与包膜糖蛋白结合的噬菌体展示肽显示对登革病毒2型的抗病毒活性

摘要

登革热病毒是一种日益严重的公共卫生威胁，每年影响数亿人，并造成巨大的经济和社会损害。该病毒由蚊子传播，除其他原因外，由于病媒范围的地理扩大以及在大多数流行国家公共卫生干预缺乏效力，该病的发病率正在增加。到目前为止，还没有针对这种病毒开发出高效的疫苗或抗病毒药物。我们利用噬菌体展示技术鉴定了能够阻断DENV2的多肽。用重组登革热包膜及其片段结构域III筛选M13噬菌体的随机肽库。经过4轮筛选，确定了几种结合肽，并进行了抗病毒测试。有三种多肽能够阻断病毒的感染性，同时对靶细胞没有毒性。进行了盲对接模拟以研究可能的结合模式，结果表明，所有肽段似乎都结合了蛋白质的III结构域，并且可能主要通过疏水相互作用稳定下来。这些结果与针对这种重要病毒的新疗法的发展有关。

1.介绍

登革热病毒是全球日益严重的公共卫生问题，每年约有3.9亿人感染，近9600万人出现临床症状[1］．其他作者估计，来自128个国家的约39亿人有感染这种病毒的风险[2］．登革病毒可产生广泛的临床表现，从无症状或轻微表现到更严重的危及生命的表现，即登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)。由于血浆泄漏、呼吸窘迫、水肿、严重出血和器官损伤，严重登革热可致人死亡，尤其是儿童[3.］．

这种病毒是黄病毒是由该属的蚊子传播的伊蚊．由于这些蚊子扩散到新的地区，登革热的感染个案已增加[4］．DENV以4种血清型(DENV1、DENV2、DENV3和DENV4)存在于大多数流行国家[5］．登革热被认为是全球增长最快的蚊媒传播疾病[6］．

登革病毒粒子呈二十面体对称，直径在500 Å和600 Å之间[7］．病毒基因组由11 Kbp的单正链RNA组成，编码单一多蛋白。多蛋白在细胞质中分裂成几个结构多肽和非结构多肽[8］．结构蛋白包括衣壳(C)、膜前膜(PrM)/膜(M)和包膜糖蛋白(E)，它们参与了病毒粒子的形成。非结构蛋白(NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b和NS5)负责病毒的复制、组装和免疫反应逃逸[8］．

E糖蛋白是病毒进入过程中最重要的分子，因为它似乎负责受体识别和附着在细胞表面，触发网格蛋白介导的内吞作用，以及随后的病毒和细胞膜的融合。这种蛋白质可以与多种细胞分子相互作用;因此，它是研制新型抗病毒药物的理想靶点[9- - - - - -12］．E糖蛋白由三个结构域，外加一个膜近端干和一个跨膜锚定[13- - - - - -15］．域I由8组成β-strand桶，包含两个插入循环。结构域II包含在所有黄病毒中保守的疏水序列。这些疏水序列，也称为融合肽，负责在融合过程中将重排的E三聚体插入细胞膜[9，14- - - - - -16］．结构域III (DIII)是一种免疫球蛋白样羧基端结构域，负责最初的细胞受体结合[17］．此外，DIII是中和抗体的主要目标[18］．

由于这种病毒产生的免疫反应和病理的复杂性，特别是在随后的感染期间，疫苗的开发一直缓慢，只有一种疫苗已注册，仍在几个地区处于早期试验阶段[19，20.］．

目前，还没有批准用于治疗登革热感染的抗病毒药物。众所周知，登革热患者的病毒血症持续时间很短。然而，由于高病毒血症与疾病的严重发作有关，在疾病的早期阶段使用抗病毒药物可能会阻止疾病的进展，并加速患者的康复。在这里，我们提出使用登革病毒包膜(E)糖蛋白作为目标，以寻找可能干扰感染过程的第一步的多肽。我们选择denv - 2e糖蛋白和DIII为靶点，筛选M13噬菌体上显示的随机多肽。

近年来，噬菌体展示技术已被用于识别与多种靶标具有特异性结合活性的多肽。这项技术在识别mimotopes和新型抗病毒药物方面非常有用[21]，拟肽药物[22，以及许多其他应用。

在这里，我们表明DENV2 E糖蛋白和结构域III (DIII)是鉴定噬菌体展示肽的有用靶点，具有潜在的新型抗病毒药物的潜力。在这里，我们描述了三种肽抑制病毒的感染性，并且对允许细胞没有细胞毒性。与这些多肽的完全盲对接模拟表明，结合位点在包膜蛋白结构域III，主要疏水相互作用稳定。这些发现为优化和完善新型肽抑制剂的设计提供了新的可能性。

2.材料和方法

2．1．细胞、病毒和多肽

Vero细胞(CCL-81, ATCC，美国)用于登革2病毒传播、空斑形成试验和细胞毒性试验。这些细胞在含有10% FCS和50μg/ml庆大霉素，37°C和5%CO₂登革热病毒，血清型2，是巴拿马国家记忆研究所（ICEGS）研究部赠送的礼物。七肽随机文库从新英格兰生物实验室（美国）获得。合成肽从Genscript（美国）获得。全DENV2 E糖蛋白（目录号Den-034）从ProSpec Tany TechnoGene（以色列）获得。组织培养、分子生物学等级和通用试剂来自Nunc和Sigma Aldrich（美国）。

2．2.重组蛋白表达

从GenBank (NCBI全基因组参考序列:NC_001474.2)中获得DENV2 E DIII (aa 289 ~ 405)的编码序列，并对其在大肠杆菌中的表达进行优化大肠杆菌使用在线工具(GeneOptimizer, Geneart)。将优化后的序列(IDT)亚克隆到表达质粒pET-30b(+) (Novagen)的NdeI-XhoI酶切位点。该质粒可诱导产生DIII +亮氨酸和谷氨酸，并在c端有一个6xHis尾巴。这段E蛋白含有125个氨基酸，分子量约为14.2 kDa。表达质粒经测序验证后转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)。单菌落在含抗生素的LB培养基中，37℃，250 rpm, OD时用0.5 mM IPTG诱导₆₀₀诱导4小时后，通过离心收集细胞并将其保存在培养基中−由于重组蛋白的表达主要在不溶性部分，因此进一步纯化包括包涵体分离、增溶和变性条件下的亲和纯化、复性和透析。

2.3.重组DIII的纯化

将诱导培养的冷冻颗粒悬浮在冷裂解缓冲液（10）中 mM-Tris-HCl pH值7.5,5 盐酸苯甲脒，5 毫米乙二胺四乙酸，5 毫米DTT，0.3 mg/ml溶菌酶和1 mM PMSF）并通过在冰上超声溶解。通过离心回收包涵体，用50%乙醇洗涤 mM磷酸盐缓冲液，5 mM EDTA，200 毫米氯化钠，0.5 M尿素和1%Triton X-100，与之前一样回收，用50 mM磷酸盐缓冲液，1 mM EDTA和1 M NaCl，并在变性缓冲液中溶解（10 mM Tris HCl pH值8.0，100 嗯，不₂阿宝₄， 100mm NaCl, 6m GuHCl)。使用Ni-NTA超流盒(Qiagen)纯化了溶解的包涵体。装载后，用缓冲液C (6 M GuHCl, 100 mM NaH₂阿宝₄用缓冲液E (6 M GuHCl, 100 mM NaH)对蛋白进行洗脱₂阿宝₄， 100mm HCl, pH 4.5)。对PBS进行透析的尝试导致蛋白质沉淀;因此，我们使用Protein refolding试剂盒(Pierce, USA)测试了几种折叠条件。最后，用refolding buffer RB7 (1 mM GSH, 1 mM GSSH, 1 mM EDTA, 1.1 M GuHCl, 55 mM Tris-HCl, pH 8.0, 21 mM NaCl, 0.88 mM KCl)稀释再折叠。重组蛋白经TBS透析，滤膜灭菌，BCA法定量。

２.４.体外病毒阻断试验检测蛋白再折叠

从几种重新折叠条件中获得的重组DIII的Aliquots首先被目视检查为聚合。那些没有表现出聚集的细胞随后在病毒感染阻断实验中进行测试，以检查它们结合细胞受体并抑制病毒感染的第一步的能力。Vero细胞于10⁴完全培养基(MEM, 10% FCS, 50μg / ml庆大霉素)。第二天，用PBS洗涤细胞，与重新折叠的蛋白(100μl、 五十 μg/ml)，在37°C下维持30min (MEM, 1% FCS，庆大霉素)。然后洗涤细胞，用DENV2 (MOI = 3,50)孵育μl)，含有相同浓度的折叠蛋白，在37℃维持培养基中保存1 h。再次洗涤细胞，补充维持培养基，在37°C, 5% CO下孵育₂．5天后，使用基于化学发光的ATP检测(CellTiter-Glo®细胞活力检测，Promega)来量化细胞病变效应。

2．5．, biopan

噬菌体展示使用Ph.D.-7噬菌体展示肽库按照制造商的说明进行。使用两个靶标，完整的DENV2包膜或上述获得的重组DIII进行4轮摇瓶。每一步都要在4°C下涂上96孔板上的几口井，然后用400堵塞μ0.1 M NaHCO_3.(pH 8.6)， 5 mg/ml BSA, 4°C, 1 h。6次后用TBST (TBS, 0.1% Tween 20)， 100μTBST中的1个噬菌体，含10个¹¹rt条件下pfu结合1 h，然后用TBST洗涤10次，用0.2 M甘氨酸- hcl pH 2.2, 1 mg/ml BSA洗脱噬菌体。用Tris pH 9.1中和后，噬菌体滴度和体积扩增大肠杆菌下一轮。为了增加选择的严肃性，在洗涤过程中增加Tween-20的浓度，并减少固定在固相上的目标量。第四轮后，将洗脱后的噬菌体进行镀金、挑取、繁殖，进行后续噬菌体酶联免疫吸附测定和测序。

2.6。Phage-ELISA

DENV2 E、DIII和BSA在4°C下涂敷96孔微量滴定板(MaxiSorp, Nunc)过夜。用TBS-BSA封闭培养皿，用TBST洗涤，用10¹²单个噬菌体的pfu。洗涤后，添加HRP结合抗M13单克隆抗体（GE Healthcare，USA），孵育和洗涤。通过添加TMB底物溶液10分钟来显色 min，并以1停止 N HCl。在405处读取平板 nm。选择具有最佳目标与背景信号比的噬菌体克隆进行DNA测序。按照制造商的建议，使用96 gIII引物通过循环测序确定DNA插入。按照JalView v.2.10.1中的实施进行序列标识和残留物着色[23]。按照Zappo方案进行着色，其中残留物根据其物理化学性质进行着色，如下所示：粉红色，脂肪族/疏水性；橙色，芳香性；红色，阳性；绿色，阴性；蓝色，亲水性；品红，脯氨酸/甘氨酸；黄色，半胱氨酸。

2.7。病毒空斑减少试验

接种Vero细胞(2 × 10)⁵每孔细胞数）并在6孔板中培养过夜。在几次稀释后制备肽并与100 DENV2的pfu，最终体积为150 μl.混合物在RT下孵育1小时，然后加入细胞单层中，37℃孵育1小时吸附。然后去除接种物，清洗细胞，覆盖1%甲基纤维素维持培养基，孵育5天。然后吸出培养基;用10%甲醛固定细胞，用1%结晶紫染色。对病毒斑块进行目测计数，并将实验组与单独病毒组和未治疗对照组进行比较。

2.8. 肽细胞毒性试验

多肽与细胞孵育，正如病毒空斑减少试验中描述的那样(37°C 1小时)，然后冲洗掉，细胞加入维持培养基，在37°C孵育24小时。然后，根据CellTiter-Glo®细胞活力测定试剂盒制造商的描述，通过发光测量细胞ATP来估计细胞毒性。通过比较肽处理过的细胞和未处理过的细胞的读数来估计其活力。

2.9。Peptide-Protein对接模拟

用于肽对接分析的蛋白质结构可从蛋白质结构数据库（对于DENV包膜蛋白，PDB 1OAN）获得，也可在我们实验室通过同源建模获得（对于DIII）.通过使用I-TASSER web服务器进行同源性建模，使用表达蛋白对应的序列获得结构[24］．I-TASSER预测的最佳模型具有较好的预测值(-score = 0.77)，在结构上与PDB数据库中的几种病毒包膜糖蛋白密切相关。为了研究活性肽的可能结合模式，我们使用cab -dock web服务器进行了计算对接分析，除了将模拟周期增加到200 [25］．根据轨迹特征，我们进一步分析最佳姿势，并用LigPlot描述分子间的相互作用⁺［26］．

2.10。统计分析

其中，使用Kruskal-Wallis和Dunn的多重比较检验(在GraphPad Prism软件中执行)对未治疗对照组和所有其他组之间的中位数进行比较。

3.结果和讨论

３．１．重组DENV2包膜结构域III的表达、纯化和重组

登革病毒包膜是II类病毒融合蛋白。这种蛋白质是β富含链的细长分子，具有三个外结构域，位于中心的DI，顶端的DII带有融合环，以及连接到短、茎和跨膜C末端的Ig样DIII[14，27］．在向E蛋白fusogenic构象转变的过程中，DIII经历了剧烈的重新定位，导致从二聚体形式重排到三聚体形式[15，28］．DENV E结构域III形成一个类似于ig的结构域β-桶状结构，由一个二硫桥稳定。

DIII是包膜的关键部分，因为它是受体结合域[13，29]。它也具有很强的抗原性，针对该结构域的抗体能够有效地中和病毒感染[18，30.］．考虑到包膜蛋白及其结构域III的重要作用，我们决定寻找与该蛋白结合活性的多肽，试图找到能够削弱感染过程的新分子。为此，我们选择噬菌体展示作为一种稳健的方法，允许快速筛选和选择数以百万计的肽变体，以结合各种目标。由于全包膜糖蛋白是一种大蛋白，可能存在许多可能的非生产性结合位点，所以我们也选择对我们实验室获得的domain III随机肽库进行筛选。

通过对DENV2包膜蛋白的密码子进行优化，获得了DENV2包膜蛋白ⅲ结构域的编码区大肠杆菌表达式。该片段亚克隆到大肠杆菌在T7启动子控制下表达载体pET-30b，并在c端与6xHis尾部融合。IPTG诱导后,大肠杆菌重组蛋白的高表达(图1(一))，占总蛋白的50%以上，根据考马斯氏染色SDS-PAGE凝胶密度分析(数据未显示)。由于重组蛋白主要以不溶性聚集体形式存在，纯化方案包括分离和洗涤包涵体，然后在变性条件下通过亲和Ni-NTA层析进行亲和纯化。这里实现的亲和纯化程序允许高纯度的DIII制备(图1(一)）.

几次尝试将此蛋白稀释到PBS中，但由于沉淀而失败;因此，我们利用多种实验条件进一步探索了该蛋白的折叠条件。这些测试包括不同浓度的折叠剂和添加剂，如l -精氨酸、还原和氧化谷胱甘肽和/或聚乙二醇[31］．研究显示，登革热包膜DIII可能在感染过程中起主要的负抑制作用[10，32- - - - - -35];因此，我们决定使用这个标准来评估重新折叠的DIII的功能。重复折叠试验后，每一种蛋白制剂对TBS进行透析，过滤杀菌，并在Vero细胞中进行DENV2病毒结合阻断试验。我们发现重组蛋白在缓冲液RB7 (1.1 M胍，55 mM Tris-HCl, pH 8.2, 21 mM NaCl, 0.88 mM KCl, 1 mM GSH和1 mM EDTA)中重新折叠，显示出显著的抑制感染(图)1 (b))，但没有细胞毒性的迹象(数据未显示)，表明该蛋白是折叠的，具有功能。然后在更高的规模上使用该程序分离重组EDIII用于生物测序和进一步的步骤。

3.2.噬菌体展示包膜结合肽的选择

为了选择两个靶点的肽粘合剂，我们使用了M13噬菌体pIII蛋白质中的七肽随机文库。这些噬菌体每个衣壳含有1到5个肽副本，理论上允许选择更高亲和力的粘合剂。作为淘洗过程的诱饵，使用了两种蛋白质来源，（1） 重组、昆虫表达的DENV2包膜和（2）重组，大肠杆菌表示域三世。筛选过程包括四轮对固相结合蛋白的噬菌体筛选和随后的洗脱和扩增。在对两种蛋白的淘洗过程中，被洗脱的噬菌体的数量逐步增加(图)2)，表明特定噬菌体的有效富集。在最后一轮之后，从每个淘洗方案中随机选择24个噬菌体，进行繁殖和纯化，以通过噬菌体ELISA测试其与相应诱饵的结合能力。

通过ELISA对洗脱噬菌体进行的分析表明，许多噬菌体似乎以特定方式结合，这表明目标噬菌体的吸光度值高于背景噬菌体（BSA）（图3.）.每次淘选随机抽取的24个噬菌体中，12个噬菌体具有完整的E糖蛋白，21个噬菌体具有E结构域ⅲ片段。携带STSFWIT、NERALTL、ELLASPW、SPSTHWK、LALAEIT、NLQIYAV和SLSSVHD多肽的噬菌体表现出这种行为。一些其他的克隆没有显示良好的目标-背景信号比，并没有用于测序或后续分析。这一结果并非意外，因为淘洗过程可能产生人工结合噬菌体，而这些噬菌体随后在ELISA中不能很好地结合。

将33株噬菌体- elisa阳性噬菌体随机区进行DNA测序。DNA测序显示，结合噬菌体携带的多肽具有一些共同特征，包膜糖蛋白(SxSAxxx)和结构域III蛋白(SxSxHTL)的共识序列相似(见表)1图形4）.相应的多肽具有丰富的负电荷残基，嵌入正电荷、亲水性和脂肪/疏水性残基(图)4）.由此产生的肽序列与其中一个蛋白质(DIII)的一致，是另一个(E)的较小部分，因为共识序列有一些相似之处，而针对DIII选择的肽的共识似乎更明确。有趣的是，在最后一轮洗脱中，我们选择了几种含有相同肽段的噬菌体(见表)1)一些噬菌体被观察了几次，这一事实也与淘洗步骤中特定结合物的成功富集相一致。

这里显示的一些结合噬菌体携带的肽序列已经在生物蛋白数据库中报道过，在撰写这篇论文的时候，生物蛋白数据库中出现了超过23,700个序列[36］．此前也有报道称，肽SPSTHWK和WNAKYTL能结合晶体Ni3B纳米颗粒[37]此外，肽NERALTL在数据库中出现了两次，与环氧树脂覆盖的表面具有结合活性[38]以及传染性鲑鱼贫血病毒的融合蛋白[39］．此外，肽LSNNNLR以前曾被报道结合聚(二甲基硅氧烷)[40］．

3．3.所选多肽的活性和可能的结合方式

从ELISA验证的结合噬菌体合成的多肽包含额外的Gly-Gly-Gly-Ser间隔在c端和羧酸酯酰胺化以阻断负电荷，根据制造商的建议，以模拟M13 pIII蛋白的呈现环境。然后在Vero细胞中检测合成肽对DENV2感染的抑制能力。合成肽ELLASPW, SYQSHYY和STSFWIT在斑块减少试验中显示了对DENV2感染的抑制活性(图)5（b））.有些肽在体外与目标蛋白结合良好，但对病毒的抑制活性并不一致，即肽SPSTHWK，认为对病毒的抑制作用为阴性(图)5（b））.由于多肽只在吸附期间(37℃下1小时)孵育，观察到的抑制可能是由于对病毒生命周期的这一初始步骤的干扰或由于病毒的杀菌活性。需要更多的实验来阐明这些肽的确切作用机制。当活性肽单独与Vero细胞在与病毒感染相同的条件下孵育时，没有观察到细胞毒性的迹象(图)5（a））.

在平移和ELISA试验中具有良好结合活性的其他一些肽没有抑制DENV2感染的事实并不令人惊讶，因为这些小肽中的一些可能结合到在结合和进入过程中对其功能不关键的靶区。这些肽中的一些相互作用也可能不同与在噬菌体蛋白pIII背景下呈现的情况相比，它们与合成形式的目标物之间存在显著差异。

为了探索这些肽与其靶结合的可能模式，我们使用CABS dock online server进行了计算对接分析[25]该软件遵循的算法管道允许灵活、全盲的蛋白质肽对接，完成全原子重建和最佳姿势优化[41，42].用于对接的蛋白质的结构可以从蛋白质结构数据库（对于DENV2包膜蛋白PDB 1OAN）获得，也可以在我们的实验室通过同源性建模获得（对于DENV2 EDIII）。

对接模拟可以预测活性肽与目标蛋白结合的可能姿势。预测的最佳模型表明，疏水相互作用优于氢键(图)6）.有趣的是，预测包膜糖蛋白和相应肽ELLASPW的最佳构型也提出了一个结合位点，位于蛋白的结构域III(图)6）.肽ELLASPW在包膜糖蛋白上相互作用能最低的构型表明该肽与蛋白残基I335、K334、L351、V354、F337、E338、V347、K344、R345、M340、Q386、V382存在疏水相互作用，并与E383形成氢键。多肽STSFWIT与DIII的相互作用包括与Y377、E403、L387、L389、K307、E311、K310、F402的疏水链接和与K388、V308的氢键。同样，肽SYQSHYY的最佳构型包括与V382、M301、P336、E338、L294、K334、F337、I339、N355、M340、K295、V354、R350的疏水相互作用以及与K291的氢键。

登革热包膜结构域III已被证明参与病毒粒子与受体/附着因子结合的初始步骤，特别是序列380-IGVEPGQLKL-389中的氨基酸[13，43，44］．有趣的是，由仿真提出的最佳姿态表明与这个区域有一些重叠。肽段STSFWIT似乎结合了重叠于380-389序列的DIII区域，其3个氨基酸与肽段相互作用:L387、K388和L389。肽ELLASPW似乎不会阻断或干扰受体结合序列，尽管它的两个残基确实参与了与肽E383和Q386的疏水相互作用。肽SYQSHYY不与受体结合区域重叠，尽管它的一个氨基酸与肽(V382)相互作用。有趣的是，最后一个肽段似乎也与DKLQLK序列紧密结合，与K291、Q293和L294残基相互作用。该结合位点可能与进入过程有关，因为赖氨酸291和赖氨酸295被证明是与细胞GAGs结合的关键[45].尽管此处提出的这些肽与其靶点之间相互作用的最佳姿势显示出良好的相互作用能谱（数据未显示），但还应注意，由于小肽建模的复杂性，可能存在其他有效结合位点。可能需要进一步的研究来验证肽的拟议结合模式，并对其生物活性进行合理的、结构导向的改善。

噬菌体展示技术已经被一些作者用来寻找相互作用的多肽，最终目标是开发针对多种病毒的新药。一些例子包括描述的具有抗艾滋病毒活性的肽[21，46]，普马拉病毒[47]西尼罗河病毒[48，纽卡斯尔病毒[49，50]、丙型肝炎病毒[51，52]、猪繁殖及呼吸综合症病毒[53，54]，传染性支气管炎病毒[55]，乙型肝炎病毒[56]、水貂肠炎病毒[57]，日本脑炎病毒[58]，猪瘟病毒[59]，以及流感病毒[60］．

关于登革病毒的肽抑制剂，主要采用三种策略:(1)用硅设计的肽段，(2)模仿病毒蛋白序列的肽段，(3)通过对病毒蛋白的筛选获得的肽段。而抗DENV抗病毒肽的开发一直以使用前两种方法的报道为主[61- - - - - -64]，已经有一些尝试利用多功能噬菌体展示技术来寻找新的抗病毒药物。使用随机肽库识别的肽包括pania等人2014年的报告[65，针对包膜疏水囊，以及Chew et al.， 2015 [66]本文报道的肽与这些作者发现的肽不具有同源性，尽管由于使用了不同的靶点和文库，结果可能不具有完全可比性。

4.结论

总之，我们使用了一种新的策略来鉴定DENV2感染抑制剂，我们从一个随机多肽库中发现了3个多肽，它们能够特异性结合病毒包膜蛋白，在体外抑制感染，而对细胞没有显示毒性。通过盲对接模拟得到的结合模式表明，这些活性肽与其靶标之间的相互作用可能通过疏水相互作用而稳定下来，这为未来改进针对这种重要病毒的新型抗病毒药物提供了相关信息。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

作者的贡献

Carolina de la Guardia参与了实验工作和手稿的起草。Mario Quijada参与了实验工作的执行。Ricardo Lleonart参与了设计、实验工作和手稿准备。

致谢

这项工作部分得到了美洲开发银行（IND-JAL-02-DENGUE）、国家科学部长、巴拿马创新技术中心（SENACYT）和巴拿马国家调查系统（SNI）的资助作者还感谢Alejandro Llanes修改了手稿，并感谢PanamáICGES的研究人员捐赠了DENV2病毒株。

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