大豆蛋白的结构和抗氧化活性Isolate-Dextran TiO获得的配合₂光催化作用

文摘

本研究的目的是调查的结构特性和抗氧化活性的大豆分离蛋白(SPI)右旋糖酐TiO获得的配合₂光催化处理。结果显示,紫外可见吸收和荧光强度随着光催化能力的增加增加()。更高的光催化能力可以促进糖化的程度,形成高分子量SPI-dextran轭合物,这就是自由氨基含量和钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)分析。傅里叶变换红外(ir)光谱表明,酰胺我II, III的SPI被TiO糖化诱导的改变₂光催化作用。此外,二级结构的重大变化发生在SPI-dextran共轭。的α螺旋,β表,β结果,随机线圈从大约10.6%,37.9%,12.9%,38.6%,3.8%,10.4%,17.7%,和68.8%,分别在治疗后1000 W的光催化能力。此外,SPI-dextran TiO获得的配合₂光催化处理表现出高羟基自由基清除活性和具有还原能力增加。所有数据表明TiO₂光催化是一种有效的方法促进protein-polysaccharide copolymerisation。

1。介绍

许多修改技术,如烷基化、酯化amidination, deamidination,共价连接的碳水化合物和脂肪酸,thiol-disulfide交换和酶法改性可以有效改善蛋白质的功能性质1]。对protein-polysaccharide配合,产品的非酶的褐变反应的一个主要食物蛋白质修改热食品加工过程中产生的反应,会引起明显的香气,味道,和颜色,以及存储和加工食品的抗氧化潜力(2]。此外,美拉德产品可以添加到食物功能成分改善乳液,凝胶,外观,质地的食品(3]。然而,protein-polysaccharide糖化反应是耗时的,很难控制反应过程在使用古典糖化反应,如干燥的加热方法和湿加热方法(1,4]。因此,有必要找到一种新的技术来提高糖化反应的效率。

新颖的物理技术如γ辐照(5和脉冲电场6和高强度的超声波7]研究了全部或部分替代传统的热处理,因为这些技术可以大大加快糖化反应,提高蛋白质的功能性质。越来越多的科学兴趣的影响光催化合成的化合物改善性能。光催化作用提供了一个绿色化学路线有机官能团转换在温和的条件下。在过去的二十年里,它已经成功地应用于有机合成,如聚合羟基化的芳香,氧化胺,烯烃的环氧化反应、羰基化反应(8- - - - - -12]。介绍了在这些反应中,没有其他化学试剂,不需要控制温度,并缩短反应时间。然而,TiO的效果₂光催化在糖化反应几乎没有被报道。因此,本研究旨在准备SPI-dextran共轭TiO引起的₂光催化处理和评价抗氧化活动和由此产生的轭合物的结构变化。

2。材料和方法

2.1。化学物质

右旋糖酐(MW: 60000 - 90000)是购自Chanshou生物有限公司,有限公司(Jiashu省,中国)。SPI是获得美妙的技术。有限公司(山东,中国),包含(干基)6.5%的水分,灰分1.0%,脂质0.2%,90.2%的蛋白质(由凯氏法、N×6.25)。1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) o-phthaldialdehyde (OPA)和8-anilino-1-naphthalenesulfonic酸(ANS)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。丙烯酰胺(99%)购买从σ(Deisenhofen、德国)和羟甲基糠醛(98%)是在穿越(Geel、比利时)。所有其他化学物质均为分析纯和采购从默克公司(达姆施塔特,德国)。

2.2。制备SPI-Dextran轭合物

进行了光催化结合在50毫升圆柱形玻璃容器固定在XPA-II光化学反应器(南京Xujiang机电厂发展)。过滤系统由一个家庭制作过滤器安装在灯消除红外辐射和紫外线过滤器可以吸收光波长小于400纳米。大豆蛋白的混合物和右旋糖酐的重量比1:1是溶解在20毫米磷酸钾缓冲(pH值8)。然后,3 h的解决方案是搅拌在一个环境温度直到大豆蛋白和右旋糖酐完全溶解。溶液的pH值调整到8.0加上0.1 N盐酸或0.2 N的氢氧化钠。SPI-dextran解决方案已经准备好光催化反应测试。对于每个测试,20毫升酱油protein-dextran解决方案是放置在一个50毫升夹套容器的恒流°C循环水0.6升/分钟的速度保持样本的温度低于40°C。SPI-dextran解决方案治疗的光催化能力500 (TP1)和1000 W (TP2) 2 h。作为对比,热治疗样本准备下°C 2 h的大豆protein-dextran混合物(控制样本)。所有样品都保持在4°C化学分析在24 h或冻干然后储存在−20°C进行进一步分析。更多细节可以光催化反应器中发现的13]。

2.3。分光光度分析和Spectrofluorimetry测量

的紫外线吸收和布朗宁SPI-dextran配合测量根据饶的方法等。5]略微修改。294年20倍稀释测定样品的吸光度和420海里以稀释样品,uv - 2550分光光度计(日本岛津公司,日本京都)检测紫外线吸收和褐变强度,分别。荧光测量进行使用F4500 fluorescence-spectrophotometre(日本日立有限公司)。糖化产品测量的荧光的激发波长290 nm和发射波长300 - 450纳米的蛋白质样品的0.5μ在20毫米磷酸钾缓冲(pH值7.2)。

2.4。确定自由氨基酸组的内容

自由氨基酸组的内容是由OPA方法。OPA试剂准备根据Caillard et al。14]。OPA(80毫克)溶解在乙醇和2毫升95%和50毫升0.1四硼酸钠缓冲溶液pH值9.5,5毫升的20% (W / V) SDS,和0.2毫升2-mercaptoethanol。与水的混合物被稀释为形成OPA试剂100毫升。OPA试剂是刚使用前准备的。1毫升OPA试剂添加到50μL制备蛋白质—葡聚糖共价物处理的大豆和在黑暗中孵化2分钟35°C,并立即吸收在340纳米测量为了获得自由氨基酸组。

2.5。氢氧自由基清除活性和还原能力测定

羟基自由基清除活性SPI-dextran配合决定根据你的方法等。15]。600年的μ1 L, 10-phenanthroline(5.0毫米),600年μL (FeSO₄(5.0毫米),600μL(乙二胺四乙酸(EDTA)与400年(15毫米)混合μL钠磷酸盐缓冲剂(0.2米,pH值7.4)。600μL样本(2.0毫克/毫升)和800年μL H₂O₂(0.01%)补充道。混合物在37°C 60分钟,孵化和吸光度测量536海里(UV754,仙剑科学仪器有限公司,上海,中国。结果决定使用以下方程: 在哪里样品的吸光度,是空白溶液的吸光度用蒸馏水代替样本,然后呢的吸光度控制解决方案没有H₂O₂。

接合的还原能力是决定根据郑的方法等。16与一些修改)。短暂,2.0毫升的样本和2.0毫升0.2钠磷酸盐缓冲剂(pH = 6.6)和2.0毫升的1% (w / v)铁氰化钾。的混合解决方案是在50°C的环境中20分钟紧随其后的2.0毫升的10%三氯乙酸。的混合物在3000 r / min离心10分钟。2.0毫升上层清液的收集和混合2.0毫升蒸馏水和0.4毫升的0.1% (w / v) FeCl₃。站在室温下10分钟后,反应混合物的吸光度测定spectrophotometrically 700海里。同等体积的蒸馏水代替使用的示例是空白。增加反应混合物的吸光度表示增加还原能力。

2.6。电泳

SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)检查垂直凝胶电泳设备(Mini-Protean II;Bio-Rad实验室、里士满、CA) (17]。样例(10μg)添加laemmli缓冲区的2%β巯基乙醇在100°C和加热5分钟之前加载到凝胶。电泳是15马使用4%叠加的恒流运行凝胶凝胶和10%。分离后,凝胶沾0.2%考马斯亮蓝r - 250 25%甲醇和10%醋酸。使脱色进行了用40%甲醇和10%醋酸溶液。然后,凝胶进行扫描和分析。

2.7。傅里叶变换红外(ir)测量

使用傅立叶变换红外光谱技术的红外分析描述的方法显示高et al。18]略微修改。FTIR光谱测量在傅立叶变换红外光谱仪(NICOLET NEXUS470,壳体)4厘米⁻¹波数之间的分辨率和32扫描4000厘米⁻¹和400厘米⁻¹。冻干样本准备与溴化钾磁盘1毫克的100毫克的溴化钾的样本。背景噪音与纯溴化钾修正数据。光谱是平均和平滑,和他们的基线校准光谱管理软件(Jasco Inc .)、伊斯顿,医学博士,美国)。

2.8。CD光谱测量和CD谱分析

蛋白质的二级结构是由CD在远紫外25°C(从190年到250海里)使用CD6 Jobin-Yvon dichrograph。光谱被记录在蛋白质浓度为0.5毫克/毫升20毫米PBS (pH值7.2)在5000×g离心后删除任何不溶残渣用2毫米路径长度石英试管。二级结构估计使用CONTIN软件。四个二级结构:α螺旋,β表,β把无序的线圈,计算。资料一式三份的方法测量。

2.9。统计分析

所有的分析都是一式三份,数据报告为±标准差。变量之间的差异是由单向方差分析测试的意义伴随着图基的事后测试使用起源7.5。的值被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

3.1。的变化、褐变强度和荧光强度

的变化和褐变强度SPI-dextran模型的解决方案不同的光催化功率如图1。这两个(褐变明显变化)在500年和1000年的光催化能力W 2 h。的SPI-dextran解决方案从大约0.28增加到0.84和1.06的光催化能力500和1000 W,分别;在的情况下,它从大约0增加到0.21和0.36在500年和1000年W光催化能力,分别。棕色的颜料发展,所示,恰逢无色中间增加形成证明了这一点,这表明棕色色素形成平行于生成的中间产品。然而,更高的增长,比较增加表明,高的光催化能力可以主宰美拉德反应的早期阶段。一般来说,我们希望减少类黑色素的形成,增加的产量未着色的产品更好的功能性质。

美拉德反应也与荧光化合物的发展有关。在目前的研究中,观察荧光化合物的形成在photocatalyzed SPI-dextran解决方案建议的形成产生的共轭。Photocatalyzed样本显示增加荧光与最大值约331海里兴奋时290海里源自糖化产品。美拉德产物的荧光SPI-dextran最高的解决方案在1000 W(图的光催化能力2),按照光谱光度测量的测试样本的属性。结果表明,光催化可以导致糖苷键的断裂右旋糖酐和更多数量的羰基化合物可用于SPI-dextran共轭的形成,引起类似辐照导致明显增加紫外线吸收和荧光5]。

3.2。自由氨基含量的变化

变化在自由氨基SPI-dextran解决方案的内容在不同的光催化能力治疗是描绘在图3。自由氨基酸组内容SPI-dextran模型系统在500年和1000年W的光催化能力降低了14.7%和21.1%,分别,而小变化观察控制测试。这些结果表明,光催化在更高权力可以促进SPI的自由氨基基团之间的相互作用和右旋糖酐形成糖化产物羰基。的结果,很明显,自由氨基的下降是依照只增加少量布朗宁在420纳米(图1),这是按照报告的徐et al。19)报道,自由氨基酸组β-conglycinin-dextran模型系统是在美拉德反应有所下降。因此褐变反应的光催化效果和自由氨基酸的损失组织实际上是理想的糖化蛋白质和多糖。

3.3。氢氧自由基清除活性和还原能力的变化

羟基自由基清除能力和还原能力作为标准来评估SPI-dextran解决方案的抗氧化活性,结果显示在图4。羟基自由基清除活性比SPI-dextran轭合物明显从大约0.81%增加到11.5%和14.2%在500和1000 W,光催化能力。然而,没有发现显著变化在控制测试中所有的反应()。SPI-dextran共轭(图的还原能力4 (b)显示类似的趋势与自由基清除活性。结果表明,SPI-dextran轭合物自由基抑制剂,减少与光催化剂及其浓度增加力量。我们的发现与早期报告协议其他模型系统的抗氧化活性,由于配合伽马辐射诱导的乳酸链球菌肽模型系统(20.]。

3.4。蛋白质的变化模式

sds - page进行进一步确认右旋糖酐的共价耦合和SPI不同的光催化能力治疗后如图5。最初,右旋糖酐组件在反应混合物中没有得到Coomassie蓝色染色;只观察大豆蛋白亚基。大豆蛋白亚基乐队在控制测试略轻于未经处理的样品。另一方面,光催化交联能力表现出明显的影响。更多的大豆蛋白亚基消失的光催化能力强度增加。新模糊乐队与更高分子量的凝胶被观察到在SPI-dextran TiO的配合₂光催化,这表明大量新的氨基酸组被曝光和与羰基化合物反应形成Maillard-based骨料逐渐因为大多数共价相互作用通常在sds - page中断;这是显示在褐变和酶分析。这些材料和高分子量可能与它的还原能力和羟基自由基清除活性。类似的发现sds - page Zhang et al .,共价接合化合物产生的报告β-conglycinin-dextran模型系统被加热(21]。

3.5。傅立叶变换红外光谱分析

聚合物分子的光谱分析,包括蛋白质,是复杂的分子振动引起的众多原子。傅立叶变换红外光谱技术的研究是一个特别有用的protein-carbohydrate系统,因为有几个容易识别区域的中红外光谱在碳水化合物和蛋白质的化学指纹不明显的重叠。如图6主要乐队在3299厘米⁻¹观察光谱的SPI。这个峰值表示氢键地组织的拉伸。同时,SPI展出两个特征带1649(酰胺,C = O拉伸),1535厘米⁻¹(酰胺二世,h弯)22]。对于SPI-dextran轭合物,1649厘米的区域⁻¹和1535厘米⁻¹被称为切断和碳氮从酰胺I和II,由美拉德反应(图进行了修改6)。与完整的SPI相比,SPI-dextran轭合物在光催化的1000 W呈现强度最低。,人们会期望-哦组在右旋糖酐和SPI的氨基基团在反应混合物TiO之下₂光催化处理。苏et al。22]发现乐队的强度逐渐降低,1600 - 1400厘米⁻¹美拉德反应期间羧甲基纤维素(CMC)和大豆分离蛋白(SPI)。为碳水化合物,一系列的重叠峰位于1180 - 953厘米的区域⁻¹振动模式的结果如碳碳和切断的拉伸和弯曲的碳氢键模式。这些通常被称为“糖类”乐队和中红外光谱是最强烈的乐队。这些在大多数蛋白质的光谱吸收较弱(23]。的吸收在该地区1180 - 953厘米⁻¹强在SPI-dextran共轭不同的光催化能力和控制样本比SPI和低于右旋糖酐,表明似乎有糖类的SPI。此外,在蛋白质,有一个酰胺三世乐队在1300 - 1200厘米⁻¹。这个乐队是非常复杂的,主要来自碳氮拉伸和h变形。整个光谱的特征酰胺第三区间SPI-dextran解决方案在500年和1000年W(图6)表现出强度下降而SPI和控制样品。可能是预期,美拉德反应的化学变化伴随着SPI会导致一些红外光谱的变化由于一些官能团(nh的消费₂)。

3.6。二级结构的变化

二级结构分散的SPI和SPI-dextran古典加热或TiO下轭合物₂光催化条件下测量,详细的数据α螺旋,β表,β结果,随机线圈水平如表所示1。SPI包含大约10.6%的本地群众α螺旋,39.9%的β表,10.9%的β结果,38.6%的随机线圈。重大变化观察治疗后在不同的光催化能力。的α螺旋,β表,β转,随机线圈改为大约5.9%,20.3%,14.5%,59.8%,此前在500 W接受治疗。随着光催化能力,α螺旋,β表,随机线圈发生显著变化约3.8%,10.4%,和68.8%,报1000 W,而β就只有轻微的变化。然而,轻微的但不显著变化在控制测试中被发现。更高的光催化能力更有效改变大豆蛋白的二级结构中右旋糖酐的存在。增加光催化能力可以提供更大程度的糖化,作为自由氨基酸组的损失,也证明了这一点,这样更多的右旋糖酐共轭大豆蛋白,导致增加无序结构的内容。它证明了无序结构是主要的二级结构中糖化SPI。这些变化表明,接合多糖蛋白质通过共价键通过sds - page(如图所示)可以导致二级结构的构象变化protein-polysaccharide共轭。

4所示。结论

SPI-dextran共轭TiO形成的成功₂光催化处理。特别是,更高的光催化能力促使糖化。显著增加了SPI的抗氧化性能与右旋糖酐的接合TiO之后₂光催化处理。此外,测定抗氧化活性的增加伴随着紫外可见吸收和荧光强度的增加和减少自由氨基内容。sds - page显示一个新的高分子质量生产和原始大豆蛋白亚基TiO的接合诱导后消失₂光催化作用。使用傅立叶变换红外光谱技术的光谱分析表明,酰胺I, II, III的SPI被葡聚糖TiO后修改₂光催化处理。此外,CD光谱分析结果进一步证实,糖化可以改变大豆蛋白二级结构TiO更高₂光催化能力。这些结果表明TiO₂光催化可以作为一种有效的方式申请形成蛋白质和多糖轭合物。进一步的工作之间的接合SPI与TiO多糖₂光催化处理将阐明接合机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们感激Non-Funding项目的金融支持科技的发展湛江(没有。2013 b01053),支持的开放项目计划过程的淀粉和植物蛋白的教育部工程研究中心(2013 - erc - 01),和中国星火计划(2014 ga780072)。

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