S100A8 / A9分子复合物通过P38 Mapk途径促进鼻咽癌癌症迁移和侵袭

摘要

鼻咽癌（NPC）是通过目前不明确的机制与迁移和侵袭相关的一种恶性肿瘤。我们以前发现的S100A8 / A9水平大致升高在NPC患者的血浆中作为有前途的生物标志物。然而，他们的表达和NPC组织中的潜在功能仍然未知。在本研究中，我们分析了49个NPC组织和20个慢性咽炎（CP）组织。免疫组织化学染色在不同的组织中进行并由Mann-Whitney分析U测试统计。进一步进行Transwell运移和侵袭实验，确定S100A8/A9对NPC的影响。我们的结果显示鼻咽癌组织中S100A8/A9明显高于CP组织，与鼻咽癌临床分期密切相关。有趣的是，外源S100A8/A9蛋白刺激可显著增强鼻咽癌的迁移和侵袭能力。此外，p38 MAPK通路阻断可减少S100A8/A9蛋白刺激的鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。鼻咽癌组织中下游肿瘤侵袭和迁移相关蛋白(如MMP7)也升高，与S100A8/A9过表达一致。综上所述，我们的研究结果提示，在鼻咽癌肿瘤微环境中，分泌的可溶性炎症因子S100A8/A9可能通过p38 MAPK信号通路促进肿瘤迁移和侵袭，并伴随侵袭/迁移相关蛋白的过表达。这可能有助于进一步了解鼻咽癌预后的机制，并为鼻咽癌的诊断和治疗提供新的线索。

1.介绍

鼻咽癌(鼻咽癌)是耳鼻喉科最常见的肿瘤类型，起源于上皮细胞[1，2]．2018年，最新全球癌症监测报告估计新发病率为13万例[3.]．NPC是众所周知的癌症类型，其特征在于不同的民族和区域特异性[4]．这种恶性肿瘤在中国流行，发病率从高(中国南方)到低(中国北方)不等，而它在白种人中是一种罕见疾病[4]．华南地区(如广东、广西)是全国人大的高危地区，发病率远高于世界[5，6]．非角化低分化鼻咽癌是临床主要病理类型，恶性程度高[7]．高达新诊断的NPC患者的60-70％已经开发了局部晚期病变[8，9]．随着现代放疗和化疗的发展，目前鼻咽癌晚期(III期和IV期)患者的初始治疗有效率达90.9% [10]， 5年生存率为72.3-86% [11- - - - - -13]．然而，鼻咽癌的复发和远处转移发生率较高，尤其是晚期患者。至于他们，5年的发病率是20-30% [14，1510年发病率为30-40% [16]．更糟的是，治疗有效率下降到65.8-66.7% [17，18中位生存时间为14.0 ~ 27.2个月[17，19]．这些生物学特性和丰富的周围淋巴组织受累使鼻咽癌较其他头颈部肿瘤类型更易发生转移和侵袭。复发和远处转移是鼻咽癌患者治疗失败的原因。因此，大多数患者屈服于肿瘤转移的影响，而不是原发病灶。为了更好地促进鼻咽癌预后，并为新的治疗方法提供理论依据，发现更有前景的鼻咽癌生物标志物并揭示其潜在的分子机制是绝对必要的。

我们之前开发了高通量蛋白质组分类系统，为鼻咽癌的检测和诊断提供了高度准确和创新的方法[20.]．在最近的研究中，来自244名NPC患者的血浆蛋白质（II阶段：36例; III阶段：104例; IV阶段：104例）和104例健康供体，以发现使用等离标签技术的潜在新的NPC生物标志物。相对和绝对定量（ITRAQ）和液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）。这些NPC患者在诊断前没有接受任何治疗，如果患有感染，糖尿病，高血压，自身免疫炎症和其他疾病，则被排除在外。结果表明，在任何不同临床阶段诊断出的这些NPC患者的血浆中的S100A8和S100A9蛋白水平明显高于健康供体的血浆，这表明S100A8 / A9可以是NPC诊断的潜在血浆生物标志物[21]．

S100A8 (calgranulin A, MRP8)和S100A9 (calgranulin B, MRP14)是S100蛋白家族中的一对钙结合蛋白，常以钙依赖的方式形成异源二聚体复合物。它们具有低分子量(Mr分别为14000和13000)的氨基端ef-1和羧基端ef-2手域，在免疫中具有重要的功能[22，23]．肿瘤微环境与肿瘤的发生、转移密切相关。微环境中可溶性因子与肿瘤细胞的相互作用在肿瘤的发生发展中起重要作用[24- - - - - -27]．S100A8/A9是一对分泌的可溶性炎症因子。其主要功能是驱动对白细胞聚集、粘附和迁移的强趋化作用，并放大微环境中的局部炎症效应[28，29]到目前为止，S100A8/A9蛋白在肿瘤组织中的表达及其在微环境中的作用对于鼻咽癌仍然是未知的。

本研究将揭示S100A8和S100A9蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况，并进一步揭示其影响鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子基础，为鼻咽癌的预后和新的治疗提供理论依据。

2.材料和方法

2．1.石蜡组织样本

收集2013年1月至2014年6月广西医科大学附属第一医院病理科和2012年3月至2013年4月广西医科大学附属肿瘤医院病理科的石蜡包埋组织标本，并提供详细的病理诊断信息。通过仔细查询病历信息，考虑到患者在诊断前未接受过放疗、化疗或靶向治疗，且无感染、高血压、糖尿病、自身免疫性炎症等其他疾病的干扰，仅纳入这些鼻咽癌样本。专业病理医师确认鼻咽癌组织为非角化未分化癌，组织浸润程度(TI)、淋巴结转移程度(LNM)、临床分期(CS)依据国际癌症控制联盟(UICC，第8版)标准。鼻咽癌组织标本结构清晰。相关研究按照《赫尔辛基宣言》进行，方案经患者知情同意和广西医科大学医学伦理委员会批准(No. 050312)。

2.2。细胞培养和细胞增殖

人鼻咽癌细胞株CNE1(高分化)、CNE2(低分化)和6-10B(肿瘤发生和低转移)均购自湖南省湘雅中心实验室细胞库。所有细胞株在含有10%胎牛血清(美国HyClone公司)、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)中培养，37℃，5% CO₂．根据制造商的说明书，使用CCK8检测细胞增殖。

２.３.S100A8 / A9解决方案准备

将S100A8重组蛋白(Human, Amresco, USA)和S100A9重组蛋白(Human, Amresco, USA)按1:1的比例混合，4°C放置1 h，形成复合物(S100A8/A9)。

２.４.免疫组织化学

免疫组织化学（IHC）检测到NPC组织和CP组织中S100A8和S100A9的表达水平。组织切片（6 μM)用于脱蜡、水合和抗原修复。采用S100A8单克隆抗体(1:250,rabbit, Abcam, USA)和S100A9单克隆抗体(1:350,rabbit, Abcam, USA)进行一抗孵育;二抗孵育用PV-9000试剂(北京中山金桥公司，中国);DAB溶液用于显色(北京中山金桥公司，中国)。切片制备完成后，使用倒置显微镜(日本Olympus)观察样品。每个样本载玻片从上、下、左、右、中分别取5个200×的字段。采用Cell Sens Dimension软件识别阳性染色颜色(棕黄色或棕褐色)，计算各视野阳性染色细胞百分比。阳性对照以试剂提供者提供的阳性影像样本为阳性对照，阴性对照以PBS代替一抗。同样,兔子β-catenin单克隆抗体(Abcam，美国)和rabbit MMP7多克隆抗体(OriGene，美国)也用于临床组织蛋白检测。

2.5。Transwell迁移和入侵实验

采用transwell迁移实验检测S100A8/A9对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。将对数生长期的CNE1、CNE2和6-10B细胞培养12 h，进行血清饥饿，然后播种于transwell上室(1×10⁵细胞/)。RPMI 1640培养基中含有10%胎牛血清和1μg/ml在transwell下腔中加入S100A8/A9作为实验组。每个细胞系设不含S100A8/A9蛋白的对照组。培养24 h后，用倒置显微镜(Olympus, Japan)拍摄聚碳酸酯膜下表面5个200×上、下、左、右、中5个野。对细胞进行计数，取平均值进行统计。

采用transwell侵袭实验检测S100A8/A9对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响。用预冷的RPMI 1640培养基按1:6,100的比例稀释基质μl将混合物均匀摊铺在transwell腔室上部腔室的底部，以制备基底膜涂层；随后，使用介质对基底膜进行再水化。以下步骤与上述transwell迁移实验相同。同样，1 μg/ml下室培养基中加入S100A8/A9为实验组，不加入S100A8/A9为对照组。

2.6。P38 MAPK途径和MEK途径的抑制实验

用SB203580阻断p38 MAPK通路后进行Transwell检测，检测S100A8/A9对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响。采用SB203580 (CST，美国)溶解于DMSO (Amresco，美国)中制备10μ工作浓度。将对数生长期的细胞培养12 h进行血清饥饿，然后分为两组。实验组:细胞经SB203580预处理1 h后，在含10%胎牛血清和1μg / ml S100A8 / A9。对照组:用与实验组相同量的DMSO预处理细胞，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养μg / ml S100A8 / A9。根据上述实验方法进行Transwell迁移和侵袭实验。对于MEK途径阻断，使用MEK1 / 2选择性抑制剂AZD6244化合物（CST，USA），并进行类似的实验。

2.7.统计

所有实验数据均采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。采用正态性和方差齐性检验S100A8和S100A9阳性染色细胞面积百分比。它们不符合正态分布，且方差不均匀。因此，采用非参数统计方法。不同组之间的比较由曼-惠特尼分析U测试。在Transwell迁移和侵入实验中，这些测量数据显示为平均正负标准偏差。这些实验结果符合正态分布。学生们t各组间统计学分析采用-检验。每项实验重复三个独立实验。的所有实验均认为值小于0.05具有统计学意义。

3.结果

３．１．S100A8、S100A9蛋白在鼻咽癌临床组织中常过表达

为了明确S100A8和S100A9蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况，我们通过免疫组化实验，观察49例鼻咽癌和20例慢性咽炎(CP)患者中S100A8和S100A9蛋白的表达情况。有趣的是，我们在这些鼻咽癌组织的细胞间隙和肿瘤细胞浆中发现了大量的黄褐色的S100A8蛋白染色信号，包括II期、III期和IV期，而在CP组织中只有少量的黄褐色染色(图)1(一)和1 (b)）.类似地，在这些NPC组织的细胞间空间和肿瘤细胞细胞质中也检测到S100A9蛋白的大量棕黄色染色信号，包括II，III和IV，而仅观察到S100A9的少量棕黄色染色CP组织（图1 (c)和1 (d)）.结果表明，S100A8和S100A9蛋白在鼻咽癌II、III和IV期临床组织中表达丰富，主要分布于柱状上皮间质和鼻咽癌细胞胞浆中。相比之下，在CP组织中只有少量的S100A8和S100A9蛋白，大部分集中在组织的柱状上皮间质中。

统计分析结果表明，49例NPC组织中S100A8和S100A9的正染色面积百分比（PSAP）分别为11.74（8.08,22.91）和14.97（10.55,21.40），高于0.29（0.07），1.39）和3.21（1.98,3.89）在20例CP组织中，具有显着差异（z−6.34和−5.95， ，)(图1 (b)和1 (d)和桌子S1）.

３．２．S100A8、S100A9表达水平与鼻咽癌临床分期密切相关

进一步分层分析，II、III、IV期鼻咽癌组织中S100A8和S100A9阳性染色面积百分比均显著高于CP组织( ，)(图1 (b)和1 (d)和桌子S2）.此外，鼻咽癌晚期(III期或IV期)S100A8、S100A9阳性染色面积百分比显著高于鼻咽癌早期(II期)( ，)(表S2)，而III期和IV期无统计学差异(图1 (b)和1 (d)和桌子S2）.

重要的是，我们还探讨了S100A8和S100A9在鼻咽癌组织中的阳性染色面积百分比与临床特征之间的关系。我们的数据表明，S100A8和S100A9在鼻咽癌组织中的表达水平与性别、年龄、组织浸润和淋巴结转移无关，而与临床症状密切相关通用电气( ，)(表S3）.

3.3。S100A8 / A9刺激促进NPC细胞增殖，迁移和侵袭

我们之前发现S100A8/A9蛋白在鼻咽癌细胞中过表达，沉默内源性S100A8/A9可以显著降低鼻咽癌细胞的迁移能力[30.]．如上所示，在这些鼻咽癌组织中，除肿瘤细胞胞浆外，细胞间隙中也检测到S100A8/A9这对分泌的可溶性炎症因子。为了探讨外源S100A8/A9对鼻咽癌细胞增殖的影响，我们采用不同浓度的S100A8/A9处理鼻咽癌细胞，模拟S100A8/A9渗入鼻咽癌微环境，并采用CCK8检测细胞增殖情况。结果表明，CNE1(高分化)、CNE2(低分化)和6-10B(低肿瘤发生和转移)三种细胞株经S100A8/A9处理24 h后，均已呈剂量依赖性显著增加生长的趋势。虽然细胞增殖在0-5范围内仍无明显变化μg/ml S100A8/A9浓度(补充图S1）.

除了癌细胞的增殖、迁移和侵袭外，潜在的转移性传播也是鼻咽癌的关键临床问题。目前的临床研究表明鼻咽癌预后与S100A8/A9蛋白表达丰度显著相关。为了进一步探讨S100A8/A9蛋白刺激对鼻咽癌迁移和侵袭的影响，我们利用这些鼻咽癌细胞培养模型进行transwell迁移和侵袭实验。有趣的是，结果表明，低至1μ添加到下室培养基中的g/ml S100A8/A9已经能够显著地促进包括CNE1、CNE2和6-10B在内的所有三种NPC细胞系向S100A8/A9刺激的迁移和侵袭（图2(一个)- - - - - -2 (c)）.此外，我们通过生物信息化学和实验验证将受体预先通过NPC的细胞膜与S100A8 / A9蛋白相关联。结果表明，RAGE或TLR4是S100A8 / A9的潜在受体，愤怒或TLR4的阻断可以显然影响对NPC迁移和侵袭的S100A8 / A9效应（补充图S2）.综上所述，S100A8/A9刺激可能是通过NPC上的RAGE或TLR4受体促进细胞增殖、迁移和侵袭。

3．4．S100A8/A9刺激通过p38 MAPK途径促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径通常响应细胞外刺激，并参与癌症转移。S100A8/A9通过p38 MAPK途径促进胃癌迁移和侵袭[31]．为了深入了解S100A8 / A9如何调节NPC迁移和侵袭并探索P38激酶还参与该过程的机制，使用特异性P-38抑制剂SB203580来阻断P38 Mapk途径。通过Transwell实验再次测试S100A8 / A9对NPC细胞迁移和侵袭能力的影响。重要的是，结果表明，SB203580预处理后P38 MAPK途径抑制显着降低了这些NPC细胞的迁移和侵袭能力，甚至在含有1的培养基中直接培养 μg / ml s100a8 / a9（ 和 ，分别(数字)3(一个)- - - - - -3（d））).然而，我们测试了另一种MAPKs抑制剂AZD6244，它是一种有效的、选择性的MEK1/2抑制剂作为对照。结果表明，AZD6244处理(MEK/ERK途径抑制)并不能降低S100A8/A9刺激对三种鼻咽癌细胞系的迁移和侵袭能力(补充图)S3）.提示S100A8/S100A9至少通过p38 MAPK途径促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。

3．5．肿瘤侵袭和迁移相关蛋白β-Catenin和MMP7在临床鼻咽癌组织中升高

我们先前发现S100A8和S100A9基因敲除可显著降低鼻咽癌细胞中基质金属蛋白酶（MMPs）的表达[30.]．在本研究中，我们进一步探索了信号通路的下游，并对其进行了评价β-catenin和MMP7在临床鼻咽癌组织和慢性咽炎(CP)组织中的表达水平，是肿瘤细胞侵袭和迁移的两种重要蛋白。这里，临床组织结果显示丰富β-连环蛋白和MMP7蛋白在鼻咽癌组织中表达，包括II期、III期和IV期临床分期。相比之下，只有少数表达β-Catenin和MMP7蛋白在CP组织中存在（图4（a）和4（b）．统计学分析的结果表明，正染色面积百分比（PSAP）β-Catenin和MMP7在42例NPC组织中为13.4（9.23,18.52）和19.6（11.44,26.75），高于4.65（2.57,7.19）和0.8（0.32,1.95）的9例CP组织，具有显着差异（z值-3.83和-4.59， ，)(表S4）.

重要的是，阳性染色面积百分比β-catenin和MMP7在II、III或IV期鼻咽癌组织中均显著高于CP组织( ，)(表S4）.进一步分层分析，阳性染色面积百分比为β-catenin、MMP7在鼻咽癌晚期(III期或IV期)明显高于鼻咽癌早期(II期)( 和 ，III期和IV期无统计学差异(见表1)S5）.

4.讨论

S100A8/S100A9在鼻咽癌组织中的表达及作用目前尚不清楚。在过去的10年里，Cheng等人通过质谱(MS)鉴定了包括S100A8和S100A9在内的几个蛋白在鼻咽癌组织中高于正常鼻咽上皮组织(NNET) [32]．李等人。还独立地发现，NPC中的S100A9蛋白质比NNET的S100A9蛋白高四倍[33]．随后进行了Western blot等实验，为S100A9可能是鼻咽癌组织中潜在的生物标志物提供了更多证据，S100A9水平与鼻咽癌的临床分型显著相关[34]．然而，这些S100A8/A9蛋白与鼻咽癌早期病变CP之间的关系尚不清楚，因为这个疾病阶段可能会影响这些新的鼻咽癌生物标志物的特异性。此外，S100A8/A9蛋白介导的鼻咽癌迁移和侵袭的分子机制目前也不清楚。

在过去的研究中，我们发现血清S100A8 / A9蛋白，粗略地评估NPC患者作为潜在的生物标志物，其与NPC临床阶段高度相关。在本研究中，我们进一步检测到NPC组织和CP组织中的细胞内和细胞外S100A8 / A9蛋白。根据先前的血清研究观察了类似的结果。NPC组织的细胞间空间中的这些S100A8 / A9蛋白质和肿瘤细胞的细胞质显着高于CP组织。同时，我们提供从近五十个NPC患者提取的更实质证据，即S100A8 / A9水平与NPC的临床阶段密切相关，晚期阶段显着高于这些NPC组织中的早期阶段。上述结论是通过显着的证据，即NPC组织中S100A8 / A9的表达水平显着升高，与临床阶段密切相关。

迄今为止，已经在包括乳腺癌在内的多种癌症类型中观察到过表达的S100A8/S100A9蛋白[35，36，前列腺癌[37，38]， 膀胱癌 [39，40和结肠癌[41，42]．S100A8/S100A9蛋白在促进肿瘤增殖和促进肿瘤转移中发挥重要作用。我们前期研究表明，沉默内源性S100A8/A9可以明显抑制鼻咽癌细胞的迁移[30.]．众所周知，由细菌/病毒感染或炎症引起的鼻咽组织的病理刺激是鼻咽癌的一个危险因素[43]．NPC癌细胞和基质细胞或免疫细胞之间的相互作用，包括分泌细胞因子在肿瘤发生中的重要作用[44]．在这里，我们使用外源性S100A8/A9蛋白刺激模拟S100A8/A9浸润的鼻咽癌微环境，在这些鼻咽癌组织的细胞间隙和肿瘤细胞浆中观察到分泌的可溶性炎症因子S100A8/A9蛋白。有趣的是，我们的结果显示，低至0-5μg/ml浓度的S100A8/A9蛋白已倾向于促进NPC细胞增殖。此外，迁移和入侵能力显著增强，最低为1 μg/ml S100A8/A9蛋白在多种鼻咽癌细胞系中，包括低分化CNE2和高分化CNE1，甚至低转移的6-10B。同样，S100A8/A9在相对较低的浓度(≤25μG /ml)可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[45]．S100A8 / A9蛋白低至0.4-2 μ还发现G / mL促进一个结直肠癌研究中的迁移和侵袭能力[46]综上所述，目前的研究结果表明，S100A8/A9蛋白刺激可在低浓度水平促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

此外，我们还研究了细胞内途径是否参与S100A8 / A9刺激的NPC迁移和侵袭。我们的研究结果表明，该过程可能涉及P38 Mapk途径。当抑制P38 MAPK途径时，通过S100A8 / A9刺激的NPC细胞的迁移和侵袭能力降低。与NPC临床组织中的S100A8 / A9过表达，肿瘤侵袭和迁移相关蛋白质一致β-在这些临床鼻咽癌组织中，连环蛋白和MMP7也升高。因此，我们假设在肿瘤微环境中过表达S100A8/A9作为分泌性可溶性炎症因子可能会增强癌细胞中p38 MAPK通路的活性/磷酸化，从而激活转录因子并提高肿瘤细胞侵袭和迁移蛋白的表达（如MMP7）并最终促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭（图5）.众所周知，P38 MAPK途径广泛参与癌症生长，发育，增殖，侵袭，迁移，转移，分化和其他生理过程。MAPK信号传导途径的异常或过度激活在恶性转化和细胞的演变中起重要作用。值得注知的是，在外源S100A8 / A9的刺激下，激活了类似机制，激活P38 MAPK途径可以增强乳腺癌中的细胞增殖[45或促进胃癌细胞迁移和侵袭[31]此外，临床肿瘤转移和侵袭/迁移主要依赖于参与Wnt过程的蛋白家族基质金属蛋白酶（MMPs）的活性/β-catenin和EMT信号通路[47]．最近，据报道，S100A8 / 9通过促进通过愤怒信号传导来促进细胞生长和血管生成来发挥重要作用[48]．Araki等人也指出，晚期糖基化终产物受体(RAGE)是主要的S100A8/A9受体之一，导致NF的激活κB [49]．此外，S100A8/9通过RAGE和TLR4对造血干细胞的生物学效应是通过在血液学过程中分泌促炎细胞因子[50]此外，S100A8和S100A9诱导的P38MAPK信号激活被toll样受体4（TLR4）抑制剂阻断[51]．这些文献与我们的研究结果一致。然而，很少有信息表明S100A8/A9蛋白调控的细胞内和细胞外机制的差异。尽管在本研究中，我们发现细胞内和细胞外S100A8/A9均在鼻咽癌中发挥促进肿瘤的作用，未来还需要进一步的机制探索。

结论

综上所述，我们的研究表明S100A8/A9蛋白在鼻咽癌组织中高度表达，与鼻咽癌临床分期显著相关。此外，S100A8/A9在肿瘤微环境中的过度表达可通过p38 MAPK信号通路和肿瘤细胞侵袭和迁移蛋白过度表达（如MMP7）促进鼻咽癌的迁移和侵袭分泌性可溶性炎症因子S100A8/A9作为鼻咽癌迁移和侵袭的刺激因子的发现，以及对S100A8/A9在微环境中作用的更好理解，可以为鼻咽癌的诊断和治疗提供新的线索。

缩写:

CP：	慢性咽炎
ITRAQ：	相对和绝对定量的等压标签
质/女士:	液相色谱 - 串联质谱法
女士:	质谱分析
时差:	肿瘤微环境
TI:	组织渗透
LNM:	淋巴结转移
CS：	临床阶段
IHC：	免疫组织化学
PSAP：	阳性染色面积百分比
MAPK:	增殖蛋白激酶
NNET:	正常的鼻咽上皮组织。

数据可用性

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者要求。

伦理批准

涉及本手稿中的人类组织的报告研究包括伦理批准和同意的声明，包括批准该研究的道德委员会的名称和委员会的参考编号。相关研究根据赫尔辛基的宣言进行，议定书由广西医科大学医学伦理委员会批准（050312号）。

同意

本方案经患者知情同意批准。

信息披露

该手稿的较早陈述见Research Square<10.21203/rs.3。rs - 127785 / v1 >作为预印本。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

张晓宇，杨华，王文林，A.J.对本研究进行概念化;N.X, X.Y y, y.c.q. H.和zh .开发了方法论;N.X,王小虎,X.Y Y.C, Q.H, Z.H.验证研究;N.X, Y.C和Q.H.进行了数据整理;n.x.、b.z.和Y.H.撰写了原稿;N.X、B.Z和W.L.撰写、评论和编辑手稿;X.H.负责这项研究，Y.H.和A.J.负责该项目的管理并获得了资金。所有作者都已阅读并同意该手稿的出版版本。徐宁、张蓓蓓、黄夏宁对这一作品的贡献是相同的。

致谢

作者感谢梁振强博士和黄建春博士对项目的建设性建议和帮助。广西壮族自治区科技厅项目(Guike AB19110052);广西自然科学基金项目(2015GXNSFAA139215);国家自然科学基金项目(81260405)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性，边坡稳定性

补充材料

补充图S1。外源性S100A8/A9刺激对CNE1、CNE2、6-10B等鼻咽癌细胞增殖的影响分别用不同浓度的S100A8/A9处理细胞24小时。n= 9; ； ．补充图S2。与RAGE和TLR4受体相关的外源性S100A8/A9刺激对包括CNE1、CNE2和6-10B在内的鼻咽癌细胞的影响。(a)生物信息学预测显示RAGE和TLR4可能是S100A8/A9刺激的受体;(b)实验验证S100A8/A9刺激鼻咽癌细胞可能的受体，包括RAGE (50 nM抑制剂FPS-ZM1预处理1小时)和TLR4 (1 ug/100 ul抗体阻断1小时)。补充图S3。外源性S100A8/A9刺激对鼻咽癌细胞另一条MAPK通路(MEK1/2)的影响(a) MEK1/2抑制剂(AZD6244)预处理后S100A8/A9蛋白对鼻咽癌细胞迁移影响的代表图像;(b)定量检测MEK1/2抑制剂(AZD6244)预处理后S100A8/A9蛋白对鼻咽癌细胞迁移的影响。n= 3;N.S.不重要;（c）S100A8 / A9蛋白在MEK1 / 2抑制剂（AZD6244）预处理后对NPC细胞侵袭的影响的代表性图像;（d）S100A8 / A9蛋白对NPC细胞侵袭（AZD6244）预处理后对NPC细胞侵袭的量化。n= 3;n,不重要。表S1。比较S100A8和S100A9在鼻咽癌和CP组织中的阳性染色面积百分比(PSAP)。表S2。比较S100A8、S100A9在不同临床阶段鼻咽癌及CP组织中的阳性染色面积百分比。表S3。鼻咽癌组织中S100A8、S100A9阳性染色面积百分比与临床特征的相关性表S4。阳性染色面积百分比(PSAP)比较β-catenin和MMP7在NPC和CP组织中的表达。表S5。比较阳性染色面积百分比β-catenin和MMP7在不同临床阶段鼻咽癌和CP组织中的表达（补充材料）

参考

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