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特刊

健康与疾病中的细胞和分子力学

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研究文章|开放访问

体积 2017 |文章的ID 5158961 | https://doi.org/10.1155/2017/5158961

Takahiro Ebata, Yasumasa Mitsui, Wataru Sugimoto, Maeda, Keigo Araki, Hiroaki maachiyama, Ichiro Harada, Yasuhiro Sawada, Hideaki Fujita, Hiroaki Hirata, Keiko Kawauchi， ＂基质刚度通过ROCK2表达影响阿霉素诱导的p53激活"，生物医学研究的国际， 卷。2017， 文章的ID5158961， 10. 页面， 2017． https://doi.org/10.1155/2017/5158961

基质刚度通过ROCK2表达影响阿霉素诱导的p53激活

孝宏Ebata，1 Yasumasa三菱，1 wataru sugimoto.，1 miho maeda.，1 圭吾荒木，2 Hiroaki Machiyama.，3.，4 ichiro harada，5 Yasuhiro Sawada，6 Hideaki Fujita，3.，4 Hiroaki Hirata.，7 和 Keiko川内1，8

1科南大学科技创新研究的前沿，7-1-20 Minatojima-MinamaChi，Chuo-Ku，神户，兵库多，日本650-0047

2昆西省科工学院，2-1 Gakuen，Sanda，Sanda，Hyogo 669-1377

3.综合生物仿真实验室，RIKEN QBIC，6-2-3 Furuedai，Suita，Osaka 565-0874，日本

4日本大阪565-0871大阪大学免疫学前沿研究中心1-3

5日本，千叶，277-0032，和田谷医院和田谷研究所机械医学实验室，687-4

64-1并木国家残疾人康复中心，日本埼玉县Tokorozawa 359-8555

7名古屋大学医学研究生院，65艘Tsurumai，Showa-Ku，Nagoya，Aichi 466-8550，日本

8日本神奈川211-8533日本神奈川211-8533日本神奈川医学院高级医学科学研究所分子肿瘤科1-396

学术编辑器:Esmaiel Jabbari.
收到了 2016年7月30日
修改 2016年12月03
接受 2016年12月12日
发表 2017年1月16日

抽象的

细胞外基质(ECM)的物理性质，如硬度，涉及到确定癌细胞的特性，包括化疗敏感性。化疗耐药通常与肿瘤抑制因子p53功能障碍有关;然而，ECM微环境是否干扰癌细胞中p53的激活仍是未知的。在这里，我们发现，在MCF-7乳腺癌细胞中，细胞外刚度影响抗肿瘤药物阿霉素诱导的p53激活。阿霉素对细胞生长的抑制作用随着ECM刚性的增加而增加，这是一种p53依赖的方式。当细胞在更坚硬的ECM底物上培养时，rho相关的卷曲卷曲蛋白激酶(ROCK) 2的表达显著升高，该蛋白可诱导肌球蛋白II的活化。抑制ROCK2表达或药理抑制ROCK可降低阿霉素诱导的p53激活。我们的研究结果表明，软ECM导致ROCK2表达的下调，而ROCK2通过抑制p53的激活来驱动化疗耐药性。

1.介绍

p53功能障碍是导致化疗和放疗等癌症治疗产生耐药性的主要原因之一[1- - - - - -3.]．在低压力条件下，由于mdm -2介导的降解，p53的表达维持在一个低水平[4]．为了应对基因毒性药物引起的DNA损伤，PI3激酶样激酶家族成员(ATM、ATR和DNA- pk)被激活，然后磷酸化p53 [5，6]．随后，它们通过减弱p53从mdm2介导的降解中分离出来来磷酸化和稳定p53 [7]．然后P53通过诱导多种靶基因的表达诱导细胞周期阻滞和凋亡，包括P21.WAF1，病因,PIG6，从而抑制受损细胞的生长[8]．P53功能障碍通常是由基因突变引起的TP53编码p53 [9]．

越来越多的证据表明，细胞外基质(ECM)的刚度，一种肿瘤微环境因子，有助于化疗敏感性[10.]．基质细胞分泌的ECM硬度，如癌症相关的成纤维细胞和肌成纤维细胞，在大多数实体肿瘤中增加[11.，12.]．例如，其弹性模量约为1-4kPa的乳腺腺体肿瘤比健康的乳腺（<1kPa）更硬。值得注意的是，肿瘤肿瘤与癌细胞的更高侵略性相关[11.，13.，14.]．然而，ECM的刚度是否调节癌细胞p53的功能和化疗敏感性仍是未知的。

细胞感测ECM静电在整联蛋白介导的细胞 - ECM粘附结构中称为焦粘连（FAS）[15.]．ECM的刚性可调节FA蛋白的招募和磷酸化，通过Rho GTPases(包括Rho、Rac和Cdc42)的激活导致肌动蛋白聚合[16.]．Rho也激活ROCK，从而诱导肌动蛋白为基础的运动蛋白肌凝蛋白的激活，并增加肌动蛋白-肌凝蛋白收缩力的产生[11.]．

用遗传毒性药物治疗多柔比星通常会诱导肌动蛋白细胞骨架架构的重塑;但是，它的影响出现了一些有争议的争议[17.- - - - - -21.]．在小鼠胚胎成纤维细胞中，阿霉素破坏了收缩肌动球蛋白束的形成，即应力纤维，但诱导皮质肌动球蛋白环的形成[19.，20.]．相反，其他研究报道说应激纤维的形成在几种细胞系中的凋亡之前通过多柔比星促进，包括MCF-7细胞[17.，21.]．当悬浮细胞中应力纤维的形成和FAs受损时，阿霉素诱导这些细胞凋亡的效果增加[17.，18.]，表明应激纤维和Fas的形成可以有助于保护细胞免受凋亡。此外，还据报道，在小鼠胚胎成纤维细胞中，箔的形成，它们是由肌动蛋白聚合产生的薄的指状细胞突起，在多柔比蛋白治疗时减少[22.]．由于紫外线趋势促进筛选的癌细胞的存活率[23.]，多柔比蛋白诱导的氟胚层形成的衰减可能有助于多柔比蛋白处理细胞的低可活力。

在这项研究中，我们检查了基质刚度是否会影响野生型P53的MCF-7乳腺癌细胞的多柔比蛋白诱导的生长抑制。我们发现，多柔比星治疗在硬衬底（30kPa）上的细胞活力降低到更大的基板（30kPa），并且在多柔比蛋白处理的细胞的可生存力下，该刚度依赖性降低需要P53活化。响应ECM刚性而增加Rock2表达，并且Rock2敲低减少了多柔比蛋白诱导的P53活化。P53的异位表达防止柔软底物培养的细胞中的多柔比蛋白诱导的箔形成。我们的研究结果表明，Rock2介导的Actomoosin收缩性在僵硬的ECM上的上调赋予癌细胞通过P53的大量活化来赋予癌细胞的化疗响应。

2.材料和方法

2.1。细胞培养

MCF-7人乳腺癌细胞和293T人胚胎肾细胞在Dulbecco的改性鹰培养基（Nissui Pharmaceutical）中培养，补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素。如前所述制备用于聚丙烯酰胺培养基材的N-丙烯酰-6-氨基丙烯酸 - （ACA-）共聚丙烯酰胺凝胶[24.，25.]．将细胞接种在2.2×10的基板上5细胞/ cm.2用阿霉素(DOXO;1μ.g/mL)孵育24 h后。

2.2。MTT测定

根据制造商的指示（Dojindo，Inc。）通过MTT测定评估细胞生长。

2．3．逆转录病毒载体和逆转录病毒感染

生成对人类的小发夹rnas（shrnas）的逆转录病毒P53.和人类ROCK2,P53.目标序列[26.5“-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3”ROCK2目标序列[27.] 5'-ggtttatgctatgaAgctt-3'被克隆到Psuper减速火箭载体（oligoengine）中。如前所述进行逆转录病毒感染[28.]．简而言之，使用Hilymax转染试剂（Dojindo）将编码ShRNA的逆转录病毒载体与帕牛质粒分配成293T细胞。在转染后48小时，收集上清液，然后在8个中使用过滤器感染MCF-7细胞 μ.克/毫升聚凝胺。用嘌呤霉素(1.5μ.g / ml）3天。

2．4．抗体和材料

抗p53小鼠单克隆(DO-1;Santa Cruz Biotechnology)，抗hdac1小鼠单克隆(2E10;默克密理博),反α.-Tubulin小鼠单克隆（DM1A; Sigma-Aldrich），抗P21兔单克隆（EPR3993; ABCAM），以及抗拉林B1兔多克隆（ABCAM）抗体用于免疫印迹分析。抗PMLC2（SER19）兔多克隆（细胞信号传导技术）和抗HA小鼠单克隆（16B12; Covance）抗体用于免疫荧光分析。Doxorubicin和Y-27632购自Merck Millipore。

2．5．定量实时聚合酶链反应

如前所述进行定量实时PCR分析[29.]．使用以下引物：人类P21.waf1前进5'-ggcttcatgccagcttc-3'和反向5'-ccctagggctgtgctcacttc-3';人类病因正向5 ' -AGCTGGAAGTCGAGTGTGCT-3 '，反向5 ' -ACGTGCACCTCCTGAGAAAA-3 ';人类PIG6正向5 ' - tttttcaccaccacttgcaga -3 '，反向5 ' - tgtcccaggcaggtt -3 ';人类ROCK2前进5'-caactgtgaggcttgtatgaag-3'和反向5'-tgcaaggtgctataAtctcctc-3';和人类泛素前进5'-tgactacaacatccaga-3'和反向5'-atctttgccttgacattc-3'[24.]．

2．6．免疫印迹分析

将MCF-7细胞用裂解缓冲液（50mM Tris pH 7.4,150mM NaCl，1％Triton X-100,1％SDS，10mM EDTA，1mM NA溶解3.vo.4， 10mm NaF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒[PIC;Nacalai Tesque])，然后在20,000 ×g超声后离心20分钟。上清液作为总细胞提取液，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。为了分离核和胞浆提取物，细胞在缓冲液A中溶解(10 mM HEPES pH 7.2, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 0.4% nap -40，和PIC)，然后在10000 ×g下离心10分钟，冰培养5分钟后。上清液作为胞浆提取液。用缓冲液A洗涤小球，随后在缓冲液B中(20 mM HEPES pH 7.9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, PIC)在涡流混合器中重悬10分钟。2万×g离心15分钟后得到的上清作为核提取物。提取液进行SDS-PAGE电泳。为了获得Triton X-100可溶性和不可溶性的分馏物，用裂解缓冲液(50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10 mM EDTA, 1 mM Na)溶解细胞3.vo.4在冰下孵育15分钟后，在20,000 ×g下孵育15分钟。上清液作为Triton X可溶组分。用缓冲液洗涤后，将微丸重悬在SDS样品缓冲液中，随后超声处理。裂解物作为Triton X不溶组分。提取液进行SDS-PAGE电泳。

2.7。荧光显微镜

对于在SER19的MLC2磷酸化的免疫抑制中，将细胞用10％甲醛在补充有0.1μmHEPESpH 7.4的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）中，然后用0.2％Triton X-100渗透化。在PBS中封闭5％山羊血清后，将细胞与抗PMLC2（SER19）抗体一起温育。Alexa Fluor 633缀合的山羊抗兔IgG（分子探针）用作二抗。Alexa Fluor 488阴侧蛋白酶（分子探针）和DAPI（分子探针）分别用于分别染色F-肌动蛋白和核。为了在球体内的单个细胞内同时可视化P53和F-肌动蛋白，用Lifealct-GFP表达载体转染在2kPa底物上培养过夜的细胞（来自德国Munster大学的Roland Wedlich-Söldner的礼物[30.)，以及对照或ha标记p53表达载体。24 h后，用阿霉素处理细胞16 h。细胞用10%的甲醛在含有0.1 M HEPES pH 7.4的PBS中固定。使用其自身荧光(例如:488 nm/em: >580 nm [31.]）.使用共聚焦显微镜(LSM700;蔡司)，然后用ImageJ软件(NIH)进行分析。

2.8。统计分析

使用未配对的学生双面进行数据的统计分析 -测试。

3.结果与讨论

我们将MCF-7细胞分别培养于弹性为2kpa和30kpa的明胶包覆的ACA凝胶和弹性模量为10的塑料培养皿上6kPa)。2kpa基底上的细胞聚集形成球形结构(图1(一)）.相反，在30kPa底物上培养的细胞表现出平坦和涂抹形态，但在塑料盘子上培养时它们更平坦，更散布。响应于刚性ECM的整合蛋白信号传导的激活可以防止抗肿瘤药物诱导的细胞死亡[32.]，球形形成，通常在软ECM上观察到（图1(一))，据报道也能使癌细胞对抗肿瘤药物产生抗药性[33.，34.]．鉴于这些明显相反的结果，我们使用台盼蓝排斥细胞染色检测了ECM刚度如何影响阿霉素对细胞生长的抑制作用。当细胞在2kpa底物上培养时，阿霉素处理使活细胞的相对数量减少了~35%(图1 (b)）.相反，当将细胞培养在30kPa底物上时，在多柔比蛋白处理后进一步降低了活细胞的相对数量（〜54％）。我们进一步研究了ECM刚度在使用MTT测定的存在或不存在的情况下对细胞增殖的影响。在30kPa底物上培养的细胞数量显着大于2kPa底物上培养的细胞（参见在线提供的补充材料的图S1https://doi.org/10.1155/2017/5158961），表明基材加强促进细胞增殖。相比之下，在30kPa底物上培养的多柔比蛋白处理细胞的数量与在2kPa底物上培养的培养物。在30kPa底物上比在2kPa底物上的30kPa底物上的多柔比星引起的细胞增殖衰减也更显着。

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图1
刚性底物增强阿霉素对细胞生长的抑制作用，以p53依赖的方式。(a-b) MCF-7细胞感染对照或P53.将表达shrna的逆转录病毒培养在弹性为2和30 kPa的底物或平板上(P;~ 106kPa)。（a）用倒置显微镜（Olympus CKX41）获得细胞的相位对比图像。规模的酒吧,50μ.m。（b）用多柔比星（DOXO; 1）处理细胞 μ.G / mL）24小时，使用基于台盼蓝禁止的细胞染色计数活细胞的数量。在每种情况下，将多柔比蛋白处理的细胞的数量标准化为非处理细胞的细胞。每个条表示平均值±标准偏差（SD）; ．星号, ．（C-D）评价多柔比星的积聚在具有2kPa的弹性的基材上培养的细胞中。（c）使用其自荧光可视化掺入细胞中的多柔比星。z堆叠图像，间隔为1.0 μ.M用共聚焦显微镜获得。阿霉素(红色)和核(DAPI)的投影图像显示。规模的酒吧,50μ.m。（d）绘制横跨球体绘制的黄线的荧光强度被绘制。强度值相对于每个轮廓中的最大值归一化。（e）从控制中提取P53.在平板上培养的表达shrna的细胞用p53和p53抗体进行免疫印迹分析α.-微管蛋白作为加载控制。

而MCF-7细胞在软基质上培养形成球状(图1(一)），球形形成提供缺氧微环境并减弱药物渗透[33.，34.]．这些与球状体形成相关的效应可能有助于癌细胞的化疗耐药性，据报道p53活化的下调也参与其中[33.]．然而，以下结果表明，软底物上p53激活的下调不太可能是由于球状体相关的缺氧或我们系统中有限的药物渗透造成的。首先，虽然缺氧通常发生在距离100-150的组织中μ.来自血管的m [35.]时，在我们的实验条件下形成的球体的宽度要小得多( μ.米半径, ）.第二，球体中心区域和外边缘之间渗透的阿霉素浓度没有明显差异(图1 (c)和1 (d)）.

接下来研究了P53对细胞形态和多柔比蛋白诱导的细胞生长抑制的ECM刚度依赖性调节的贡献。MCF-7细胞带有shRNA介导的p53表达枯竭（图1 (e))在30kpa和塑料基板上展开，但在2kpa基板上形成球状，尽管这些球状与对照细胞相比形状不规则(图1(一)）.这表明p53耗尽的细胞保留了感测基板弹性差异的能力。然而，刚性依赖性依赖于多柔比星引起的细胞活力的减少（图1 (b)）和细胞增殖（图S1）在P53敲低时出现废除。

为了分析p53激活是否参与了ECM的刚性依赖调节阿霉素诱导的细胞生长抑制，我们通过评估其已知靶基因的表达来检测p53的转录活性。P21.Waf1，编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，和病因和PIG6，其产物通过激活caspases诱导细胞凋亡[8]．的表达P21.Waf1在30kpa底物上的表达量显著高于2kpa底物上的表达量(图2(一个)和2 (b)）.我们观察了衬底刚度和p53对基因表达的类似效果病因和PIG6．与这些凋亡诱导因子的基因表达增加一致（图2(一个))，裂解caspase底物层粘连B1 [36.- - - - - -40通过底物刚性依赖性方式的多柔比星治疗也增加了（图2 (b)）.因此，坚硬的ECM对阿霉素诱导的p53激活有促进作用，这可能是观察到阿霉素治疗后的细胞生长抑制在坚硬的ECM上以p53依赖的方式增强的基础(图)1 (b)）.

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图2.
软衬底递减多柔比蛋白诱导的P53活化。（a-c）用对照感染的细胞或P53.表达shrna的逆转录病毒在弹性为2和30kpa的底物上培养。(a)的表达P21. Waf1，病因,和PIG6在在存在或不存在的细胞中培养DOXO（1 μ.g/mL)处理24h后，采用实时荧光定量PCR检测。每条线表示平均值±SD; ．星号, ．控制和(c)P53.表达shrna的细胞在指定时间内用dox处理。(b)对总细胞裂解物进行免疫印迹分析，使用针对p21、Lamin B1和α.-微管蛋白作为加载控制。白色箭头表示全长Lamin B1，黑色箭头表示被剪切的片段。(c)对总细胞提取物、核提取物和胞浆提取物进行免疫印迹分析，以p53、HDAC1抗体作为核标记物α.-微管蛋白作为负载对照或细胞质标记物。

我们接下来研究了阿霉素治疗后的p53蛋白水平是否受到ECM刚度的影响。阿霉素处理后p53表达增加，底物刚性不影响p53表达(图2 (c)剩下）。相反，当细胞在更纤细的底物上培养细胞时，核级分中的p53的量更大（图2 (c)右)。相比之下，Triton X-100不溶性细胞骨架部分[41.在30kPa底物上比在2kPa底物上较低的多柔比蛋白处理的细胞（图S2）。这些结果表明，软ECM通过P53与细胞骨架的相互作用衰减P53的核积累。

坚硬的底物已被证明会增加肌动球蛋白的收缩[11.，42.，43.]．我们还发现，当细胞在柔软(< 4kpa)底物上培养时，成纤维细胞中肌动球蛋白激活剂ROCK2的表达下调[44.]．与这些先前的报道一致，肌素轻链（MLC）的磷酸化是在纤维基底上培养的细胞中激活非气霉菌素的临界步骤（图3(一个)）.由于据报道，肌霉素II ATP酶抑制剂BLEBASTATIN或角质形成细胞中的肌霉素II ATP酶抑制剂BLEBBISTIN或岩石抑制剂Y-27632抑制了多柔比蛋白诱导的稳定性和伴随核积累[45.[我们是否询问刚性依赖性Rock2表达和伴随的肌动素活化是否参与了刚性基材上的P53的增强激活。与成纤维细胞的情况一致[44.]，ROCK2MCF-7细胞在30kpa底物上的表达显著高于在2kpa底物上的表达(图3 (b)）.虽然多柔比蛋白治疗诱导核中p53的积累（图2 (b)），岩石抑制（图3 (c)）和Rock2敲低（数字3 (d)和3 (e)）减少了多柔比星诱导的p53的核积累。伴随，P53靶基因的表达P21.Waf1，在阿霉素治疗后，通过下调ROCK2显著降低(图3 (f)）.总之，这些结果表明ROCK2的表达和活性的底物刚度依赖性增加有助于P53活化。

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图3.
ROCK2参与了阿霉素诱导的p53激活。(a)细胞在弹性为2和30 kPa的基质上培养。磷酸化MLC染色的细胞共聚焦图像(pMLC2;红色)和f -肌动蛋白(绿色)。规模的酒吧,20μ.m.间隔为1.0的Z-stack图像μ.使用共聚焦显微镜获得M，并显示投影图像。（b）ROCK2采用实时荧光定量PCR检测弹性为2和30千帕底物培养细胞的表达情况。每条线表示平均值±SD; ．星号, ．(c)存在或不存在dox的培养细胞的核提取物和胞浆提取物(1μ.g/mL)和/或Y-27632 (10μ.以p53抗体、HDAC1为核标记物，并进行免疫印迹分析α.-微管蛋白作为细胞质标记物。(d-f)这些细胞被对照组或ROCK2shRNA-expressing逆转录病毒。(d)ROCK2表达被评估为（b）中。（e）对在存在或不存在的细胞中核提取物和细胞溶胶提取物与16小时的免疫印迹分析与抗体的免疫印迹分析进行免疫印迹分析，作为核标志物，HDAC1和核标志物α.-微管蛋白作为负载对照或细胞质标记物。(f)P21. Waf1用实时荧光定量PCR检测dox存在或不存在24 h时细胞的表达情况。每条线表示平均值±SD; ．星号, ．

岩石家庭由Rock1和Rock2组成。两种同种型具有冗余功能，并在多柔比蛋白处理时涉及MLC2磷酸化[19.，20.]．虽然我们在这里已经表明，ROCK2的活性增强了阿霉素诱导的p53激活，但之前的研究表明，p53激活反过来会导致ROCK1的激活增强。而在凋亡过程中，通过caspase-3和caspase-7的裂解，ROCK1被构成性激活[46.， p53激活这些caspases [47.]．因此，ROCKs和p53可能在细胞凋亡过程中形成一个正反馈回路。这种正反馈机制会加速阿霉素治疗后的细胞耗竭，ECM刚度可能通过调节这种反馈机制影响阿霉素治疗后的细胞耗竭效果。然而，ROCK调控p53活性的实际机制尚不清楚。因为p53在细胞核和细胞质之间动态穿梭[48.]， ROCK可能通过调控p53进入/从细胞核的输入/输出来调控p53的核定位，这需要在今后的研究中进一步研究。

P53通过重塑actin细胞骨架改变细胞行为[49.]，肌动蛋白重塑参与了阿霉素治疗后细胞命运的决定[17.，19.- - - - - -22.，50.]．而肌动蛋白重构在细胞形态变化中起着核心作用[51.)，我们注意到，阿霉素处理后，在2kpa基底上形成的球状体展开并形成薄突起(图4(一)- - - - - -4 (c)）.相比之下，阿霉素处理后30kpa基底上的细胞簇分布减少，并伴随形成薄突起的减少(图)4(一)和4 (c)）.然后，我们研究了阿霉素如何调节肌动蛋白细胞骨架来诱导细胞在2kpa底物上的突起形成。阿霉素治疗可使球状细胞内形成长丝状突起(图4 (d)和4 (e)）.重要的是，与硬质底物相比，在2kpa底物上p53活性相对较低(图2），在2kPa谱系上的细胞中P53的异位表达废除了多柔比蛋白诱导的突起形成（图4 (d)和4 (e)）.P53对突出形成的这种抑制作用与先前报道的P53的功能一致;P53降低CDC42的活性，促进氟肽形成的小GTP酶，以及Fascin的表达，在氟肽中的主要肌动蛋白捆绑蛋白[22.，52.，53.]．考虑到丝状足突能促进细胞存活[23.[我们的结果意味着通过促进突出形成，P53在球状体中的活性降低可使细胞抵抗化学疗法。

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图4.
阿霉素处理诱导在软基质上培养的细胞形成突起。(a, d)在弹性为2kpa (a, d)和30kpa (d)的基质上培养的细胞，用或不加dox (1μ.g / ml）16小时。（a）用倒置显微镜获得细胞的相位对比图像。秤栏，100 μ.m. (b)利用ImageJ软件，从拟合每个椭球的椭圆长到短椭圆长，计算在2kpa条件下培养的椭球的长径比。每条线表示平均值±SD; ．星号, ．(c)细突起的数目( 20μ.使用imagej软件量化沿着小区集群的外围的m）。数据表示每100的突起数 μ.m的密封簇的外围。每条线表示平均值±SD; ．星号, ．（d）用LifeACT-GFP表达载体转染细胞以将F-Actin与HA标记的P53表达载体一起标记，然后用DOXO处理。显示了F-actin（绿色），HA（洋红色）和核（DAPI;蓝色）的共焦图像。z堆叠图像，间隔为1.0 μ.使用共聚焦显微镜获得M，并显示投影图像。还示出了盒装区域中的F-actin的放大图像。秤栏，20 μ.m.白色箭头表示丝状突起( 10μ.m）。（e）细胞的相对数量，具有超过三个箔状曲线型突起（ 10μ.m），到总细胞数（ ），显示。

癌细胞的干性是癌症转移、复发和化疗耐药的一个促进因素[54.- - - - - -57.]．p53通过抑制各种干细胞标记物的表达和激活DNA切除修复途径来降低干细胞性[49.，58.]．相反，ROCK抑制和软底物促进干细胞自我更新和将成纤维细胞重编程为干细胞[50.- - - - - -54.]．鉴于这些之前的结果，我们在本研究中揭示的软性底物上ROCK-p53轴的下调可能有助于癌症干细胞的产生。

4。结论

我们的研究为乳腺癌细胞环境介导的耐药性机制提供了新的见解。更坚硬的底物使乳腺癌细胞更容易以p53依赖的方式对阿霉素治疗。值得注意的是，虽然晚期癌细胞与较硬的肿瘤有关[9，11.，12.]，它们通常带有体细胞突变TP53高速率[9]．因此，由于p53的突变导致功能障碍，晚期癌细胞即使在刚性肿瘤中也可能表现出化疗耐药性。相反，癌细胞处于早期阶段，在其中TP53基因通常不会遭受严重的突变，其存在于相对柔软的环境中，这些环境可能降低遗传毒性药物对细胞生长的抑制作用。用遗传毒性药物治疗早期癌细胞与增加细胞外刚度和/或霉菌素II活性的药物或物理方法可以提供有效的癌症治疗方法。

相互竞争的利益

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

致谢

作者感谢Roland博士Wedlich-Söldne提供的Lifeact-GFP表达载体和dr。Nagahama Koji, Takahito niskata, Junji Kawakami, Shota Yamauchi, Kiyonao Sada和Toshiya Kotari先生进行讨论。这项研究得到了日本安斯泰来制药公司、兵库县科学技术协会和内藤基金会的支持。

补充材料

图。S1。与P53依赖性方式相比，多柔比蛋白在与具有2kPa的弹性的那些相比，在具有30kPa的底物上培养的细胞的活力。图。S2。软衬底增加了Triton-x不溶性级分中P53的量。

  1. 补充材料

参考文献

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