补充膳食栗色或白坚木单宁对瘤胃微生物群落和脂肪酸的乳制品母羊gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

反刍动物衍生产品在饮食和全球经济有重要的作用;因此,能够控制瘤胃微生物生态系统,改善其质量,是畜牧业的根本重要性。本研究的目的是评估膳食补充剂的影响与栗子和白坚木单宁对微生物群落和脂肪酸,奶牛瘤胃液体的母羊。多元PCR-DGGE概要瘤胃微生物群落的分析显示之间的相关性的存在栗色或白坚木饮食、具体gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba十八3组DGGE概要文件,增加gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba12,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba15;十八2gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba9,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba12;十八2gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba9,gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11;十八2gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11和gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba15;和第18章gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11的内容,减少18:0浓度。DGGE乐队序列的系统发育分析揭示了细菌的存在代表相关属gydF4y2BaHungatellagydF4y2Ba,gydF4y2Ba瘤胃球菌属gydF4y2Ba,gydF4y2Ba真细菌gydF4y2Ba和非保密Lachnospiraceae家庭成员,这表明这些类群可能受单宁的饮食。这项研究的结果表明,单宁栗色和白坚木可以通过减少不饱和脂肪酸的biohydrogenation瘤胃微生物群落的变化。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

瘤胃微生物生态系统的操作被认为是最重要的畜牧科学提高饲料效率和增加ruminant-derived产品的质量(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。最新发现表明,丹宁酸,第二个最丰富的植物酚类木质素后,可用作天然饲料添加剂调制瘤胃发酵的抑制特定的瘤胃微生物物种(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。单宁化学分为两组,hydrolysable和浓缩单宁能够影响经济增长和许多种类的瘤胃微生物的代谢活动gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。单宁归因于不同的毒性作用机制,如酶活性的抑制,底物或金属离子剥夺,有害生物膜(行动gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。此外,丹宁酸对瘤胃微生物的影响似乎强烈依赖于它们的化学结构,他们在瘤胃酒的浓度,和所涉及的微生物物种gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。由于这个原因,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究请阐明这类多酚对瘤胃微生物群落的影响,因此其实际就业在反刍家畜。gydF4y2Ba

最近,许多研究已经试图了解如何增加健康的脂肪酸的浓度(FA) rumenic酸(RA,十八2gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11)或vaccenic酸(VA 18:1gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11)和瞬态中间的细菌biohydrogenation (BH)的多不饱和脂肪酸(PUFA),在反刍动物奶和肉(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在以BH细菌似乎参与,gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团是特别敏感的单宁(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。选择性抑制gydF4y2Ba丁酸弧菌属proteoclasticusgydF4y2Ba的最后一步,涉及黑洞亚油酸(洛杉矶,第18章第2节的过程gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba12),可以提供一个积累vaccenic酸(VA, 18:1gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11)在瘤胃级别,因此,更多的RA在反刍动物产品(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。单宁减少gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba活动和增长gydF4y2Bab . proteoclasticusgydF4y2Ba(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。此外,文献[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)表明,白坚木的包容gydF4y2Ba(Schinopsis lorentzii)gydF4y2Ba单宁在母羊饮食影响了gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团选择性地在乳制品和增强RA的内容。然而,有限的信息是可用的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba不同来源的丹宁酸对瘤胃微生物的影响和FA黑洞。因此,本研究的目的是调查的影响以栗母羊饮食补充(十)或白坚木(,)单宁提取物(hydrolysable和浓缩单宁,resp)对瘤胃精足总,总瘤胃细菌组成的社区,,最后,在的组成gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba群社区,通过使用一个聚合酶链reaction-denaturant梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)的方法。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。动物和实验设计gydF4y2Ba

实验研究中心的应用生物学、意大利佩鲁贾大学。动物被处理根据意大利法律的指导方针对动物福利的实验动物(意大利卫生部,2014)和佩鲁贾大学的伦理委员会动物使用和护理。三柏加马斯卡舞曲x不会分泌乳汁Appenninica母羊(6岁,60.5±3.4公斤的体重)配备了瘤胃套管的内部直径10厘米(Ankom技术公司,马其顿,纽约,美国)。动物被单独写。实验3×3拉丁方设计。每个母羊饲料三个连续三实验21 d的时期,包括15 d的适应,在每一个。在21天瘤胃白酒取样。3×3拉丁方出现2次,目的是获得更多的复制。在整个实验期间,母羊可以免费获得水和干草,在集中管理每天两次(07:30时和18:30)。运动每天收集一次。gydF4y2Ba

2.2。饮食gydF4y2Ba

之前测试的实验饮食是相同的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba试验(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。饮食是由碎草干草(粒度> 4厘米的长度),随意和集中管理(800克/头/天),含有84.5克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}干物质(DM)的大豆油,52.8 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}膨润土的DM(控制,作为补偿的惰性成分单宁介绍),或52.8 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM的栗单宁(十)或52.8 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM的白坚木单宁(,)。的化学成分提要和集中展示在表的成分gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。单宁的剂量选择获得饮食单宁浓度接近1.6%的预期DM的摄入量。结果从先前的研究在文献的基础上,这一剂量被认为是安全的动物和实际的农民gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.3。丹宁酸来源gydF4y2Ba

栗单宁(750克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM而提供的等效鞣酸)Mauro萨维奥拉Srl (Radicofani,锡耶纳,意大利),而提取,g(456公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM圭多提供的等效鞣酸)Lapi SpA(卡斯特尔Franco di惊喜、比萨、意大利)。gydF4y2Ba

提取都据伯恩斯(滴定gydF4y2Ba19gydF4y2Ba评估相当于鞣酸。化学成分及气相色谱的状况、被刊登在Campo et al。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]和的特点,为其它Vasta et al。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.4。饲料采样和分析gydF4y2Ba

每天饲料样品收集,储存在−80°C,直到进一步的分析。样本然后地面进行化学分析轧机Cyclotec 1093 (PBI国际米兰,意大利),使用一个毫米的网格大小。浓度的粗蛋白(CP)、醚提取物(EE)和灰分测定采用AOAC公认方法976.06,920.39,和942.05,分别gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、和木质素(ADL)内容确定根据范所以et algydF4y2Ba。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba),使用热稳定的淀粉酶和亚硫酸钠,表示包括残留的灰烬。代谢能(我)和净能量哺乳(NEL)计算根据美人蕉et al。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。提要提取足总根据Folch et al。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba据克里斯蒂),酯化(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba与19:0](σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)作为内部标准,并确定使用下面描述的相同的步骤的FA瘤胃样本。gydF4y2Ba

2.5。瘤胃样本收集和脂肪酸概要文件gydF4y2Ba

瘤胃内容从每个采样前母羊早上喂瘤胃从两个不同的网站,经过21天的试验在每个饮食和立即冻结在−80°C,直到进一步的分析。gydF4y2Ba

英足总提取根据Folch et al。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba据Buccioni)和甲基化等。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。英足总甲酯(名声)组成由色谱法,根据Buccioni et al。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。个人饥饿量化使用戊酸(5:0)和nonadecanoic酸(19:0)甲基酯(鳕鱼W275204和鳕鱼N5377,分别地。西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)作为内部标准和比较确定的名声峰的相对保留时间的样本,与标准的混合物37混合组件的名声(18919 - 1 - amp C4:0-C24:0、鳕鱼,Supelco, Bellefonte, PA,美国),个人18:1gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba9和第18章gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11(46903年和v1381鳕鱼,分别地。,Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), individual 18:2独联体gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba1255年11(鳕鱼,Matreya Inc .愉快的差距,PA,美国),CLA混合标准(鳕鱼05632;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),发表了异构配置文件(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。18:1同分异构体洗脱顺序执行根据克雷默et al。gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。此外,标准的亚麻酸(放大器)同分异构体(47792年鳕鱼,Supelco化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)和洛杉矶同分异构体(47791年鳕鱼,Supelco化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)和出版异构配置文件(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)被用来识别感兴趣的同分异构体(共轭gydF4y2BaαgydF4y2Ba亚麻酸,CALNA十八3gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11日,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba15;vaccelenic酸,VLA,十八2gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11日,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba15)。两个细菌混合酸甲酯(47080 - u Supelco鳕鱼,化工有限公司,圣路易斯,密苏里州;GLC110 Matreya,愉快的差距,PA)和个人标准14:0的甲酯gydF4y2BaisogydF4y2Ba,14:0gydF4y2Ba迷人gydF4y2Ba,15:0gydF4y2BaisogydF4y2Ba和17:0gydF4y2Ba迷人gydF4y2Ba(鳕科鱼21-1211-11,21-1210-11,21-1312-11,21-1415-11,Larodan马尔默,瑞典)被用来确定分支FA概要文件。国米和intra-assay变异系数计算通过使用参考标准黄油(CRM 164年,社区的参考,布鲁塞尔,比利时)和检测阈值的0.001 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}FA (gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。所有FA成分结果表示为g / 100 g FA。gydF4y2Ba

2.6。DNA提取、PCR扩增gydF4y2Ba

总DNA提取1毫升每个冷冻瘤胃液体,使用快速DNA旋转工具土壤(MP生物医学,圣安娜、钙、美国)做了一些调整。短暂,每个样本解冻和转移到15毫升管,含4.5毫升的缓冲区组成的150毫米氯化钠,10毫米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}Tris-HCl, pH值8.0,10毫米EDTA涡大力,离心机在200年gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 5分钟。一毫升的上层清液被转移到一个2毫升离心管,离心,享年14600岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 5分钟。颗粒在978年被解散gydF4y2BaμgydF4y2Ba122年缓冲磷酸钠和LgydF4y2BaμgydF4y2BaL的缓冲区(两种解决方案都是由土壤DNA快速旋转工具,MP生物医学,圣安娜、钙、美国),然后处理,根据制造商的指导方针。DNA产量在260 nm量化其吸光度,DNA质量使用琼脂糖凝胶电泳验证1% (w / v)。gydF4y2Ba

提取的DNA作为模板用于PCR扩增V6-V8区域的16 s rRNA的总细菌或基因gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组。使用以下引物对PCR扩增进行:F968GC和R1401总细菌(片段大小~ 470个基点),根据Nubel et al。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba],F968GC和B无伤大雅的gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团(片段大小~ 470个基点),根据金et al。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。反应进行了使用一个iCycler热循环(Bio-Rad实验室,赫特福德郡,英国)25gydF4y2BaμgydF4y2BaL卷包含1 x PCR缓冲(67毫米Tris-HCl, pH值8.8,1.66毫米(NH)gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4,gydF4y2BaMgCl Tween-20 0.1%), 1.5毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,250年gydF4y2BaμgydF4y2BaM deoxynucleotide三磷酸腺苷(核苷酸),每个引物的400海里,1 u Polytaq(变异较大,佛罗伦萨,意大利),和10 ng的DNA。在下列条件下进行PCR反应:最初的94°C的变性5分钟,其次是35周期94°C的20年代,56°C 30年代和72°C 45 s,和最后一个扩展10分钟的72°C。PCR产品验证了琼脂糖凝胶1.2% (w / v) ecectrophoresis。gydF4y2Ba

2.7。PCR-DGGE总细菌和分析gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组织社区gydF4y2Ba

PCR扩增子被DGGE electrophoretically分离6%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺/ bis 37.5: 1)在1 x TAE缓冲区(40毫米三基地;20毫米冰醋酸;1毫米EDTA)使用50 - 60%变性剂梯度获得100%的变性剂解决方案,v / v去离子的甲酰胺组成的40%,7 M尿素。凝胶是在60°C和75 V 17 Phor-U系统h (Ingeny国际,NL)和电泳运行结束时,凝胶是沾SYBR®黄金(分子探针,尤金或)和凝胶图像数字化使用ChemiDoc XRS装置(Bio-Rad实验室,赫特福德郡,英国)。gydF4y2Ba

2.8。PCR-DGGE片段的序列分析gydF4y2Ba

16乐队选择的中间部分gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2BaDGGE档案无菌切除和放置在20国集团gydF4y2BaμgydF4y2BaL蒸馏水。通过冻融(PCR产品筛选了gydF4y2Ba34gydF4y2Ba使用F968 / B)和reamplified fib底漆对没有GC夹,如前所述。PCR DGGE凝胶电泳被检查的产品,然后进行直接测序Macrogen服务(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。色谱图编辑序列使用浓度Lite软件(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)来验证没有模棱两可的山峰和将其转换成FASTA格式。破译找到嵌合体Web工具(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)被用来揭示嵌合体隐藏在16 s rDNA序列。BLASTN程序(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)可以在NCBI网站(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)是用于查找分类密切相关的核苷酸序列。增加作业的准确性,不同的序列相似性阈值被用于不同的分类级别:≥97%的相似性识别和物种水平95%,90%,85%,80%,和75%转让属,家庭秩序,类,分别和门级(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

构建系统发育系统树图,显示明显的亲缘部分16 s rRNA彼此基因序列和其他等效长度的序列从基因库中检索数据库使用软件ClustalX) (gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)执行序列比对和软件TREECON 1.3 b (gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)的建设系统树使用neighbor-joining方法(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。引导分析基于1000重采样。gydF4y2Ba

2.9。统计分析gydF4y2Ba

统计分析了使用SAS的混合过程gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。数据分析使用以下模型:gydF4y2Ba 在哪里gydF4y2Ba因变量,计算在每一个采样周期测量的均值,gydF4y2Ba总体的意思是,gydF4y2Ba是动物随机效应(gydF4y2Ba 3),gydF4y2Ba是效果(gydF4y2Ba 3),gydF4y2Ba是饮食的效果(gydF4y2Ba 3),gydF4y2Ba 是他们的互动,gydF4y2Ba拉丁方的随机复制(gydF4y2Ba 2),gydF4y2Ba是残差。gydF4y2Ba

最小二乘方法估计报告。所有统计分析、意义被宣布gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba

DGGE概要进行了规范化和分析使用GelCompar II软件4.6 v(应用数学、Sint-Martens-Latem、比利时)。乐队(物种丰富度)的数量及其相对丰度作为代理的丰富性和多样性(香农指数,gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba和辛普森指数D)瘤胃微生物群落,被Pastorelli et al。gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。DGGEs带概要文件,提取存在/不匹配表,过去被导入到软件(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba为多元统计分析如前所述,Lagomarsino et al。gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。单向的相似性分析(ANOSIM)和置换多元方差分析(PERMANOVA)进行确定意义的微生物群落结构差异由于不同的饮食方法。为了找到潜在的社区之间的连接成分和瘤胃FA概要文件和证据这些连接可能会如何影响不同的两种不同的饮食典范对应分析(CCA)进行:首先,英足总认为是主要涉及黑洞的过程(即。18:0,硬脂酸,SA);弗吉尼亚州;射电望远镜;洛杉矶;放大器;RA)选择;第二,英足总认为是瘤胃微生物代谢的标记根据Fievez et al。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba被认为(即。,15:0gydF4y2BaisogydF4y2Ba;15:0gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba;17:0gydF4y2BaisogydF4y2Ba;17:0gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba)。向量的长度和角度的相对重要性表明FA中区别不同的细菌群落瘤胃酒(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。识别分类单元,主要导致分离的微生物群落,根据不同的饮食,DGGE乐队分数也CCA图绘制。的gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团DGGE概要,主要是有关不同FA概要文件被测序。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。脂肪酸(FA)瘤胃酒的成分gydF4y2Ba

单宁的存在在饮食诱导瘤胃酒足总变化的状况。单宁降低PUFA的黑洞导致亚油酸的积累(LA)、亚麻酸(放大器),及其BH中间体,减少累积的硬脂酸(SA)(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。特别是vaccenic酸(VA)和rumenic酸(RA)百分比明显高于从母羊美联储本契约和瘤胃酒,比动物样本美联储控制饮食。等18:1同分异构体gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba15日,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba11日,gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba5,gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba6 - 8,gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba9,gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba10显示类似的趋势。,饮食也与增加18:2有关gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba10日,gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba12瘤胃酒中的内容。gydF4y2Ba

考虑到奇怪甚至支链脂肪酸,14:0gydF4y2BaisogydF4y2Ba内容增加瘤胃液体样本中只母羊美联储,而15:0的内容gydF4y2BaisogydF4y2Ba增加瘤胃酒的单宁酸的饮食。然而,15:0的内容gydF4y2BaisogydF4y2Ba从母羊在瘤胃酒是美联储。瘤胃液体样本母羊美联储控制和CHT饮食17:0浓度最高gydF4y2BaisogydF4y2Ba(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。考虑到gydF4y2Ba赌注/ isogydF4y2Ba足总,12:0的内容gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba本样本的风险高,而15:0吗gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba和17:0gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba含量高,样品。gydF4y2Ba

3.2。栗色和白坚木单宁酸对瘤胃微生物的影响的社区gydF4y2Ba

DGGE条带配置文件获得总细菌(补充材料gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示许多乐队从16 - 28。与生成的配置文件gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组引物不那么复杂,一个乐队4-16(补充材料gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。丰富不受饮食中单宁的存在在瘤胃酒细菌gydF4y2Ba 和gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团gydF4y2Ba 社区。gydF4y2Ba指数从DGGE分析获得的细菌gydF4y2Ba 和gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团gydF4y2Ba 治疗和D之间的相似指数没有显著变化与细菌的饮食吗gydF4y2Ba 或gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组织社区gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba

ANOSIM测试应用于16 s rDNA PCR-DGGE资料表明,不同的饮食方案明显分离的瘤胃细菌社区和细菌带概要文件的复制动物样本(6×3饮食)为每个饮食更相似(ANOSIM全球测试gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba 比时发现)gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团(ANOSIM全球测试gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba )进行了分析。PERMANOVA分析证实,饮食显著影响微生物群落结构(PERMANOVA全球测试:细菌gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba )。PERMANOVA双向测试证实细菌社区及下,明显不同于控制饮食(表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),对gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团下的社区CHT明显不同于其他人,而控制社区,没有明显不同(表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.3。细菌群落组成与饮食gydF4y2Ba

规范总细菌或之间进行对应分析gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团DGGE概要文件和英足总认为是主要涉及黑洞过程(SA);弗吉尼亚州,VLA,洛杉矶;放大器;RA)表明,瘤胃社区单宁饮食治疗是分开控制,数字gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba。同样,CCA总细菌或之间进行gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团DGGE概要文件和英足总认为是瘤胃微生物的新陈代谢(15:0的标志gydF4y2BaisogydF4y2Ba;15:0gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba;17:0gydF4y2BaisogydF4y2Ba;17:0gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba)根据Fievez et al。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]表明,瘤胃社区,是分开控制,数字gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

总细菌和gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团下的社区单宁提取饮食LA呈正相关,LNA、RA和弗吉尼亚州的生产数据gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba,而只有那些在C15呈正相关gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba和C17gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba,数据gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba。总细菌和gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组织社区的控制样本呈正相关SA生产,数据gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

3.4。协会和识别gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组16 s rDNA PCR-DGGE乐队与关键Biohydrogenation通路中的脂肪酸gydF4y2Ba

多元CCA分析产生的数据gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团DGGE允许识别细菌物种或组主要关联到一个特定的足总;因此,细菌被测序DGGE乐队1,2,3,4,5,6,7(表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)明显与洛杉矶,LNA、RA,弗吉尼亚州,VLA(数据未显示),而细菌对应乐队8,9,10,11,12、13、14和15(表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)明显与SA(数据没有显示)。gydF4y2Ba

公认的分类识别DNA的乐队与洛杉矶,LNA、RA, VA透露,他们是属gydF4y2BaHungatellagydF4y2Ba(带5),gydF4y2Ba瘤胃球菌属gydF4y2Ba(乐队2,3,4),和非保密Lachnospiraceae(带1、6和7;表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。此外,公认的分类识别的乐队与SA透露,他们与非保密Lachnospiraceae(乐队8、9、10、11、12、13、14和15;表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba;图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

饮食PUFA的BH过程强烈降低单宁酸的饮食,无论丹宁酸的类型。然而,结果表明,单宁有更强的能力支持BH-intermediate的积累,如弗吉尼亚州和RA,降低瘤胃SA浓度的酒,如果到CHT单宁相比。最近,我们发现了类似的结果通过与饮食喂养哺乳期乳制品母羊包含豆油补充与否与栗子和白坚木单宁(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。在目前的审判,在瘤胃的酒gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba10同分异构体为18:1和18:2也显著积累应对单宁的补充。以前,在一个gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba试验在哺乳期乳制品母羊(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)管理的相同数量的大豆油和单宁浓缩饲料不产生显著的影响gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba10同分异构体为18:1 18:2,这表明在目前审判瘤胃环境更有利于从大豆油替代BH途径的。gydF4y2Ba

浓缩单宁的存在,饮食诱导15:0的增加gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba和17:0gydF4y2Ba赌注gydF4y2Ba内容和17:0的减少gydF4y2BaisogydF4y2Ba瘤胃酒中的内容。自前两个FA与纤维素分解菌株的生长有关,后者与淀粉分解的细菌的生长gydF4y2Ba48gydF4y2Ba),这种模式或支足总建议浓缩单宁的不利影响纤维素分解细菌。相比之下,支链FA瘤胃酒之间的模式样本及控制饮食很相似,表明CHT单宁不扰乱纤维素分解细菌的生长。的确,以前的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba实验在哺乳期母羊gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]表明,单宁比在限制、更高效的纤维素分解细菌增殖。gydF4y2Ba

至于整个瘤胃细菌群落的组成、多样性指数并没有改变。因此,BH模式的变化可能是由于细菌的重组。事实上,丹宁酸的毒性作用在特定菌株可以通过增加补偿单宁抗药性细菌总数。这些数据是按照先前发现的选择性抑制植物提取物含有单宁在特定菌种的生长和活动的代表瘤胃微生物种群(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。Vasta et al。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),通过T-RFLP分析,表明膳食补充,单宁总细菌群落结构影响羔羊瘤胃的美联储,补充饮食。然而,值得注意的是,单宁用于本研究的比例较低(< 2% DM)比用Vasta et al。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。因此,现在和以前的数据放在一起gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba试验乳制品母羊,增加饮食中单宁的实际剂量能引起瘤胃细菌总数的变化社区支持的积累及其在瘤胃酒BH中间体。gydF4y2Ba

细菌参与黑洞的过程被归类为传统上分为两个不同的组:那些属于集团PUFA拉或放大器转换成和那些属于B组加氢,VA到SA (gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。组包含许多已知的物种,其中gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba种虫害是最重要的gydF4y2Ba52gydF4y2Ba,gydF4y2Ba53gydF4y2Ba),而gydF4y2Bab . proteoclasticusgydF4y2Ba是唯一已知的可耕种的瘤胃细菌属于B组(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。然而,最近的研究表明,其它微生物as-yet-uncultivated系统分为细菌gydF4y2Ba普氏菌gydF4y2Ba,Lachnospiraceae incertae基准和非保密gydF4y2Ba细菌性的gydF4y2Ba,gydF4y2Ba梭菌属的,gydF4y2Ba和Ruminococcaceae可能参与BH流程与相关角色(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。DGGE分析数据显示2% DM的效果,或CHT单宁的组成gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组。gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba浓缩单宁(尤其敏感的物种gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。实际上,这些物质能够穿透的细胞壁gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba和其他革兰氏阳性细菌和选择性地抑制细胞壁生物合成(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。然而,与此同时,显著的差异gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba物种水平的观察他们对单宁的敏感性(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。持久性和一些乐队的外观而不是其他的gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2BaDGGE凝胶与这些先前的发现是一致的。gydF4y2Ba

多元统计允许选择DGGE乐队的代表gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团BH推定地参与的过程gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。七个乐队消失在母羊再辅以丰富的饮食,而且这种影响是降低瘤胃SA浓度。因此,它是可能的,这组DNA乐队可能代表发挥作用的其他细菌的BH VA SA,确认几项研究的结果(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。的确,这里的乐队确定是高度相关的无教养的瘤胃细菌属于家庭Lachnospiraceae。有趣的是,没有标识为序列gydF4y2Bab . proteoclasticusgydF4y2Ba根据文学,这是唯一已知的细菌物种能够有效biohydrogenate PUFA SA在瘤胃。然而,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究显示对比的结果,因为明显的减少数量之间的关系gydF4y2Bab . proteoclasticusgydF4y2Ba和减少生产SA的瘤胃酒只有数量有限的试验中发现gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。一个可能的解释,我们的数据可能是本研究中使用的丹宁酸的浓度不能修改gydF4y2Bab . proteoclasticusgydF4y2Ba瘤胃的增长只有下调产能氢化18:1gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba足总,正如前面提出的Boeckaert et al。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。否则,有可能gydF4y2Bab . proteoclasticusgydF4y2Ba有一个有限的对股价形成的贡献gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,其他还没有已知的物种可能有一个更重要的角色在这个步骤中黑洞的途径。因为只有有限数量的瘤胃物种目前已知的,这个假设是可能的。此外,在与其他作者的观点评估海洋藻类的影响(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和鱼油gydF4y2Ba56gydF4y2Ba瘤胃细菌多样性,证明可能消失的许多不文明的关系Lachnospiraceae菌株,遗传距离gydF4y2Bab . proteoclasticusgydF4y2Ba和瘤胃SA浓度明显降低。gydF4y2Ba

我们的研究也证明,这两种类型的丹宁酸诱导增加洛杉矶,LNA、RA和VA和第18章第2节gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba11和gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba15在瘤胃酒,这是与更高强度的七个乐队gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团DGGE概要文件。系统发育分析显示,这些序列是属于属物种的代表gydF4y2BaHungatellagydF4y2Ba,gydF4y2Ba瘤胃球菌属gydF4y2Ba,gydF4y2Ba真细菌gydF4y2Ba和非保密Lachnospiraceae。再一次,这些数据确认gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组织可能参与BH通路,他们数量的增加可能促进瘤胃18:1中间体的积累。其他就业和更强大的分子技术,如功能宏基因组,可能有助于明确这些无教养的黑洞里的细菌的作用途径。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

使用栗色和白坚木单宁乳制品母羊的饮食水平低于2% DM减少瘤胃BH过程的程度,降低SA浓度和提高的百分比,LNA、VA, RA和其他18:1同分异构体。变化在足总概要与总细菌和变化有着紧密的联系gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba群社区,即使在存在白坚木他们更明显。乐队消失或增加单宁酸的存在gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba集团DGGE概要文件相关的许多不文明的种Lachnospiraceae,表明这些还不是已知的物种可能发挥作用在PUFA的黑洞。我们的研究表明,板栗和白坚木单宁提供一种有趣的可能性调制良好瘤胃细菌脂质代谢健康FA的前身,在哺乳期母羊的乳腺组织产生的牛奶脂肪合成。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

ADF:gydF4y2Ba	酸性洗涤纤维gydF4y2Ba
BH:gydF4y2Ba	BiohydrogenationgydF4y2Ba
CLNA:gydF4y2Ba	共轭亚麻酸gydF4y2Ba
本:gydF4y2Ba	栗单宁gydF4y2Ba
糖尿病:gydF4y2Ba	干物质gydF4y2Ba
CP:gydF4y2Ba	粗蛋白gydF4y2Ba
情感表达:gydF4y2Ba	乙醚萃取物gydF4y2Ba
费尔南多-阿隆索:gydF4y2Ba	脂肪酸gydF4y2Ba
名声:gydF4y2Ba	脂肪酸甲基酯gydF4y2Ba
拉:gydF4y2Ba	亚油酸gydF4y2Ba
放大器:gydF4y2Ba	亚麻酸gydF4y2Ba
我:gydF4y2Ba	代谢能gydF4y2Ba
警队辨称:gydF4y2Ba	净能量为泌乳gydF4y2Ba
NDF:gydF4y2Ba	中性洗涤剂纤维gydF4y2Ba
PUFA:gydF4y2Ba	多不饱和脂肪酸gydF4y2Ba
问:gydF4y2Ba	白坚木单宁gydF4y2Ba
类风湿性关节炎:gydF4y2Ba	Rumenic酸gydF4y2Ba
山:gydF4y2Ba	硬脂酸gydF4y2Ba
弗吉尼亚州:gydF4y2Ba	Vaccenic酸gydF4y2Ba
射电望远镜:gydF4y2Ba	Vaccelenic酸。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

阿里安娜Buccioni和葛拉齐亚Pallara是平等的贡献者。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者要感谢以下人员佛罗伦萨大学的:弗朗西斯卡Decorosi,多利亚Benvenuti,和安东尼奥Pezzati技术援助。这项工作已经由佛罗伦萨大学的金融支持手段(Fondi di Ricerca di Ateneo 2013/2014/2015)和Gruppo毛罗。萨维奥拉Srl Radicofani,锡耶纳,意大利。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

补充材料1:DGGE的16 s rDNA PCR产品从DNA提取瘤胃酒使用底漆的总细菌(f968gc - 1401 r)。CTR,控制饮食(84 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM大豆油);饮食(84 g公斤,栗色的单宁gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM豆油+ 52.8 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM的栗单宁提取);饮食,白坚木单宁(84克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM豆油+ 52.8 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM的白坚木单宁提取);米,标记用于乐队正常化。补充材料2:DGGE的16 s rDNA PCR产品获得DNA从瘤胃中提取液使用底漆gydF4y2Ba丁酸弧菌属gydF4y2Ba组(F968GC-B fib)。CTR,控制饮食(84 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM大豆油);饮食(84 g公斤,栗色的单宁gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM豆油+ 52.8 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM的栗单宁提取);饮食,白坚木单宁(84克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM豆油+ 52.8 g公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}DM的白坚木单宁提取);米,标记用于乐队正常化。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba

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