偶氮蛋白底物测定蛋白水解活性:用菠萝蛋白酶样品重新检验传统方法

摘要

鉴于蛋白酶在全球市场的重要性，在选择确定其生物活性的可靠方法时，确定最佳条件和制定标准方案是至关重要的。本文利用质量控制理论验证了Charney和Tomarelli在1947年提出的方法的改进版本。结果表明，偶氮辛底物菠萝蛋白酶在45℃、pH 9(甘氨酸- naoh 100mm)条件下效果最佳。并对上述最适条件(0.072 mg·mL和0.494 mg·mL)的检测限(LoD)和定量限(LoQ)进行了定量分析⁻¹的偶氮酪蛋白，RESP）和一个校准曲线相关因素与底物的量的光密度消化。在所有分析的样品中，我们在存储（约17％），这表明它的使用必须制备后立即响应后观察到显著降低。因此，该协议在本文报价提出了显著改善，考虑到主观的定义在文献中普遍使用这种简单的数学方法使得简洁明了。

1.介绍

因为蛋白酶代表了工业酶市场中最大和最重要的部分[1]，一个可靠的方法来评价其质量的整合显然是极为重要的。这些酶在洗涤剂，食品加工，以及皮革工业中使用的，如在有机合成的生物催化剂，和许多其它应用中，作为治疗剂，因为它们的作用参与关键决定在整个生物体中几种生理和代谢过程[2]。

工业酶的全球市场预计到2018年将达到71亿美元[3.通常被分为三个部分:食品酶、技术酶和饲料酶。2000年，用于洗涤剂、皮革、纺织品和个人护理行业的技术酶占65% [4)的总销售额(约15亿美元[5]），而食品酶，其包括在乳制品，酿造，葡萄酒和果汁中使用的酶，在用10％的贡献为25种％和饲料酶（在动物饲料中使用的）的值。

近70年前，查尼和托马瑞利[6]提出了利用蛋白水解活性的测定一azoprotein（加上重氮化芳基胺的蛋白）的。与这样的蛋白的溶液的消化释放发色团，它可溶于三氯乙酸，并赋予它一个红 - 橙色。

该方法本身依赖于衬底和在给定时间其最适温度/ pH值下的酶之间的反应。The solution colour intensity, read at 440 nm, is a function of the amount of azoprotein digested, since all proteins remaining precipitate after the addition of trichloroacetic acid.

该方法仍是研究酶蛋白水解活性最可靠的方法之一[7,8由于其颜色稳定，不需要显色试剂。此外，磺胺-偶氮辛的制备已经不需要了，因为它已经在市场上广泛销售。

然而，仍然彻底描述的方法可用的协议都缺乏展示其分析参数，方法验证所需的评价。因此，本研究的目的是检查和验证偶氮酪蛋白的方法以确定其检测和定量的限制，除了试剂的储存稳定性和酶活性的定量定义。

2.材料和方法

2.1。菠萝蛋白酶样品和其他化学品

从Sigma-Aldrich公司(美国圣路易斯)获得的Bromelain(目录B5144)和偶氮蛋白(目录A2765)被选为这些研究的标准，用于制备不同ph值下的原液。除非指定，所有其他试剂也从Sigma-Aldrich公司获得。

2.2。底物溶液

鉴于本研究的性质，粉状底物和缓冲液的用量将取决于每次实验的浓度和pH值。底物的pH值和浓度是研究变量的一部分，用以下方法描述。所有pH缓冲液都是按照其他地方描述的通用方案制备的[9]。

基本上，在120毫升烧杯中向粉末状底物中加入4毫升乙醇，用磁力搅拌器搅拌使聚集的蛋白质溶解，然后用96毫升适当的缓冲液(100毫米)稀释。

2.3。菠萝蛋白酶股票的解决方案

菠萝蛋白酶原液是按照Hale等人所述方法的改进版本制备的。[10]。The 1 mg·mL⁻¹酶溶液用不同pH值的100mm缓冲液配制(因为也在研究中)。浓度的选择是基于其在实验条件下的最大溶解度。

2.4。酶法测定

该方法在于在给定的温度和pH值对应于所研究的酶的最适条件下基板和酶促样品的等体积混合。出于实际的原因，我们选择了125 μL，因为它足够小，以避免浪费资源和不妥协的方法的精确度。

利用底物浓度在0.1 ~ 3.0% (w/w)范围内对420分钟内的消化动力学进行研究，以确定合适的消化时间。

终止反应加入750 μL对酶-底物混合物加5%三氯乙酸(TCA)。室温下2000×g离心10 min，取出凝固蛋白。将得到的上清液按1:1 (v/v)比例加入0.5 N NaOH溶液中，在440 nm处测定吸光度。

在酶加入之前，通过将TCA混合到底物上得到空白。

2.5。菠萝蛋白酶的最佳pH值和温度

测定菠萝蛋白酶活性的最佳pH值和温度是通过使用两个水平和三个中心点的两个变量进行全因子实验设计来确定的。在因子设计中，pH值为6 ~ 8，温度为25℃~ 45℃。利用一种技术使基质消化过程的温度保持恒定Dri-Block加热器，模拟DB-3D。

该设计扩展为中心复合设计，根据第一次设计的结果调整其变量范围。所有统计数据均使用R生成和分析[11]，再加上的R-Studio [12]，以及使用包阿克玛[13),美国能源部。基地(14],ggplot2 [15， RColorBrewer [16]。

2.6。校准曲线

利用先前获得的偶氮蛋白消化曲线(如酶促分析中所述)，建立了颜色强度和底物浓度之间的相关性。

原理很简单:如果酶在足够的时间内消化底物，我们就能使溶液达到最大的颜色强度，因为所有的色键与蛋白质的结合都被破坏了，因此可以溶于TCA。这满足了azocasein最初协议中的假设[6，即完全消化的偶氮辛溶液与未消化的样品具有相同的颜色强度。

The calibration curve is obtained by plotting the optical density measured when the time of digestion was 420 min and the concentration of substrate at。

2.7。检测和定量限制

检出限（LOD）为协议的限制和定量限（LOQ）的限制是基于所述响应的标准偏差和校正曲线的平均斜率，以下的指导方针(17]，且由下式表示: 在哪里是响应的标准偏差和是校准曲线的斜率。正如ICH描述的那样，回归直线的残留标准偏差可以作为计算期间的标准偏差。

2.8。稳定性测定

稳定性分析遵循美国卫生和公众服务部提供的一份名为《工业指南:生物分析方法验证》的文件中描述的规程[18]。

短期温度稳定性。低浓度和高浓度各取三份，在室温下解冻，保存8小时，然后进行分析。

长期稳定性。长期稳定性的贮存时间是在间隔6周内评估的，这段时间通常需要我们进行一整批常规实验。长期稳定性是通过在5℃下储存低浓度和高浓度的三种溶液来确定的。为了避免污染，每个样品都保存在自己的小瓶中，并在6个不同的场合进行分析。

冻融稳定性。低浓度和高浓度各三种溶液在- 20℃保存24小时，并在室温下自行解冻。完全解冻后，在相同条件下再冷冻24小时。冻融循环再重复两次，然后在第三循环上进行分析。

3.结果与讨论

3.1。最优条件

对菠萝蛋白酶生化性质的研究和测定已经通过几种方法进行了广泛的研究，但我们的兴趣是确定最佳条件，特别是对研究的底物，以评价其最佳。

数字1(一)对应于从第一实验设计和示出了在这样的可变的所获得的结果的范围内将pH似乎具有对酶活性没有影响。

然后我们修改了实验设计，增加了pH值范围，以证实观察结果。但在碱性pH下，酶的活性有所提高(图)1 (b))，并用于建立表中所示的中心复合设计(CCD)的变量范围1。

数字图1（c）结果表明，菠萝蛋白酶的pH值和温度范围非常宽，能够消化偶氮蛋白底物，且敏感性没有明显下降。它还表明菠萝蛋白酶在中等高温下仍具有活性[19]。由于本地操作上的原因，我们选择pH为9和45℃下，以在该研究中的下一个步骤中使用的条件。For this case, pH 9 Glycine-NaOH (100 mM) buffer was used during substrate preparation.

3.2。校准曲线

数字2示出了用于使用偶氮酪蛋白衬底的每个浓度所获得的动力学曲线。如所预期的，具有较低的底物浓度曲线的几分钟的问题被完全消化，而溶液在3％，2.5％和2％似乎是更接近这样的点，但在酶促反应仍然会在过程。

By plotting the azocasein concentration against its correspondent optical density for all curves at 420 min and using the assumption made by Charney and Tomarelli [6]我们得到这产生这两个变量之间的关系的校正曲线（图3.)。

底物浓度是从质量分数容易地转化为毫克·毫升⁻¹通过考虑溶剂的比质量和加入乙醇引起的体积收缩。

曲线之间的差异主要是由于以下事实：在2.5％和3.0％使用基板的反应似乎有显著量未消化衬底的，因此假定变为无效。因此，实线（SL）的曲线表示在没有这些点的数据系列。从两条曲线的统计分析的结果列于表2。

正如所提供的数据所表明的那样，很明显，除去与未完成反应相关的点可以将相关性置于一个置信水平，从而允许将其用作校准曲线。考虑 检测和定量的限度是用(1)，他们的研究结果如下。数据转换为mg·mL⁻¹使用(2)和得到的系数，考虑 One unit (U) of proteolytic activity was defined as the amount of enzyme capable of digesting 1 mg of substrate per minute, as given in the equation below: 在哪里为偶氮蛋白的浓度(2);是的TCA，基板体积的总和，和酶溶液（用于消化和是消化时间(以分钟计)。

3.3。稳定性测定

基质的储存稳定性是另一个需要评估的重要特征，以便建立一个方案。短期稳定性对于评估基底能否在室温下进行一整天的实验是很重要的(图)4)。

时间= 0结果是相对于它准备之后，而随后的日子显示每个样品，从相同的储备溶液取，放置在室温下分析前8小时的结果的底物溶液的权利。相比于原液但是，类似的变化进行了研究的时间间隔内观察到当结果表明在两种浓度（约10％）衬底响应的显著损失。

长期稳定性进行评估，以检查解决方案是否可以储存多长时间，而不会被冻结。

虽然有在储存期间原液不溶性固体的没有观察到形成，基板的响应后14天有显著损失（约17％），但随后稳定的（图5)。这一事实似乎不会对该方法的任何步骤产生任何干扰，但表明在制备后立即使用底物溶液会提供最大的响应。进一步的研究将是必要的，以了解涉及的现象随时间的反应减少。

对基质消化反应的减少也发生在冻融循环过程中(见图)6)，这加强了这一假设，即它不是由微生物活动引起的，而是以某种方式与底物溶解度有关。观察到的误差比长期和短期研究中观察到的误差要低，这使得它是目前最适合储存的选择。

4.结论

所描述的协议遵循由建立了一套可靠的蛋白水解酶生物活性分析方法。此外，该方法使用了衬底与在消化后样品中观察到的光密度之间的质量相关性。虽然是一个简单和明显的想法，但它提供了一个重大的改进，因为主观定义通常在文献中使用。此外，我们进行了一系列的稳定性测试来评价基质，结果发现所有基质样品均有显著的损失(10%-20%)，说明基质溶液在使用后立即制备后反应增强。由于对底物响应损失控制机制的理解不是本研究的一部分，因此将进行进一步的实验，并分别进行分析。

命名法

我:	协调人类使用药品注册技术要求国际会议。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

作者想感谢FAPESP(圣保罗研究基金会)、PROPP-UFU (Uberlandia联邦大学研究和研究生研究主任)和CNPq(国家科学技术发展委员会)的财政支持。本项目获得了圣保罗研究基金会的资助:FAPESP 2011/20733-7和FAPESP 2012/14533-8。

参考

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