文摘
我们提出了一种新颖的工作流基于单细胞转录组检测在细胞群分布模式研究。单细胞分析的快速应用,研究人员面临的挑战是如何有效地提取基因特性来有效地分离的细胞群。考虑到coexpressed基因往往功能或结构相关,coexpressed模块的数量远小于基因的数量,我们的工作流使用基因coexpression模块为特征,而不是单个基因。因此,在总结成eigengenes coexpressed模块时,我们不仅可以交互式地探索细胞的分布也我们可以及时解释基因特性。小说的交互式可视化辅助的应用空间统计分析使用一个群集索引参数散点图。这个参数有助于突出有趣的2 d模式的散点图矩阵(SPLOM)。我们演示了工作流使用两个大型单细胞研究的有效性。艾伦大脑scRNA-seq数据集的可视化分析提出了一个新的假说,如谷氨酸代谢参与大脑细胞的分离。在大量胶质母细胞瘤的研究中,带有独特的细胞迁移相关签名的样品被确认。
1。背景
单细胞RNA序列(scRNA-seq)正在成为一个强大的工具为研究异构和亚型的细胞群。许多生物信息学和计算工具开发了可视化,集群,分类根据细胞表达谱(1,2]。不同的算法的方法,如主成分分析(PCA)和多维标度(MDS) [3),非负矩阵分解(4),最小生成树(MST) [5,6],潜变量建模[7),扩散映射(8,9),和样条模型(10)都被应用和实现这样的目的。此外,它已被证明,通常细胞在人群中并不总是形成“集群。“相反,细胞形成一个连续分布的空间特色基因和基因签名(1]。因此,它往往是极大的兴趣识别有趣的分布模式(例如,叉骨模式和分岔)往往意味着重要的生物过程,如干细胞分化以及基因签名,可以用来揭示这样的模式。
然而,这项工作通常会导致一个“鸡生蛋还是蛋生鸡”的情况。自从模式可能并不总是容易可感知的从全基因组数据,如PCA和MDS方法可能并不总是有效的。因此,它经常在一个迭代过程和最终的主观选择的基因利益。另一个普遍采用工作流是第一个集群根据细胞表达谱和识别“基因签名”,区分这些签名集群其次是浓缩分析基因潜在的生物功能或过程分离的细胞。因为可能有许多基因参与微分分析,功能性浓缩信号可以被稀释。
在本文中,我们提出一个视觉分析工作流叫做功能虚拟流式细胞术(FVFC)识别功能基因组织可以有效地分离细胞使用scRNA-seq数据。我们专门利用基因coexpression网络分析(GCNA)。GCNA旨在识别模块具有相似的基因表达谱。众所周知,coexpressed基因通常在功能上或结构上相关的(11- - - - - -16]。因此,而不是测量所有的基因,通过关注coexpressed基因簇,我们可以直接研究基于功能基因的细胞组与统计能力增强17]。
我们的方法是在以下方面创新。首先,它着重于基因模块有明确的函数关系(coexpression),从而大大提高了统计能力。其次,只有基因模块使用单个细胞之间的“信息”。特别是我们关注的模块显示双峰或多峰分布在细胞分离,以确保权力的基因在细胞群。第三,我们运用空间统计学方法来检测基因的组合模块,导致有趣的空间模式或分离的细胞,从而识别与底层生物过程相关的基因签名。最后但并非最不重要的,而不是开发这个工作流作为一个“算法”,我们实现它作为一个视觉分析工作流程,允许研究人员交互地选择感兴趣的基因模块和细胞分布模式进行进一步的调查。为此,我们利用SPLOM结合多种视觉线索来源于空间统计计算。我们展示我们的工作流使用两个大单细胞研究大脑和癌症,分别。
2。方法
2.1。工作流
图1概述了工作流的方法,包含三个阶段。给定一组加工scRNA-seq数据,第一阶段实施每个网络模块的coexpression网络分析和总结成一个“eigengene”以及富集分析来确定每个模块的功能或结构关系。第二阶段分析每个eigengene选择内容的更多信息,特别是双向的。然后每条信息eigengenes散点图生成。散点图进一步使用空间统计参数进行分析,以确定他们是否形成有趣的模式,特别是如果有集群或凝结在散点图中,暗示潜在相关的两个基因模块之间的关系两个eigengenes。在最后阶段,基于空间散点图是彩色的统计参数和有趣的模式进一步检查其功能的相关性。总的来说,此工作流为研究人员提供了一个直观的可视化分析方法快速探索功能在单细胞基因组织种群之间的关系。工作流程中的步骤的细节将在以下部分中讨论。
2.2。加权基因Coexpression网络分析
第一阶段在图1是进行基因coexpression网络分析。这一阶段的详细工作流程见图2。给定一组的基因及其表达水平细胞的基因表达谱与一个矩阵可以表示 在哪里维行向量 的表达谱吗th基因在样品( )。然后两两相关矩阵可以表示为 在哪里之间的相关系数是吗th基因向量和th基因向量。在我们的实验中,我们用斯皮尔曼等级相关系数之后的两两相关矩阵高斯分布不能假定RNA-seq数据根据皮尔逊相关性。
相关矩阵计算后,我们应用一个最近开发的算法称为规范化lmQCM [15]。而广泛采用基因coexpression网络分析软件包WGCNA [18),该算法采用网络挖掘的方法允许模块间的重叠,也保证有下界的密度检测模块。算法的输出lmQCM模块是一组基因 ,每个模块 是由一群吗coexpressed基因。模块的数量和模块的大小是由lmQCM算法的四个参数决定。在[详细的参数选择进行了讨论15),最重要的参数,这是第一次的重量的门槛边缘的任何模块,从而控制模块的数量。通常我们选择确保一个模块的最大大小(即不太大。,不到500个基因)。此外,我们专注于基因模块至少有10个基因,这样有意义的功能富集分析可以应用。
对于每一个模块被lmQCM基因,可以表示为一个基因表达矩阵。如果我们想要比较一个基因对另一个模块中,有利于采取只模块的代表,而不是把所有的基因。我们使用PCA减少基因模块数据有意义,以第一主成分为该模块的概要。第一主成分被称为“eigengene”在这种情况下。计算,我们的子矩阵为作为
是集中和标准化这样对于每一行的意思是零,常态是其中之一。让 的奇异值分解。的第一列(表示为)是“eigengene”自标志是一个标准正交矩阵的行列式为1或−1。自从eigengene应该反映大多数基因的方向吗,其投影的大部分基因应该是积极的。因此,如果 ,然后 ;否则, 。所以每个基因模块检测到lmQCM对应于一个“eigengene。”
报告模块,使用NIH大卫浓缩进行分析(https://david.ncifcrf.gov/)[19)和TOPPGene (https://toppgene.cchmc.org/enrichment.jsp)[20.]。
2.3。识别Eigengenes双峰或长尾分布
探索与eigengenes成对基因模块之间的关系之前,我们识别和保持eigengenes是“信息”,也就是说,eigengenes的分布遵循双峰或长尾分布。因此,eigengenes单峰分布,特别是与夏普peak-shaped分布窄的,将会被过滤掉。区分单峰分布与双峰或长尾分布,峰度等指标,第二中央差异,采用似然比(21- - - - - -23]。具体来说,峰度衡量“tailedness”的实值随机变量的概率分布(24]。这里我们用峰度测量给定eigengene过滤的直方图是否有一个非常狭窄的顶点分布。为每个eigengene向量,首先计算矢量的直方图,然后峰度计算直方图分布 在哪里的意思是。在[24),3和9之间的峰度值显示peakness分布,而高值意味着更peak-shaped分布。在这篇文章中,我们设置的门槛峰度作为用户定义的参数。如果给定eigengene直方图的峰态值是小于给定的阈值,然后eigengene将保持。
2.4。空间统计分析使用最近邻的二维散点图分布
为了找到两个coexpressed基因模块之间的关系,我们为所有对eigengene向量生成成对散点图的二维空间。对于两个给定eigengene向量 和 ,散点图的点坐标 在二维空间中。然后我们使用最近邻距离(adi)分析模式。adi的数据点距离其最近的邻居。它是一种空间统计参数有效地用于检测细胞模式空间(25,26]。定义的意思是NND所有的点。然后我们让100个随机模拟,每次创建了相同数量的点在同一地区覆盖 ,意味着NND计算。假设是100年的意思是随机模拟NND,意味着什么标准的变化,是吗分数计算,
我们所说的分数的群集索引散点图。
2.5。布局的可视化
一旦eigengenes与长尾或检测到双峰分布,SPLOM生成。然后使用色标颜色的每个散点图基于群集索引。用户可以选择情节有趣的模式进行进一步的可视化和分析。
3所示。结果
3.1。数据集和预处理
我们应用上述分析两大单细胞基因表达数据集。一个数据集是核糖核酸测序数据的单个细胞脱离鼠标背外侧膝状体核丘脑(dLGN),就是从艾伦布莱恩·阿特拉斯(ABA)下载网站。这个数据集包括dLGN收集的1772个单个细胞在成年小鼠和转录异形与RNA序列。数据集包含45772个基因的转录读数和记录。然而,由于许多零读数在大多数细胞的基因,这些基因被过滤掉;特别是我们删除基因与零超过一半的细胞。此外,基因的平均值和方差是最低的20%的最低50%被移除。这样,20000个基因保留了进一步分析。
另一个数据集从一个单细胞研究人类胶质母细胞瘤。基因表达数据集从NCBI下载综合(GEO)加入GSE57872数量。它包含从430个胶质母细胞瘤细胞转录组孤立从5个人从gliomasphere细胞肿瘤和102单一细胞线使用SMART-seq生成(27]。使用相同的预处理过程中,5948个基因都在这个数据集进行进一步分析。
3.2。ABA的分析小鼠大脑scRNA-Seq数据
(使用lmQCM算法γ= 0.75),60 coexpressed基因与至少五个基因识别模块。使用一个阈值20峰度度量,七eigengenes被选中。表1总结了七个模块的信息。图3显示的彩色SPLOM七eigengenes。
图的颜色方案3让我们进一步检查散点图与有趣的模式。为了确定这些模式是否与特定的注释,对于选定的散点图,我们进一步覆盖注释信息使用不同的颜色。图4显示的例子当广泛亚型神经元的信息是覆盖在散点图上的点与不同的颜色。很明显,没有基因模块可以彻底独立的细胞亚型的基础上。相反,其中一些可以单独的特定亚型。例如,在图4(一)细胞分为两个主要的集群基于定义的“集群指数”在前面的小节中,不完全反映亚型为蓝色和黄色分不分开。相反,蓝色和黄色的点分割图4 (b)甚至远图4 (c)。
(一)
(b)
(c)
(d)
如图4 (b),很明显,黄色的组织细胞和青色细胞分离其余组基于eigengene # 4:富含基因重要膀胱/骨盆神经节开发也可能参与性别发展。与此同时,它可以指出,红集团不同于蓝、青色和黄色组基于eigengene # 2与突触的形成密切相关。此外,根据图4 (c),蓝色和黄色组分离时eigengenes # 3和# 4和eigengene # 3与谷氨酸代谢密切相关,抑制性突触的发展。这些神经功能的细胞群的解释集群的关键。
重要的是要注意,视觉的结果是非常不同的从传统的基于主成分分析的可视化。如图5(一个),如果所有细胞的基因用于可视化使用传统PCA,没有一个清晰的分离的细胞除了一小群。如果我们限制PCA的基因特性的基因只有在涉及模块表中列出1,我们可以清楚地看到三个主要组。作为一个控制,我们三组的细胞在图5(一个)用三种不同的颜色,我们可以看到,没有明确分离的细胞图5(一个)。然而,没有明确的功能分组,很难确定哪些生物过程和功能是参与这样的分离。
(一)
(b)
3.3。分析人类胶质母细胞瘤的病人的大脑scRNA-Seq数据
(使用lmQCM算法γ= 0.2),18 coexpressed基因与至少五个基因识别模块。使用一个阈值5的峰度度规,16 eigengenes被选中。
图6是长尾的SPLOM eigengenes从大脑肿瘤的研究。
从SPLOM,值得注意的是,第四个基因模块不仅具有双峰分布的eigengene但也参与细胞的有效分离。在细胞标记和病人的样本id,很明显,一些分离情况下不同的肿瘤样本之间的差异密切相关,如图7。特别是eigengene # 4是分离的关键细胞绿色组与其他其他eigengenes分离其他团体(例如,eigengene # 6把黄色细胞组与其他而eigengene # 11分离红细胞组)。有趣的是浓缩的分析显示,该基因模块eigengene # 4是高纯度基因与细胞外基质(14基因36, )和细胞迁移过程(10基因, ),这表明一个特定的细胞绿色集团的财产,是重要的细胞外基质和细胞迁移过程的入侵被认为是至关重要的胶质母细胞瘤(28,29日]。
(一)
(b)
4所示。讨论和结论
在这项工作中,我们提出了一个工作流检测细胞群分布模式基于单细胞转录组研究。单细胞分析的快速应用,研究人员面临的挑战是如何有效地提取基因特性来有效地分离的细胞群。然而,这经常在一个鸡和蛋的问题最终的分离细胞往往取决于基因功能的选择,然而没有一个清晰的模式很难确定哪些基因特性是有效的。我们的工作流使用成熟的基因coexpression网络分析利用这一事实coexpressed基因往往功能或结构相关,coexpressed模块的数量远小于基因的数量。因此,总结成eigengenes coexpressed模块时,我们不仅能迅速探索细胞的分布交互式地也我们可以及时解释基因特性和产生新的假设。
自细胞分离是基于不同的选择的基因特性,我们称为工作流”功能虚拟的流式细胞术”,达到分离的细胞基础上突出的基因特性。细胞的分离导致谷氨酸代谢的参与等新假说的分离大脑细胞艾伦scRNA-seq数据和特定的胶质母细胞瘤样本具有独特的细胞迁移相关的签名。而对于后者目前还不清楚如果这确实观察是生物或由于批量效应,我们的工作流模式很快指出深入研究人员检查。
交互式可视化,可以进行额外的高级分析。例如,在这两个数字4 (b)和7 (b)一个有趣的观察是,- - -相互重合不能都有较低的值,表明有趣的布尔基因群体之间的关系(30.]。因此,我们正在进行的工作,这些分析工具以及实现的工作流被在线单细胞分析门户。
缩写
| SPLOM: | 散点图矩阵 |
| scRNA-seq: | 单细胞RNA序列 |
| 主成分分析: | 主成分分析 |
| MDS: | 多维标度 |
| FVFC: | 功能虚拟流式细胞术 |
| GCNA: | 基因coexpression网络分析 |
| dLGN: | 背外侧膝状体核 |
| 阿坝: | 艾伦布莱恩·阿特拉斯 |
| 地理: | 基因表达综合。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这部分工作是由人类前沿科学项目(库恩黄),NCI ITCR U01CA188547(库恩黄),和中国国家自然科学基金会智汉(61572265)。俄亥俄州的超级计算机中心提供了计算支持。