻译成相应的氨基酸。因此,有三个可能的核苷酸阅读框架对于一个给定的长度信息。实际的开放阅读框始于8月核苷酸三联体和延伸后每三个一组被正确读取核糖体,确保移码< 3×10的错误率−5每一个密码子(1,2]。然而,编程核糖体移码(脉冲)是必不可少的许多病毒从重叠子调节蛋白表达水平。在人类免疫缺陷病毒1型(hiv - 1)−1的频率编码脉冲发生5到10%的结呕吐和波尔基因,导致20:1到10:1克分子比结构(Gag)的酶蛋白(Gag pol多元蛋白(图)1(一))[3- - - - - -6]。
(一)
(b)
病毒−1编码脉冲站点包含三个特点RNA元素[7- - - - - -12]。(i)的网站的形式X-XXY-YYZ(破折号分开在坐标系三胞胎),在XXX可以是任何homopolymeric序列,YYY可以AAA或下面,和Z是一个U或c之间的滑序列允许有效base-pairings ribosome-bound转运rna和mRNA即使移码XXX-YYY(−1帧)。(2)5 - 10-nucleotide-long滑站点之间的间隔和下游RNA结构。(3)下游基因或茎环结构(也称为发夹)结构普遍认为作为“路障”摊位核糖体,随后促进核糖体向后滑动。
大多数逆转录病毒适应基因作为−1 PRF-stimulating元素[13- - - - - -15]。典型的发夹——(H)基因型的特点是碱基配对发夹环和单链区域外循环(图1 (b))[13,16];也就是说,如图1 (b)茎2是由碱基配对循环1和循环的远端2。这让偏远地区的RNA轮廓在一起,产生了更复杂的三级相互作用,如base-stacking和三碱基配对(17,18]。因此,基因通常更加稳定和有效促进−1脉冲重复频率,茎环结构同行相比具有相同成分的碱基对(14,17,19]。值得注意的是,仍有hiv - 1情况下,可以利用简单的茎环结构有效地促进−1脉冲重复频率(19,20.]。
微妙的变化在−1编码脉冲元素已报告显著影响病毒生产(21- - - - - -24]。对hiv - 1,尽管RNA病毒的本质上的高突变率,Biswas等人发现,他们获得的1000个hiv - 1的序列,所有UUUUUUA滑七聚物是完全相同的。用这个网站和另一个同样有效滑序列,即UUUAAAA,可以减少病毒效价1000倍以上4,25]。最近,膜联蛋白A2 (ANXA2),一个真核多功能蛋白质,可以绑定赝结禽冠状病毒传染性支气管炎病毒(IBV),减少病毒−1脉冲重复频率效率[26]。因此,作者怀疑ANXA2可能与其他病毒RNA基因更普遍的交互,从而作为一种抗病毒调节器在真核细胞26]。
尽管−1脉冲重复频率的传染性病毒无处不在,和它的承诺作用作为一种抗病毒的目标(3,4,6,27),精确的分子机制仍然是难以捉摸的。本文旨在解决生物物理工具的最新发展,特别是单分子技术和计算模型,可以帮助阐明−1脉冲重复频率的机械化学的基础。
2。单分子技术揭示机械化学的细节Pseudoknot-Stimulated−1脉冲重复频率
自从mRNA在核糖体进入隧道的直径太小,容纳的尺寸双链RNA, RNA二级结构的任何之前必须中断阅读的核糖体(28,29日]。会因此认为,热力学稳定的下游信使rna结构应该与−1脉冲重复频率效率,已经观察到的信使rna链包含茎环结构刺激结构(19,30.]。有趣的是,自由能变化折叠和展开基因从紫外线光融化资料并不相关的倾向移码(13,18,31日- - - - - -34]。这种差异可能是由于这样的事实,全球热融化发生在任何一个碱基对,但核糖体只能放松双顺序从信使rna 5′, 3′端(14]。由于基因的独特拓扑(图1 (b)),下游干2导致阀杆成为超螺旋1通过碱基配对核糖体试图解除的5′端茎1。因此,遏制2之前必须同时中断允许核糖体易位整个茎1,提供进一步扭转约束核糖体(31日,35,36]。相比之下,一个简单的茎环结构解除期间可以自由旋转。因此,除了三级相互作用,限制转动自由解释了优越的机械稳定性和−1脉冲重复频率效率的基因,而大力等效茎环结构(31日,35]。总解除工作施加的核糖体因此会比只是融化所需基因,一部分工作消散不可逆(31日]。然后,它可以推断出,−1脉冲重复频率效率应该关联更“拉”所需的机械力RNA基因,类似于连续由核糖体RNA解除(7,14,31日,32]。这样的机械拉RNA基因很容易由光学镊子。
光学陷阱是由聚焦激光束期刊的附近一个透明粒子的入射光37,38]。衍射光子的粒子从而经历一个力由于动量转移。激光束的强度剖面选择适应高斯梯度,这样的小位移梁中心的粒子(~ 150海里)产生一个反作用力对其平衡位置,春天像一个简单的谐波。弹簧常数,这是决定提前通过控制实验,取决于激光的概要文件和捕获对象的介电性能(37- - - - - -39]。
通过监测和/或单独操控生物分子,单分子技术能够推出随机行为和罕见的事件中隐藏的系综平均从“散装”生化试验(简称“散装”)。促进单分子操纵光镊,两个DNA处理连接到微米大小的聚苯乙烯珠通过biotin-streptavidin digoxigenin-antibody交互,分别为(48]。感兴趣的RNA分子,通常茎环结构或基因,两侧是DNA处理。一个珠子被一束激光,而另一种是把由微量吸液管或另一个捕获激光(图2(一个))。
(一)
(b)
陈等人发现解除力衡量光镊与−1强烈相关编码脉冲频率(图2 (b))[32]。数据的外推预测,100%−1脉冲重复频率效率将达到基因展开力约57 pN。作者推断基因与上面展开力~ 60 pN完全停滞核糖体和导致流产的翻译32]。虽然这直接预测尚未得到证实,这些“路障”效应最近观察到的散装(7]。
符合扭转约束模型(35,36汉森等人进行的),一个类似的实验表明,该工作由光学镊子在机械展开IBV-based基因(焦每摩尔,看到PK401 [31日])远远大于成本理论上估计自由能(292焦每摩尔)所需的RNA展开和延伸(31日),与大量的执行工作不可逆转地消散。需要额外的能量输入使基因抗展开光镊大概核糖体,与等效碱基对发夹同行相比能量。模型还解释了观察茎的长度和预测稳定1并不总是与移码的频率,因为扭转约束的影响也必须考虑;例如,Napthine等人发现一个IBV-derived基因12 bp杆1 (焦每摩尔,55%−1脉冲重复频率)实际上刺激−1脉冲重复频率更有效地比13 bp杆1 (焦每摩尔,47%−1脉冲重复频率)(49]。
尽管基因的强大的机械强度,hiv - 1是独一无二的,它利用一个简单的茎环结构作为其−1 PRF-stimulating元素(20.),如上所述,−1脉冲重复频率效率容易UUUUUUA移码突变网站(几乎5% ~ 0%的点突变)(4]。因此,一个高效的滑的作用顺序也应该考虑。的确,保利(U)模板的滑性质已经证明了光镊之前(50]。
虽然光镊揭示mrna的机械性能,单分子福斯特共振能量转移(smFRET)作为一个强大的工具来探索构象的变化单一核糖体(51- - - - - -57]。当一束激光完全和内部反映在显微镜下,它产生隐失波在另一边的接口。这个隐失波衰减指数随着距离,因此只能渗透到反应室(~ 100纳米58,59]。SmFRET利用这个属性只激发荧光样品固定表面上,大大减少了背景信号从免费荧光分子以外的隐失场。固定化荧光分子出现衍射极限点,可以可视化和电子记录的增加电荷耦合装置(EMCCD)相机。荧光强度和相应的烦恼的效率分别单分子可以被测量和计算。
最近smFRET实验利用荧光标记核糖体关联循环波动担心效率intersubunit构象变化,进而表明核糖体易位事件(52]。这种设计允许研究人员观察核糖体下滑分辨率密码子,显示一小部分(< 2%)的核糖体痕迹表现出担心周期大于的信使rna编码长度homopolymeric保利(U)模板。相比之下,更多的烦恼,说明有核糖体滑移周期,没有观察到当heteropolymeric模板翻译(52]。这些结果再次证实了U-rich序列非常滑25]。
尽管最近的一项研究表明,茎环结构可以作为高效−1编码脉冲刺激器,实验利用滑序列,UUUAAAC,似乎更有效促进−1中脉冲重复频率比hiv - 1 UUUUUUA主题(分别为41.7%和24.7%时放置最小IBV的上游基因)(19,25]。综上所述,尽管基因结构为核糖体进展提供了一个强大的机械障碍,一个有效的序列可能更少的拓扑约束茎环结构的协同作用。然而,这些组件之间的定量关系,为什么某些序列是许多折叠比其他人更滑25),需要进一步调查。
上面的例子表明,单分子光谱学可以直接访问物理数量似乎更好与pseudoknot-stimulated−1脉冲重复频率效率,从而提供前所未有的潜在机制的机械化学的详细信息16,31日,32]。
3所示。粗粒度的弹性网络模型提供了进一步洞察全球运动的核糖体和单分子光谱可引导标签计划
核糖体被证明具有内在的信使rna解旋酶活性为解决翻译期间mRNA的复式结构在体外(29日]。有趣的是,除了优越的三级相互作用引起的基因的稳定性和扭转约束,它提出了立体化学的不匹配的基因结构和几何假定的核糖体解旋酶网站将阻止下游mRNA的条目28,44]。这种观点是支持的事实,一些没有预料到的突变在循环2影响三级相互作用,但被怀疑改变接触核糖体,显著降低−1脉冲重复频率效率[60]。这就产生了有趣的可能性,除了作为一个通用的机械障碍,特定的基因之间的相互作用和核糖体的mRNA入口网站可以促进−1编码脉冲诱导核糖体的构象变化复杂的变构。的确,虽然基因和茎环结构都可以拖延核糖体,只有基因能够诱导畸变p区tRNA,冷冻电子显微镜的观察(低温电子显微镜)停止哺乳动物的地图80 s核糖体(图3(一个))[44]。低分辨率(16.2),然而,没有足够的可视化原子结构动力学在移码的细节。不幸的是,高分辨率单分子技术也受到他们的拉或标签的网站,因此无视这样的全球结构性变化。计算模型,另一方面,监控的整体运动分子从详细的结构模型。
(一)
(b)
一个粗粒度的弹性网络模型(61年)只需要原子为每个考虑氨基酸残基在蛋白质网络中“节点”(62年]。对于每个核苷酸,2或3代表原子被分配节点(63年,64年]。每个节点之间的交互由简谐近似的潜力,这决定了这些节点的波动。节点振动进一步分解为许多正常的模式,其贡献的总体动态蛋白质由各自frequency-squared反向加权。因此,蛋白质的生物相关的运动,通常涉及到大规模的构象变化,由低频主导模式在运用65年- - - - - -67年]。
运用基于蛋白质动力学的观点很大程度上取决于本地联系人的拓扑结构,提出了和支持的几项研究[68年- - - - - -72年]。因此,每个残留的物理和化学性质不考虑运用,并且计算复杂度大大降低与分子动力学模拟(71年,73年]。只需要更少的时间来计算低频模式主导大分子运动,使运用特别适合建模大复合物(70年]。事实上,核糖体的ratchet-like运动,其中一个最重要的全球运动描述核糖体易位(74年),显然是被运用计算只考虑了几慢模式(64年,71年]。此外,全球核糖体的变形可以通过运用迭代计算基于x射线结构,然后安装到低温电子显微镜结构源于不同国家的核糖体结合各种因素,揭示大规模构象变化从固有的低分辨率的低温电子显微镜图像75年]。
住宿的关系一个网站氨酰和离解E-site deacylated tRNA多年仍然难以捉摸(16,76年]。运用仿真结果的基础上,王等人预言,一个网站的运动和E-site转运rna是分开(取向相关性为0.165,统一值显示完全一致运动)(64年]。这种预测已经支持后面的单分子荧光实验的相关分析(相关系数)[76年]。同样,Kurkcuoglu等人利用同样的方法来检测可能活跃网站负责内在解旋酶活动的核糖体(图3 (b))[46]。预测不仅同意以前的结果(29日),但也给了更多可能的关键残基未确认实验。因此,运用样本平衡动力学和预测全球构象变化,可以引导标签计划未来的单分子实验探测的关键直接核糖体解旋酶和基因之间的相互作用。
模型摄动核糖体基因引起的动力学可以方便地进行运用和线性响应理论(77年),扰动核糖体上的力的大小可以推断出从解除部队提供的基因单分子测量。另外,拉力直接应用于核糖体通过光学镊子提供另一个合理的实验方法对模型验证和改进。这个计划可能也适用于其他超分子组合。
4所示。未来的视角
由于异步随机反应的性质,详细的分子机制往往很难推断出从传统批量实验。然而,最近的生物物理工具的发展,特别是单分子技术,阐明了机械和功能性质的基因(31日,32,41,44],核糖体解旋酶的作用[46,78年,整个机制转化机械(52,76年,79年,80年]。事实上,结合数据从低温电子显微镜,x射线晶体学,以及分子动力学模拟/建模提供了预测和见解之间的交互核糖体L1茎trna,同意与smFRET结果(80年]。人们问我们可以学习通过应用同样的方法结合−1脉冲重复频率的调查机制。
结构、计算和单分子方法是相辅相成的。计算建模和模拟揭开分子的动态特性,并提供基于物理方法对蛋白质变形在外部应用的力量的存在69年,73年,81年,82年]。计算可以让“理性”生物素/ digoxigenin标签可能在单分子实验中,通过标签核糖体网站,导致至少构象的变化和由此产生的离解mRNA在光学镊子。机械的描述可能相当生理相关,在小节激酶的情况下,作为分子力传感器在肌肉细胞(81年- - - - - -83年]。另一方面,单分子力量和荧光光谱探针实时结构转换,比如folding-unfolding以及拉伸,蛋白质(84年- - - - - -86年],rna [87年,配合物(41,88年]。这些数据随后可以用于验证和/或提炼物理模型和分子模拟。
理解平移机械以及−1编码脉冲机制提出有吸引力的抗病毒治疗的目标。虽然可以开发药物目标80年代真核核糖体和改变−1脉冲重复频率[89年,90年),副作用尚不清楚,由于潜在的细胞基因,利用移码,但尚未发现91年- - - - - -93年]。开发药物,特别是与病毒−1 PRF-stimulating结构可以很好的干预策略。事实上,小配体已确定改变病毒−1脉冲重复频率效率通过绑定到−1 PRF-promoting茎环结构在hiv - 1基因在严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(冠)6,21,27]。如上所述,单分子光谱学可以提供各种RNA的部队展开结构,也与−1脉冲重复频率效率比热力学稳定性。研究各种突变−1 PRF-promoting结构可能会促进药物发现通过识别必要的残留物和粘结负责他们的机械稳定性以及与核糖体的交互。因此,结合新的生物物理工具揭示了如何开发未来的抗病毒药物对无处不在的−1脉冲重复频率工作机制中病毒。
确认
作者感激地感谢博士Jin-Der温家宝的分子与细胞生物学研究所(IMCB),国立台湾大学,杨和李威博士的研究所的生物信息学和结构生物学,国立清华大学的启蒙和对本文的支持。他感谢罗伯特·安德森博士的微生物学和免疫学,达尔豪斯大学,加拿大、批判阅读本文。他还想承认国家科学委员会和IMCB这项工作和相关研究的财政支持。