激活细胞表面绑定20 s蛋白酶体抑制血管细胞生长和Arteriogenesis

文摘

Arteriogenesis是炎症过程与快速变化的细胞包括血管内皮祖细胞(VR-EPCs)居民。细胞外的细胞表面结合20 s蛋白酶体与炎症过程中发挥重要作用。在我们寻找抗原最初监管抵押期间增长马伯CTA 157 - 2对膜分数不断增长的侧枝血管生成。CTA 157 - 2彩色不断增长的侧枝血管内皮细胞表面的VR-EPCs。CTA 157 - 2结合蛋白质复杂(760 kDa)被确认为26 kDaα7和21 kDaβ3单元20 s蛋白酶体在质谱分析。此外我们演示了20年代的特定染色后蛋白酶体免疫沉淀反应VR-EPC膜提取与CTA 157 - 2琼脂糖珠。功能,CTA 157 - 2增强浓度依赖性AMC (7-amino-4-methylcoumarin)从LLVY劈理(N20年代-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr)重组蛋白酶体以及VR-EPC提取蛋白酶体活动。VR-EPCs扩散(BrdU公司)是减少CTA 157 - 2。注入抗体进入动脉侧枝循环减少数量的抵押,抵押物扩散,抵押品电导体内。最后我们的结果表明,细胞外的细胞表面绑定20 s蛋白酶体影响VR-EPC函数在体外和抵押品增长体内。

1。介绍

血管可塑性在血管生成和arteriogenesis(抵押品的增长从先前存在的小动脉的动脉吻合)需要快速适应的内皮细胞和平滑肌细胞缺氧等环境变化和剪切力1- - - - - -3]。因此现场蛋白质周转的重要。ubiquitin-proteasome通路参与了大部分监管机制的及时响应是必需的,大概是因为它提供了极高的底物特异性和能够迅速改变蛋白质水解的速度(4]。一个例子是缺氧诱导转录因子的调节低氧诱导因子1α,起着重要的作用在血管生成(5- - - - - -7]。

而氧张力血管生成过程中发挥着重要作用的发展既存的小动脉的动脉或动脉吻合为抵押品(arteriogenesis)主要是由当地hemodynamical力量的变化,导致快速适应小动脉的吻合通过明显的形态学变化(1,2,8]。最大扩散期间观察到的第一个感应三天后血液流动相关的狭窄和明显的积累激活巨噬细胞。第一个细胞变化可见感应后24小时内血液流动的相关狭窄,这表明分子发生反应迅速(8- - - - - -10]。

Arteriogenesis抵押品(增长)从而是自己的一个实体,明显区别于血管生成,毛细血管的萌芽8- - - - - -11]。

除了循环细胞组织居民最近的研究表明一个重要的角色在产后新血管形成血管祖细胞(10,12- - - - - -15]。CD133⁺多能细胞被发现在肝、肠、肌肉和外分泌腺(14]。在心脏组织、心血管祖细胞被发现从Flk-1积极开发干细胞群(16]。我们之前证明担保增长与居民血管周的细胞的增殖和分化相关建议组织居民细胞发挥主导作用在成人新血管形成(17]。

在这项研究中,我们踏上了寻找监管元素尤其是细胞的膜上的抵押品增长水平可能解释血管细胞的快速适应在抵押品增长的初始阶段。arteriogenesis我们利用一个模型的大鼠后肢,允许我们识别和隔离一个抵押品,血管诱导后早期的增长(8]。这个抵押品动脉是用于所有生化和组织学分析除了那些实验孤立血管祖细胞居民在文化利用材料和方法和结果部分中描述。基于单克隆抗体的生成膜制剂的抵押品,血管和免疫组织化学检查选择性我们生成一个单克隆抗体(CTA 157 - 2)绑定到细胞膜的细胞增长的侧枝血管的内皮细胞以及孤立的血管内皮祖细胞(VR-EPCs)居民最近我们组的(18]。有趣的是CTA 157 - 2被发现绑定并激活细胞外蛋白酶体。此外,抗体减少VR-EPCs扩散在体外和抵押品增长在活的有机体内指向一个重要的功能作用,细胞表面结合蛋白酶体在血管内皮祖细胞增殖的居民和抵押品的增长。

2。材料和方法

所有调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)的8节和德国法律保护动物。除了免疫在活的有机体内实验进行男性雄性sd大鼠中(体重200克,查尔斯河实验室,德国)在全身麻醉下如前所述详细(8]。

2.1。代的抵押品抗体CTA 157 - 2

抵押品膜蛋白质组,25雄性SD大鼠。正确的SD大鼠股动脉结扎麻醉如前所述[8]。股动脉闭塞后动物是被十二个小时。抵押品动脉被确定使用后期血管造影术(如前所述)(8),切除和冲击冻结。我们先前的实验表明,没有信使核糖核酸或蛋白质的降解发生在这个过程。抵押品动脉被均质膜制动缓冲包含50更易与三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7 5 0,MgCl 32 M蔗糖,3毫米₂10毫米碘乙酰胺,叠氮化钠0.02%,5更易与EDTA,蛋白酶抑制剂(所有试剂:σ;美国圣路易)。他们在1000 g离心两次和4°C。蛋白质浓度的上层的决心和离心机100000克,4°C 1 h。

最初产生的抗体是根据标准协议所描述的诺贝尔奖获得者科勒和Milstein19]。三个C57 / B16转椅(体重20克,查尔斯河实验室,德国)用于免疫小鼠。麻醉诱导了腹腔注射氯胺酮(100毫克/公斤的身体wt Atarost)和2%甲苯噻嗪(5毫克/公斤的身体wt,拜耳)。C57 / B16转椅小鼠免疫膜制剂的抵押品动脉TiterMax佐剂(σ;美国圣路易斯)×3腹腔内注射每隔2周。第四个终端提升两天后,脾脏被收获和淋巴细胞融合与SP2 / O小鼠骨髓瘤细胞如前所述[20.]。我们筛选和克隆选择使用cryosections激活抵押品动脉和控制船只。

为在体外和在活的有机体内调查,抗体纯化使用亲和力Pak固定化Protein-L列(美国罗克福德皮尔斯)根据制造商的指示。

免疫组织化学染色的增殖络脉执行和控制nonproliferating血管如前所述[8]。双重染色,CTA 157 - 2与NHS-Rhodamine(美国罗克福德皮尔斯)使用协议由制造商提供。

2.2。隔离和成人血管细胞居民的文化

大鼠血管居民细胞像之前描述的那样孤立(18]。简单地说,老鼠的心脏灌注体外Krebs-Ringer缓冲区包含0.06%胶原酶。心脏微脉管系统收集的细胞被再循环介质。标准的细胞培养条件下细胞生长使用杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺和抗生素。汇合的单层膜是分离通常1:4洗后与trypsin-EDTA PBS和治疗。所有的试剂都从英杰公司购买(德国卡尔斯鲁厄)。

2.3。单独分析

排序后,CTA 157 - 2阳性细胞与DMEM培养+ 10% FCS。当达到80%融合、细胞分离和按DAKO Cytomation MoFlo高速细胞分选仪(DAKO、丹麦)和单个细胞被放置在一个96孔板。细胞生长每天检查和清点了eclipse TS100尼康显微镜(日本尼康)。7天后,井与集落形成单位选择和亚文化进行进一步研究。

2.4。为免疫组织化学染色和流式细胞仪分析

2.4.1。抗体

主要的抗体是anti-vimentin (V9) (Dianova,汉堡,德国);anti-PI3-kinase p85(美国纽约北部);山羊anti-paxillin (C-18)多克隆抗体(圣克鲁斯;美国CA);山羊anti-plectin (C-20)多克隆抗体(圣克鲁斯;美国CA);山羊anti-vinculin多克隆抗体(圣克鲁斯;美国CA);鼠单克隆anti-p抗体(Abcam,剑桥,英国);和多克隆兔anti-bovine 20 s蛋白酶体抗体(酶、旧金山、钙、美国)。

进行二次染色与FITC-coupled山羊anti-mouse或驴抗体抗体(Dianova,汉堡,德国)。光显微镜分析二次染色进行了过氧化物酶耦合山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse抗体(Dianova,汉堡,德国)。启示进行了使用轻拍(3,3′-diaminobenzidine)。用苏木精复染色光显微图像进行。

2.4.2。免疫组织化学

如前所述(执行在组织切片免疫组织化学8]。在免疫组织化学双标签和流量仪结果CTA 157 - 2与NHS-Rhodamine(皮尔斯,罗克福德,IL)或NHS-Dye 680 (MoBiTec),分别使用协议由制造商提供。固定后的细胞与乙醇70%在pH值2或丙酮:甲醇1:1其次是阻止1% FCS在PBS他们接受初级抗体45分钟37°C。二次抗体在孵化了45分钟37°C。核沾染了1μ33342 g / mL赫斯特(Cambrex, Verviers,比利时)。双染色法分析了用共焦激光扫描显微镜(蔡司、从、德国)。染色与标记CTA之前或之后执行157 - 2表示透化作用。

2.5。色谱净化VR-EPCs膜蛋白质

膜分数通过离子交换色谱法分离源30问列(运行缓冲:50更易Bis-Tris pH值6.5,特里同0.25%;洗脱缓冲:50更易Bis-Tris pH值6.5,0.25% Triton, 0.2, 0.3, 0.5,和2 M氯化钠;法玛西亚生物技术,德国弗莱堡)。分数被收集和检测抗体绑定nondenaturing slot-blot。积极使用Superdex分数进一步通过凝胶过滤分离三角帽200小时10/30列(运行缓冲:20更易Bis-Tris pH值6.5,60更易与生理盐水;Amersham生物科学,乌普萨拉,瑞典)。积极的分数通过高液相色谱进一步分离一个迷你问三角帽列(运行缓冲:20更易Bis-Tris, pH值6.5 50更易与生理盐水;洗脱缓冲50更易Bis-Tris, pH值6.5,2 M氯化钠的线性梯度从0到50%;法玛西亚生物技术,德国弗莱堡)。积极的分数是10% SDS页面上运行。

2.6。质谱(MS)

蛋白质斑点去掉,德勤的蛋白质减少,与碘乙酰胺半胱氨酸残基被修改,蛋白质凝固态与胰蛋白酶消化(修改胰蛋白酶,Promega)。消化的提取肽凝胶后,脱盐在C18mZipTip(微孔),筛选了1μL 60%甲醇/甲酸5%,分析nanoelectrospray质谱在QTOF II (Micromass,曼彻斯特)工具。MS / MS谱得到collision-induced碎片肽进行评估的吉祥物MS / MS离子搜索算法(矩阵科学、伦敦)。

2.7。蛋白酶体活性测定

20年代蛋白酶体活性测定使用20 s蛋白酶体活性试验装备根据制造商提供的协议(Chemicon International Inc .,泰梅库拉,CA)。10μg重组20 s蛋白酶体是用不同浓度的CTA 157 - 2和IgM控制(0、4、8、10、15、20毫克/毫升,resp)以及lactacystin(0、0.75、1.5、3和6μg / mL, resp)。在室温下15分钟前添加蛋白酶体衬底(Suc-LLVY-AMC)。后来样本孵化2 h 60°C和荧光记录荧光计使用355/460滤波器组。蛋白酶体活性的蛋白酶体底物裂解总量是计算从标准曲线和相关的零值之间的比较实验。共有8个独立的实验。

2.8。免疫沉淀反应和染色第二多克隆兔Anti-Bovine 20 s蛋白酶体抗体

纯化CTA 157 - 2(5 - 10毫克/毫升)抗体溶解在0.1 NaHCO₃缓冲区包含0.5 M氯化钠,pH值8.4(绑定缓冲1)。溴化氰活化树脂(σ化学品,圣路易斯,密苏里州)是清洗和肿胀在寒冷的1毫米HCl至少30分钟,洗在蒸馏水洗涤缓冲的耦合和转移到抗体所描述的解决方案的制造商。抗体和胶体混合在一夜之间在4°C。未反应的抗体被冲走绑定缓冲和未反应的组织与0.2%甘氨酸pH值0.8被封锁在室温下2小时。屏蔽解决方案被通过洗涤绑定缓冲1,然后与醋酸缓冲(0.1米。pH值4,含有氯化钠0.5米)。CTA 157 - 2耦合琼脂糖珠是平衡与TNT缓冲区包含三羟甲基氨基甲烷1 M液pH值7.4,氯化钠5 M,特里同10%,蛋白酶抑制剂。CTA 157 - 2阳性细胞也被溶解在TNT缓冲与非耦合溴化氰preincubated珠子与CTA孵化之前,157 - 2一夜之间耦合的琼脂糖珠在4°C。孵化后的珠子是离心机和洗了三次TNT缓冲区之前让他们凝胶电泳和免疫印迹。阻塞后,墨迹孵化了一种多克隆兔anti-bovine 20 s蛋白酶体抗体(酶、旧金山、钙、美国)。启示与发射极耦合逻辑进行孵化后过氧化物酶耦合的山羊anti-rabbit抗体如上所述。 For control experiments a control IgM antibody was linked to the resin. All experiments were performed on cellular extracts of CTA 157-2 positive and CTA 157-2 negative cells.

2.9。西方的屁股

VR-EPCs均质在裂解缓冲(细胞信号,麻萨诸塞州,美国)含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,蛋白质含量是由洛瑞化验(BioRad,德国)。样本10% PAGE-SDS凝胶分离。转移到硝化纤维膜后,样品被封锁在5%白蛋白和孵化主要抗体在室温下2小时。与PBS 4洗涤步骤后,膜与peroxidase-conjugated孵化二级抗体(Dianova,汉堡,德国)。最后,使用化学发光检测进行系统(通用电气医疗集团,德国)。

2.10。流仪分析

为流仪分析CTA 157 - 2抗体与NHS-Dye 680 (MoBiTec、哥廷根、德国)使用协议由制造商提供。与PBS VR-EPCs收获,洗,孵化与抗体一小时。最后,细胞被固定和分析流式细胞分析仪(美国正欲FACSCalibur)。,正欲为量化我们使用天后软件(美国)。

2.11。在体外和在活的有机体内评价VR-EPCs函数使用CTA 157 - 2单克隆抗体

CTA 157 - 2和控制IgM抗体(10μg / mL)被添加到培养基subconfluent VR-EPCs。2天之后,评估在体外使用BrdU流扩散进行了如前所述工具包(德国PharMingen GmbH)。孵化后溴脱氧尿苷(BrdU, 0.3毫克/毫升)2小时,积极BrdU细胞的数量清点了流式细胞仪(美国正欲FACSCalibur)如前所述[21]。总共5个独立的实验。为在活的有机体内进行了化验,股动脉遮挡。CTA 157 - 2(0.1毫克/毫升10点μL / h)以及承运人就直接注入到侧枝循环通过渗透微型真空泵(美国ALZET)。7天后,扩散的抵押品动脉被BrdU标记和检测设备检测到2(罗氏诊断、德国)如前所述8),增殖指数计算BrdU-positive核的数量总数血管壁内的核(每组)。后期血管造影术(每组)获得股动脉闭塞后的7天内如前所述使用远端下肢的后期灌注与钡造影剂和博览会基于单一纸(X-OMAT MA包装电影厘米、柯达、法国)x光室(Faxitron x射线合作,43855 d模型,美国)。

2.12。抵押品扩散

抵押品扩散(每组)检测细胞7天后政府如前所述BrdU标记和检测装备2(罗氏诊断,德国)。

2.13。确定抵押相关的电导

总依赖抵押品电导的测量进行股动脉闭塞后一周在麻醉动物。为了确定担保电导先前建立和验证方法对兔后肢适应研究在大鼠后肢侧枝血管的功能最大的血管舒张(22]。我们确定总担保相关的电导而不是纯粹的抵押品电导因为由于动物大小位置的压力传感器远端侧支循环扭曲了压力和血流量测量大鼠后肢。而且它已经表明,总依赖抵押品电导反映抵押品电导股动脉闭塞后第一周内(22,23]。系统性血压、相同的血压,测量创通过导管置于颈动脉和连接到压力传感器(FME TBD1220,爵士。2955号;医疗器械)。静脉血压测定通过1.4 f米勒ultraminiature压导管(医疗器械),插入到颈静脉腔静脉和先进优越。抵押品血流决心通过超声波流量探头(跨声速流探测器,v系列;风格:0.7毫米,探针:0.5公安局263年跨声速系统公司美国纽约)放置在抵押品茎地区(髂总动脉)和连接到各自的流量计(传感器Ts 420年渡越时间血管周的流量计跨声速系统公司,纽约,美国)。测量最大下进行血管舒张使用腺苷增加浓度从15到300μ克/公斤每分钟通过导管插入左颈动脉分叉如前所述和先进。所有测量数据记录在电脑上在线使用MacLab接口(PowerLab;UmacLab)。总依赖抵押品电导计算如前所述间接血流量除以动静脉压差(22]。

2.14。统计分析

所有的细胞培养和生化分析在至少3独立重复实验。数据显示为±SEM。统计比较两组与双尾学生的表现以及。多个组间比较和方差分析应用在必要时紧随其后的是事后分析。差异意味着时被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。单克隆抵押品针对IgM抗体(CTA) 157 - 2污渍尤其是动脉内皮细胞增殖的抵押品

单克隆抗体的免疫组织化学检测了膜制剂抵押品动脉显示抵押品针对IgM抗体(CTA) 157 - 2尤其是彩色增殖抵押品动脉的内皮表面(数字1(一)- - - - - -1 (d))。其他组织如神经组织和其他大型船只也染色虽然在一个非常低的水平。染色在这些情况下似乎局限于细胞内的空间。因此这种抗体似乎特别适合小说在抵押品球员增长的识别和选择进行进一步分析。

3.2。细胞外膜血管居民内皮祖细胞的染色CTA 157 - 2展示了通过流仪分析

使用流仪分析我们能够证明CTA 157 - 2彩色的细胞膜抗原存在血管内皮祖细胞(VR-EPCs)居民,以前是在彻底的特点是我们组(18)(图1 (e))。这些细胞含有BrdU荧光显微镜和沾CTA 157 - 2前透化作用其次是透化作用和染色的BrdU演示了一个焦点分布抗原的增殖细胞(图1 (f))。这种染色模式与染色总20 s蛋白酶体显示主要是细胞内细胞核周围的分布如前所述[4)(图1 (g))。侧枝血管的组织切片这主要是胞内蛋白酶体中主要是血管周的细胞,巨噬细胞可能已知的担保期间积累增长(图1 (h))。

3.3。CTA 157 - 2污渍700 kDa抗原识别为蛋白酶体内皮细胞膜色谱净化后分数

在我们试图识别抗原染色CTA 157 - 2我们不得不学习,SDS即使在低浓度抑制绑定的CTA 157 - 2抗原表明这种抗体检测蛋白质三级结构(图2(一个))。因为这个原因古典西方的屁股不能执行和古典方法c-DNA表达的蛋白质鉴定,如筛选库被认为失败。膜制备的纯度与抗体染色后确认CD 54岁的膜结合细胞粘附分子,可溶性包裹胞质蛋白免疫印迹。只有膜分数表达CD 54而包裹只是在胞质分数(图中找到2 (b))。我们测试了膜的溶解性的复杂分数使用不同的洗涤剂和能够证明复杂的可溶性已经与氯化钠的一部分。只有非离子两性离子洗涤剂像皮套裤,特里同,或者三,离开膜蛋白质的三级结构完整,允许CTA 157 - 2检测抗原表明antigen-binding网站代表了一个三级蛋白质结构可能由几个子单元(图2 (c))。这也表示相当的强烈依恋抗原检测到CTA 157 - 2的膜分数。抗原后终于确定色谱净化膜制剂的流值细胞。凝胶过滤膜分数表明抗原有大小约700 kDa(图2 (d))。使用离子交换层析进一步纯化抗原后分为几个子单元SDS页面被识别为26 kDaα7和21 kDaβ3单元使用质谱(图20 s蛋白酶体2 (e))。这些是唯一鼠蛋白质测序从最终CTA 157 - 2正分数表明纯化策略是成功的。

3.4。免疫沉淀反应生成与CTA 157 - 2被确定为20 s蛋白酶体与多克隆兔Anti-Bovine 20 s蛋白酶体抗体对西方的屁股

第二个独立的证据是,CTA 157 - 2绑定20 s蛋白酶体是细胞免疫沉淀反应后生成的提取与CTA 157 - 2共价链接到sepharase珠子。染色后的免疫沉淀反应提取凝胶电泳印迹和第二多克隆兔anti-bovine 20 s蛋白酶体抗体显示一个乐队在23岁kDA对应于20年代蛋白酶体亚基报道与这个特定的抗体(图染色2 (f))。这个乐队不是细胞提取物中发现与控制IgM和免疫沉淀反应后才可见VR-EPC免疫沉淀反应的细胞提取物而不是细胞提取物控制细胞不表达抗原在流式细胞仪分析(图2 (f))。

3.5。CTA 157 - 2结合纯化20 s蛋白酶体,导致其激活

我们此外CTA显示功能的影响在蛋白酶体157 - 2在测试不同浓度的CTA在AMC乳沟LLVY 20 s蛋白酶体。CTA 157 - 2专门和浓度依赖性激活可重复20 s蛋白酶体(图3(一个))。我们可以排除这个激活是由于未指明的IgM(图的影响3 (b))。的功能分析证实了已知的蛋白酶体抑制剂lactacystin(图3 (c))。

3.6。CTA 157 - 2抒发纯化膜分数VR-EPC的蛋白酶体活动

为了证实蛋白酶体活性存在于细胞膜我们测试了不同的膜蛋白浓度的影响在AMC乳沟LLVY有无CTA 157 - 2刺激。按照先前的报道我们不能发现任何重要的蛋白酶体活性没有刺激。与CTA 157 - 2刺激,然而,我们能够检测浓度依赖的蛋白酶体活性的纯化细胞膜(图3 (d))。

3.7。通过马伯CTA 157 - 2抑制蛋白酶体活化浓度依赖性VR-EPC增殖在体外

在体外CTA 157 - 2减少VR-EPCs扩散浓度依赖性(数字4(一)和4 (b):(IgM控制)和(CTA 157 - 2),在120μg / mL)。

3.8。通过马伯CTA 157 - 2抑制蛋白酶体激活间接扩散在活的有机体内

为了研究蛋白酶体活化的影响对抵押品增长我们使用在抵押品动脉CTA 157 - 2抗体增长模式之前被我们组(8,17,23]。与注入的IgM抗体控制当地注入CTA 157 - 2抗体降低抵押品,增殖和形成动脉在后期血管造影术(数字5(一个)和5 (d):增殖指数CTA IgM 157 - 2与控制:与,;数据5 (b),5 (c),5 (e):数量的可见的侧枝血管CTA IgM 157 - 2和控制与;)。而且我们能够证明在功能层面上注入CTA 157 - 2减少总担保的股动脉闭塞后电导比控制(图5 (f):总担保电导的箱线图毫升/分钟/ 100毫米汞柱:CTA IgM 157 - 2与控制:毫升/分钟/ 100毫米汞柱和61±0.2毫升/分钟/ 100毫米汞柱,)。

4所示。讨论

在这项研究中我们证明transmembranous蛋白酶体激活控制血管内皮祖细胞增殖和抵押品的增长。我们调查的主要工具是生成的单克隆抗体CTA 157 - 2对膜制剂的侧枝血管,试图找出小说膜结合球员抵押品的增长。抵押品倾向抗体CTA 157 - 2被选中,因为它主要是彩色增殖侧枝血管的内皮细胞,100%的VR-EPCs流仪分析,并显著抑制扩散的浓度依赖性在体外。我们此外能够证明这种抗体注入显著抑制抵押品的增长与注入IgM抗体的控制。

尽管挑战抗体和抗原的性质受这种抗体的证据我们设法获得四行CTA 157 - 2与细胞膜结合并激活蛋白酶体。催化剂和抑制剂已被证明调节20 s蛋白酶体在体外(4]。一些催化剂如PA 28绑定到结束的桶形蛋白酶体复杂和刺激肽酶活动。也似乎可能CTA 157 - 2结合20 s蛋白酶体的末端和模拟激活函数(4]。

更重要的是我们能够证明CTA 157 - 2的结合位点是在细胞外表面暴露的血管细胞膜通过流仪和免疫组织化学的分析impermeabilized VR-EPCs。蛋白酶体的主要部分是位于核和胞质间也早已认识到蛋白酶体是与细胞膜(24]。革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)组成部分已被证明特别绑定到20年代水解酶在小鼠巨噬细胞的细胞膜25]。水解酶的存在在细胞膜表面的进一步报道在人类T和B淋巴细胞(26]。20年代蛋白水解活性蛋白酶体也检测到肺上皮衬里液的急性呼吸窘迫综合征患者(27]。最近,它表明,功能活跃20 s蛋白酶体可以导出从激活免疫细胞的微粒子28]。虽然细胞外蛋白酶体是升高的炎症过程的报道在炎症过程中其功能角色是稀缺的。

炎症过程是arteriogenesis强连通。特别是巨噬细胞聚集和激活已被证明对抵押品增长起着非常重要的作用[8- - - - - -10,17,29日]。许多报告表明,蛋白酶体活动是由旁分泌信号。例如,它已经被证明,细胞对细胞外基质产生蛋白酶体降解的细胞周期蛋白依赖性激酶2抑制剂p 2130.]。然而,据我们所知,这是第一个报告演示的功能作用细胞外20 s蛋白酶体祖细胞功能和血管的生长。先前的研究表明,抑制蛋白酶体减少血管生成和血管细胞的生长,这乍一看似乎与我们的研究结果(31日,32]。然而这些研究调查的影响蛋白酶体在血管生成,毛细血管的萌芽,在其机制从arteriogenesis大大不同,和抵押品的增长从先前存在的小动脉的动脉吻合(10,11]。而且这些研究主要针对蛋白酶体在核和细胞质隔间使用不同的抑制剂和方法而马伯CTA 157 - 2只绑定到细胞外室在体外和在活的有机体内。出于同样的原因,它似乎违反直觉的使用蛋白酶体抑制剂如lactacystin在细胞培养或在测试我们的假设在活的有机体内实验,因为它的目标蛋白酶体在不同的隔间和在不同的细胞。据我们所知没有具体目标细胞外的其他代理,分别transmembraneous蛋白酶体除了马伯CTA 157 - 2。

在这种背景下,有趣的是,soc箱蛋白5 (asb5)之间充当桥梁具体substrate-binding域和E3泛素蛋白连接酶曾被证明是调节在日益增长的侧枝血管33]。然而这ubiquitin-proteasome系统的一部分功能的影响血管细胞增殖或抵押品增长直到现在还没有证明。而且它是表明adenoviral PR39转染,蛋白质,提高低氧诱导因子- 1α- (HIF-1α)选择性地抑制蛋白酶体降解相关基因表达的转录因子,改善血流和心肌功能在猪模型提高担保形成的慢性心肌缺血(7]。

5。结论

我们的研究增加了进一步的证据认为ubiquitin-proteasome系统起着决定性的作用在调节抵押品20年代增长,表明细胞外蛋白酶体不仅是释放细胞还在生理过程中扮演一个功能性的角色。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢太太Juliane伯格曼优秀技术援助和有益的讨论。这项工作是支持由德国研究基金会(DFG) IT-13/1 IT-13/2,和IT-13/3 (W.D. Ito)和Klinikum雷希特der Isar,慕尼黑工业大学(H.-G。麦臣)。紫阳Zhang博士是一位国际奖学金接受者从中国奖学金委员会。

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