压敏电阻器的msc发生独立失活带正电的残留在跨膜域

文摘

msc (mechanosensitive通道小电导)是无所不在地发现在细菌和中起着重要作用在避免对快速渗透downshock细胞溶菌作用。msc是调制的控制电压,但不知道如何msc感官膜电位。三个精氨酸残基(Arg-46 Arg-54, arg - 74)的跨膜域(TM)是可能的响应电压从msc结构。检查这些残留是否参与msc对电压的依赖关系,我们中和电荷的残渣用与天冬酰胺(R46N, R54N, R74N)。机械阈值的表达野生型msc和天冬酰胺突变体与电压范围从没有改变40 + 100 mV。相比之下,失活过程中野生型msc强烈受到电压的影响。的野生型msc灭活+ 60 + 80 mV,但不是60 + 40 mV。所有突变体的电压依赖性失活率测试,也就是说,R46N, R54N, R74N,和R46N / R74N msc,几乎与野生型的msc。这些发现表明,电压依赖性失活发生独立的正电荷R46, R54, R74。

1。介绍

各类mechanosensitive (MS)通道存在于几乎所有生物体和探测部队由于机械刺激如触觉、听觉、肿胀,渗透压改变(1- - - - - -6]。小(msc)的细菌女士渠道和大型(MscL)电导被认为是作为一个“安全阀”保护细胞免受细胞溶解在渗透downshock通过释放osmolytes [7- - - - - -9]。

msc直接激活膜拉伸(10)和控制是由膜电压调制(11- - - - - -13]。msc晶体结构解析为3.9表明,msc是亚基与TM三螺旋的homoheptamer (TM1, TM2、TM3)。一个大胞质前庭与七方门户网站和一个远端入口可能充当离子渗透分子预滤器(14- - - - - -18]。msc的电导~ 1 nS和有轻微的偏好阴离子离子渗透(10,11]。

msc显示显著的压敏去极化条件下失活(13,19- - - - - -22]。失活是当一个TM和胞质域之间的静电相互作用是中断(21]。在TM1中精氨酸残基的位置46和74年TM2、分别,msc的预测作为电压传感器的候选人考虑电压门控钠⁺K⁺,Ca^{2 +}频道有一个数组的精氨酸残基特别是第四TM段(S4)携带的大部分控制电荷的电压传感器(23- - - - - -27)(图1)。Arg-54在TM1中也可能容易因为它是嵌入在脂质双分子层膜电压模型结构(28]。然而,这些精氨酸残基的上下文中没有检查压敏失活(13,19- - - - - -21,29日]。

在目前的研究中,我们调查是否三个带电残基(R46、R54 R74)在msc的TM1和TM2领域参与压敏电阻器的失活利用膜片钳技术和低渗的冲击实验。我们的研究结果表明,压敏电阻器失活发生独立的带正电的残留TM msc的域。

2。材料和方法

的大肠杆菌应变PB111( )和MJF455( )用于主机msc表达式在膜片箝和低渗的冲击实验21,31日]。在执行定点诱变基因在pB10b向量mega-primer PCR方法(32]。成功的诱变是由DNA测序验证。突变体在PB111或MJF455表示。

巨大的球形体准备描述(33]。短暂,PB111细胞生长在修改磅(Luria Bertani)中含有0.5%的生理盐水代替1%的氯化钠(11在头孢氨苄的存在(最终浓度:0.06毫克/毫升)。孵化后为1.5 h, IPTG(异丙基-β-D-thiogalactoside)添加(最终浓度:1毫米)诱导msc表达式。诱导时间是10分钟。消化的细胞收获溶菌酶(0.2毫克/毫升),并通过离心收集。

msc的频道活动被记录在由内向外膜块模式的膜片箝技术如前所述32]。吸管的解决方案包含200毫米氯化钾,90毫米MgCl₂10毫米CaCl₂,5毫米玫瑰(pH值6.0),而另外浴的解决方案包含300毫米蔗糖。用注射器负压应用在不同电压(细胞内潜在的对细胞外)从−100 + 40 mV获得msc和MscL的控制阈值。失活过程,评估压力控制使用高速Pressure-Clamp装置(HSPC-1;阿拉巴马州科学本月。Inc .韦斯特伯里,纽约)[34协议后,由Akitake et al。13]。电流放大b AXOPATCH 200放大器(轴突仪器,促进城市,CA),和数据是5 kHz的采样率2千赫低通滤。pCLAMP 9软件(轴突仪器,促进城市,CA)是用于数据采集和分析。msc / MscL控制阈值比率测定压力(正比于膜张力)应用通过补丁吸量管所需的第一通道开放msc和MscL32]。

细胞生存能力低渗的冲击后由先前描述的方法(9,31日,35]。当细胞密度达到OD_600年= ~ 0.15基本培养基,IPTG(1毫米)诱导表达。经过1 h的增长,这些细胞被稀释1:20 prewarmed基本培养基有或没有0.5 M氯化钠。downshock到0 M氯化钠介质应用于细胞为5分钟。downshock后,每个样本磅平皿上传播包含1毫米IPTG和孵化一夜之间在37°C计数集落形成单位的比值。downshock实验每个msc突变体进行了三次。

3所示。结果

候选人精氨酸残基(R46, R54, R74)可能参与电压传感与天冬酰胺代替检查电荷中和的效果。因此,我们生成的三个单突变体(R46N、R54N R74N)和一个双突变(R46N / R74N)。检查这些突变对msc的控制阈值的影响,测量通道活动,同时通过一个补丁应用负压吸管由内向外膜块巨大的球形体表达野生型和突变体msc。图2(一个)显示典型的野生型msc在膜电压的频道活动+ 20 mV。在增加负压,msc首先出现(箭头)。通道电导~ 1 nS。进一步增加负压MscL开放~ 2.5 nS的电导(箭头所指)。msc和MscL分配基于电导和阈值。使用MscL作为内标,msc的阈值是表示为比MscL(msc / MscL)。野生型msc的门槛时不断~ 0.6之间的膜(细胞质)可能是扫描−100和+ 40 mV(图2(b))。每个msc的控制阈值突变(R46N, R54N、R74N R46N / R74N)也不断在这个电压范围0.6 ~。

当E。杆菌细胞暴露于低渗的条件,避免开msc和MscL细胞溶菌作用。一致,大多数MJF455 double-knockout(ΔmscLΔmscS)细胞窝藏空向量(pB10b)没有生存在低渗的冲击从0.5到0 M氯化钠(图2(c))。低渗的冲击实验有利于膜片钳实验的msc活动可以在自然条件下进行评估。当细胞表达msc突变体与低渗的冲击、挑战与野生型阈值没有统计学差异msc (R46N;%,R54N;%,R74N;%和R46N / R74N;%;图2(c)),这表明电荷中和不改变细胞生存的msc活动在一定程度上受到影响。

msc展品突出压敏电阻器在去极化条件下失活(13,19- - - - - -21]。测试是否带正电的中和残留在TM段修改失活,我们记录了失活胞质潜力从-60 + 80 mV。图3(一个)说明了当前野生型msc的频道活动的痕迹(上跟踪)。快速下降通道目前观察+ 60 + 80 mV,而当前的衰变是在负电位明显放缓。R46N msc还灭活+ 60 + 80 mV但不是在负电位(图3(一个),较低的跟踪)。此外,R54N msc、R74N msc, R46N / R74N msc显示快速失活的积极的潜力+ 60 + 80 mV(图S1)网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2401657)。图3 (b)描绘了失活的电压和时间常数之间的关系当一个指数函数拟合。所有msc突变体显示快速电流减少+ 60 + 80 mV速度类似于野生型msc。

在上面的实验中,失活的初始阶段并没有解决,因为它与激活阶段重叠。分离的失活过程激活过程,我们激活msc−20 mV通过应用负压,然后交换膜电位60 + mV(图4(一))。从全开到关闭状态的转变两个指数函数拟合最好在野生型+ 60 mV msc:快和慢的时间常数证券交易委员会和分别交会。这个观察表明,压敏电阻器失活过程有多个流程。当相同的协议应用于R46N msc(图4(一)较低的跟踪),R54N msc、R74N msc, R46N / R74N msc(图S2),当前的衰退速度大致类似于野生型msc。

图4 (b)总结了快速和慢速时间常数的野生型和突变体msc。要么组件在野生型和突变msc之间没有显著差异。以上的观察表明,带电残基在TM域不参与压敏电阻器的失活过程。

4所示。讨论

带正电的数组S4段残留的电压门控离子通道负责压敏电阻器频道活动(23,24]。msc电压的依赖关系也可以归因于在TM1中带正电的残留物和TM227]。在目前的研究中,我们调查了在TM1中精氨酸残基的作用和压敏电阻器TM2 msc的失活。msc的信道特性突变体进行使用膜片箝技术和细胞生存能力测试。对我们的预测,我们发现的正电荷中和TM1和TM2 msc失活电压依赖性的影响很小。

电压传感器的电压门控钠、钾和钙通道包含6 - 7带正电的残留的保守模式(参数或赖氨酸)在他们的S4段(36]。这些指控继续电势梯度的变化在TM域,导致通道控制。Kv通道的控制电荷被估计为每通道(12 - 1337]。另一方面,msc的开放只是弱压敏电阻器,因此浇注的msc估计小每通道(约0.813]。相比之下,msc的失活是更依赖于电压和两个正电荷提出转移(13]。

控制费用至关重要的运动理解压敏电阻器的机制msc的失活。带正电的残留R46、R54 R74预计接近的胞质表面脂质双分子层的封闭的静息状态。一般来说,当超极化去极化条件的膜电位变化,TM螺旋线与正电荷向细胞外端(36]。另一方面,TM1和TM2 msc与膜脂质和疏水残基的两端TM1和TM2提供lipid-protein互动的重要mechanosensitivity [31日]。因此,即使电场改变,TM1和TM2可能移动方向垂直于膜因为紧两端lipid-protein交互的TM螺旋线。这种猜测认为反对这个主意,TM1和TM2继续去极化,但与目前的结果是一致的。

在分子动力学(MD)模拟研究中,中和R46和R74减少孔隙的水合作用,导致电导率的损失,尽管他们是遥远的孔隙(38]。然而,我们的研究结果表明,中和这些带正电的残留物并不影响msc的电导。医学研究发现运动TM1和TM2±100 mV但不是在较小的电压;R46突变体的运动大大减少。这一发现也不适合我们的数据,失活发生在+ 60 + 80 mV,像野生型msc R46N msc使其失去活性。这些差异可能是由于医学研究中使用的晶体结构不同于结构下的脂质双分子层或膜。

各种型号的msc失活过程提出了:(1)收缩的细胞质前庭39),(2)扭结pore-lining之间形成螺旋TM3a TM3b,连接门和细胞质技工(29日),(3)的上表面之间的静电相互作用胞质技工和循环连接TM1-TM2螺旋21]。然而,这些模型将残留在TM1和TM2指控。因此,我们推测,电位梯度不仅在TM领域还存在细胞质,细胞质前厅技工负责msc的电压依赖性失活过程。

总之,我们已经表明,在TM1中精氨酸残基的中和、TM2并不影响拉伸激活和压敏电阻器msc的失活。我们还发现,压敏电阻器失活过程有两个(快和慢)组件。这些组件的结构基础尚未确定。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了教育部的补助金,文化,体育,科学和技术,日本野村证券(Nomura)武(26460300)。

补充材料

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