AV 病毒学的进步 1687 - 8647 1687 - 8639 Hindawi 10.1155 / 2017/1827341 1827341 研究文章 Phage-Displayed肽选择绑定包膜糖蛋白显示抗病毒活性与登革2型病毒 http://orcid.org/0000 - 0002 - 9505 - 0873 de la Guardia 卡罗莱纳 1 2 Quijada 马里奥 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 5830 - 6315 Lleonart 里卡多 1 海沃德 加里·S。 1 细胞和分子生物学中心的疾病 皇家研究院Investigaciones Cientificas y Servicios de Alta Tecnologia (INDICASAT AIP) 219年建筑 Ciudad del军刀 Apartado 0843 - 01103 巴拿马 巴拿马 indicasat.org.pa 2 生物技术部门 Acharya Nagarjuna大学 托尔 印度 nagarjunauniversity.ac.in 2017年 10 9 2017年 2017年 25 05年 2017年 26 07年 2017年 10 9 2017年 2017年 版权©2017卡de la Guardia et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

登革病毒是一个日益严重的公共卫生威胁影响每年几亿人民,留下巨大的经济和社会损失。这种病毒是由蚊子传播的疾病的发病率增加,以及其他原因,由于矢量的地理扩张的范围和缺乏有效的公共卫生干预措施最普遍的国家。到目前为止,还没有非常有效的疫苗或抗病毒已经开发了这种病毒。这里我们使用噬菌体展示技术识别多肽能够阻止DENV2。在M13噬菌体随机肽库筛选重组登革热信封和其片段域三世。经过四次的平移,几个结合肽,合成,对病毒进行测试。三肽能够阻止病毒的传染性,而不是对目标细胞的毒性。盲目对接模拟进行调查的可能模式绑定,显示所有肽似乎绑定域三世可能主要是稳定的蛋白质和疏水相互作用。这些结果与小说的发展对这一重要病毒疗法。

 Banco de Desarrollo Interamericano IND-JAL-02-DENGUE Secretaria Nacional de Ciencia Tecnologia e Innovacion Sistema Nacional de Investigacion de巴拿马 1。介绍

登革病毒是一个日益严重的全球公共卫生问题,每年大约有3.9亿人被感染,近9600万人发展临床表现的疾病 1]。其他作者估计,大约有来自39亿个国家的128人分享这种病毒感染的风险( 2]。登革病毒可以产生广泛的临床表现,从无症状或轻微的表现更严重的生命威胁表现,称为登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)。严重的登革热可能是致命的,特别是儿童,由于等离子体泄漏,呼吸窘迫,水肿,严重出血、器官损伤 3]。

这种病毒是一种 黄病毒这是由蚊子传播的属 伊蚊。登革热感染的发生率增加了由于这些蚊子传播到新的区域( 4]。DENV存在4种血清型(DENV1, DENV2、DENV3 DENV4)循环在大多数流行国家( 5]。登革热是世界范围内最快速增长的mosquito-transmitted疾病( 6]。

登革热病毒粒子有一个二十面体对称,直径在500年和600年之间( 7]。病毒基因组由11 Kbp单一正链RNA编码为一个多元蛋白。多元蛋白质在细胞质中裂解成几个结构和非结构多肽( 8]。结构蛋白包括衣壳(C)、premembrane(人口、难民和移民事务局)/膜(M),和包膜糖蛋白(E)参与病毒粒子的形成。NS2b,非结构蛋白(NS1, NS2a NS3, NS4a, NS4b, NS5)负责病毒复制,装配,和免疫反应逃生 8]。

E糖蛋白在病毒进入的过程中是最重要的分子,因为它似乎是负责细胞表面受体识别和依恋,触发了网格蛋白介导的内吞作用和随后的病毒和细胞膜的融合。这种蛋白质可以与不同的细胞分子相互作用;因此,它是一个理想的目标开发新的抗病毒药物( 9- - - - - - 12]。E糖蛋白是由三个领域,再加上一层膜近端杆和一个跨膜锚( 13- - - - - - 15]。我是由八个领域 β包含两个插入循环链桶。第二域包含疏水序列,保存在所有黄病毒。这些疏水序列,也称为融合肽,负责重组E三聚物的插入到细胞膜中融合( 9, 14- - - - - - 16]。域III (DIII)是一种immunoglobulin-like carboxyterminal域,负责最初的细胞受体结合( 17]。此外,DIII是中和抗体的主要目标( 18]。

由于免疫反应的复杂性和这种病毒所产生的病理,尤其是在随后的感染、疫苗的发展一直缓慢,只有一个疫苗已经注册,目前仍在测试的早期阶段在几个地区( 19, 20.]。

目前还没有批准的抗病毒治疗登革热感染。众所周知,登革热患者的病毒血症的持续时间很短。然而,由于高病毒血症相关的严重的疾病的发作,抗病毒药物的使用在疾病的早期阶段可能会阻止疾病的进展,加快复苏的病人。在这里,我们提出了使用登革病毒信封(E)糖蛋白作为目标搜索肽可能干扰感染过程的第一步。我们选择DENV-2 E糖蛋白和DIII目标筛选M13噬菌体随机肽显示。

噬菌体展示技术被用在过去几年来识别多肽与特定的绑定活动各种各样的目标。这种技术已经非常有用的识别mimotopes,小说抗病毒药物( 21],peptidomimetic药物[ 22),和许多其他应用程序。

在这里,我们表明,DENV2 E糖蛋白,以及域III (DIII),目标识别的有用phage-displayed肽与潜在的新的抗病毒药物。这里我们描述三肽,抑制病毒传染性和不宽容的细胞毒性。完全盲目的对接与这些多肽模拟显示在第三域的包膜蛋白结合位点,稳定的主要疏水相互作用。这些发现打开新的可能性的设计优化和完善新的peptidic抑制剂被这种病毒感染。

 2。材料和方法 2.1。细胞,病毒,和肽

维洛细胞(美国写明ATCC ccl - 81)被用于2登革热病毒传播,斑块的形成分析,细胞毒性分析。这些细胞生长在MEM和10% FCS 50 μ在37°C和g / ml庆大霉素,5%的公司2。登革2型病毒,是一种礼物从研究部门,研究所Conmemorativo Gorgas de Estudios de la祝您健康(ICEGS),巴拿马。Heptapeptide随机图书馆获得了来自新英格兰生物学实验室(美国)。合成肽从Genscript(美国)。完整的DENV2 E糖蛋白(猫。穴数- 034)是获得ProSpec-Tany TechnoGene(以色列)。组织培养、分子生物学,和通用试剂来自Nunc Sigma-Aldrich(美国)。

 2.2。重组蛋白表达

序列编码DENV2 E DIII (aa 289年至405年)获得了从基因库(NCBI完整基因组参考序列:NC_001474.2)表达和优化 大肠杆菌使用在线工具(GeneOptimizer Geneart)。优化序列合成(IDT)和subcloned NdeI-XhoI限制性位点的表达质粒pET-30b (+) (Novagen)使用标准的重组DNA技术。这个质粒的诱导生产指导DIII +氨基酸低浓缩铀和Glu 6 c端xhis尾巴。这个片段的E蛋白含有125个氨基酸和近似分子量14.2 kDa。表达质粒被测序和转化为验证 大肠杆菌应变BL21 (DE3)表达式。单一的殖民地在LB培养基培养含有抗生素在37°C和250 rpm和0.5毫米IPTG诱导OD600年达到0.6。经过4个小时的感应细胞被离心收集和保存在−20°C到净化。重组蛋白的表达是不溶性部分,进一步净化了包括包涵体隔离,增溶,和亲和力净化在变性条件下,重折叠,透析。

 2.3。纯化的重组DIII

冻结颗粒从诱导文化是悬浮在寒冷的裂解缓冲(10毫米Tris-HCl pH值7.5,5毫米benzamidine-HCl, 5毫米EDTA,德勤5毫米,0.3毫克/毫升溶菌酶,PMSF和1毫米)和细胞溶解,声波降解法在冰上。包涵体是通过离心,用50 mM磷酸盐缓冲剂,5毫米EDTA, 200毫米氯化钠,0.5 M尿素,特里同x - 100和1%,恢复像以前一样,用50 mM磷酸盐缓冲剂,EDTA 1毫米,和1 M氯化钠,随着变性缓冲区(10毫米Tris-HCl pH值8.0,100毫米不2阿宝4、100毫米氯化钠和6 M GuHCl)。可溶性包涵体的纯化使用Ni-NTA superflow墨盒(试剂盒)。后加载和洗涤缓冲C (6 M GuHCl, 100毫米不2阿宝4100毫米HCl, pH值6.3),蛋白质与缓冲E (6 M GuHCl,筛选了100毫米不2阿宝4100毫米HCl, pH值4.5)。试图透析对PBS导致蛋白质沉淀;因此我们测试了几重折叠条件使用蛋白质重折叠工具包(皮尔斯,美国)。最后,再次折叠是通过稀释到重折叠的缓冲RB7(1毫米谷胱甘肽,1毫米GSSH, 1毫米EDTA, 1.1 GuHCl Tris-HCl 55毫米,pH值8.0,21毫米氯化钠,氯化钾和0.88毫米)。复合蛋白透析反对TBS,过滤消毒,并由BCA法估计的数量。

 2.4。体外病毒阻断试验测试蛋白质重折叠

复合重组DIII整除,从几重折叠条件,获得第一次直观地检查聚合。那些没有显示聚合在病毒感染阻断实验测试,来检查他们的细胞受体结合的能力和抑制病毒感染的第一步。维洛细胞被镀在96 - 10孔板4细胞每在完全培养基(MEM、10% FCS和50 μg / ml庆大霉素)。第二天,细胞用PBS和孵化复合蛋白质(100 μl, 50 μg / ml)在维护媒介(MEM, 1% FCS,和庆大霉素)为30分钟37°C。然后细胞被洗和孵化DENV2 (MOI = 3, 50 μl),包含在同一浓度、复合蛋白1 h在37°C的维护中。与维护中,细胞再洗,补充和孵化37°C, 5%的公司2。5天之后,细胞病变效应量化使用基于化学发光的ATP检测(CellTiter-Glo®细胞生存能力分析,Promega)。

 2.5。,biopan

噬菌体展示了使用Ph.D.-7噬菌体展示肽库根据制造商的指示。四轮平移是使用两个目标完成,完整的DENV2信封,或获得的重组DIII如上所述。对于每个移一步,几个井在九十六-孔板在4°C,然后涂在一夜之间与400年了 μl (0.1 NaHCO3(pH值8.6)和5毫克/毫升BSA 1 h在4°C。六个洗后TBST (TBS, 0.1%渐变20),100年 μ包含10 l TBST的噬菌体11空斑形成单位被允许绑定1 h rt,然后井与TBST洗十次和噬菌体筛选了0.2 glycine-HCl pH值2.2,1毫克/毫升BSA。与三羟甲基氨基甲烷pH值9.1液中和后,噬菌体是效价和批量放大 大肠杆菌下一轮。为了增加严格的选择,进行几轮增加在洗Tween-20的浓度,减少目标固定在固相的数量。第四轮之后,筛选了噬菌体镀,采摘,并为后续phage-ELISA传播和测序。

 2.6。Phage-ELISA

DENV2 E, DIII, BSA涂96孔微量滴定板(MaxiSorp Nunc)一夜之间在4°C。与TBS-BSA盘子被封锁,用TBST洗净、孵化和1012空斑形成单位个人的噬菌体。洗后,HRP-conjugated anti-M13单克隆抗体(美国通用电气医疗集团)补充说,孵化,洗。颜色是由添加三甲衬底溶液与盐酸1 N 10分钟,停止了。板块在405 nm读。噬菌体克隆target-to-background最好的信号比选择进行DNA测序。DNA插入是由循环使用96 - giii测序引物所推荐的制造商。序列标识和残留色素是实现JalView v.2.10.1 [ 23]。着色是Zappo方案后,残留彩色根据其理化性质如下:粉红、脂肪族/疏水;橙色,芳香;红色的,积极的;绿色,消极;蓝色、亲水;品红色,脯氨酸/甘氨酸;和黄,半胱氨酸。

 2.7。病毒蚀斑减少化验

维洛细胞被播种(2×105细胞每一夜之间)在6-well板块和孵化。肽是准备在几个与100微升DENV2稀释和混合,最终成交量为150 μl。混合物在RT孵化1 h,然后添加到细胞单层膜和孵化1 h在37°C的吸附。然后培养液被细胞被清洗和覆盖与维护中1%甲基纤维素和培养5天。然后中吸气;细胞被固定为10%甲醛和沾1%结晶紫。病毒斑块被视觉计算值实验组单独病毒相比,参与控制。

 2.8。肽细胞毒性试验

肽与细胞培养病毒蚀斑减少化验中描述的一样(1 h 37°C)然后冲走细胞ref维护媒介和孵化24小时37°C。然后使用发光细胞毒性估计通过测量细胞ATP所描述的制造商CellTiter-Glo®细胞生存能力分析。生存能力估计通过比较阅读peptide-treated细胞与参与的细胞。

 2.9。Peptide-Protein对接模拟

蛋白质结构用于peptide-docking分析要么是获得的蛋白质结构数据库(DENV信封的蛋白质,PDB 1赶紧走吧)或在我们的实验室获得同源建模(DIII)。序列对应表达蛋白质被用来获得结构同源性建模使用I-TASSER web服务器( 24]。最好的模型预测I-TASSER呈现良好的预测价值( C 分数= 0.77)结构密切相关的几个病毒包膜糖蛋白PDB数据库中。研究可能的绑定模式的活性肽,我们进行了计算对接分析使用CABS-dock web服务器使用默认参数除了仿真周期的增加到200 ( 25]。最好的姿势,排名根据轨迹特点,进一步分析了使用LigPlot描述分子间的相互作用+( 26]。

 2.10。统计分析

表示,中位数比较参与控制和所有其他组之间利用克鲁斯卡尔-沃利斯和邓恩的多重比较检验,如GraphPad棱镜实现软件。

 3所示。结果与讨论 3.1。表达、纯化和重折叠的重组DENV2信封域三世

登革病毒信封是一个二类病毒融合蛋白。这种蛋白质是一个 β与三个ectodomains链丰富,细长的分子,集中位于DI,熊的顶端DII融合循环,和Ig-like DIII,这是连接到短,茎,跨膜糖基( 14, 27]。DIII经历剧烈的重新定位在过渡到fusogenic E蛋白的构象,从而导致重排从二聚的三聚物的形式 15, 28]。DENV E域三世Ig-like形式 β由一个二硫桥桶结构稳定。

DIII信封的关键部分,因为它是受体结合域( 13, 29日]。也非常抗原和抗体这一领域能有效中和病毒感染( 18, 30.]。考虑包膜蛋白的重要作用,以及它的第三域,我们决定寻找这种蛋白质肽与绑定活动,试图找到新颖的分子能够损害感染过程。为了这个目的,我们选择了噬菌体展示作为一个健壮的方法,让数百万的快速筛选和选择peptidic变异为绑定各种目标的能力。作为完整的包膜糖蛋白是一个很大的蛋白质,可能存在许多可能的非生产性的结合位点,我们也选择了与域第三屏幕随机肽库获得在我们的实验室。

该地区编码域三世DENV2包膜蛋白的获得作为一个合成片段来自商业来源在密码子优化 大肠杆菌表达式。这个片段是subcloned进入 大肠杆菌表达载体pET-30b一T7启动子的控制下,融合6 c端xhis尾巴。IPTG诱导后, 大肠杆菌文化表现出高水平的表达的重组蛋白(图 1(一)),占总蛋白的50%以上,从Coomassie彩色sds - page凝胶光密度分析(数据没有显示)。随着重组蛋白主要存在于不溶性聚合物,净化协议包括一个隔离和洗涤包涵体,紧随其后的是亲和力的亲和纯化Ni-NTA变性条件下的色谱法。这里的亲和纯化过程实现允许一个高纯度制备DIII(图 1(一))。

克隆、表达 大肠杆菌,和净化的密码子优化,登革2信封域三世。(一)蛋白表达和纯化的sds - page显示几个步骤。1、总溶解产物的细胞在诱导;2、总溶解产物IPTG诱导后的细胞;3、蛋白质分子量标准;4、可溶性内含体之前加载到Ni-NTA列;5,列材料;6 - 7,连续两个洗;8 - 9,连续两个洗脱。(b)活性的纯化和复合重组领域三世DENV2州立细胞。 Protein was refolded using several refolding conditions (RB1 to RB9) before dialysis and filtration for testing against the virus, in parallel with virus alone and ribavirin as a control. Data is presented as the mean and SD of two independent experiments. Condition RB1 was not used in this experiment as protein consistently precipitated.

几次试图再折起这种蛋白质稀释到PBS失败由于降水;因此,这种蛋白质重折叠条件进一步探讨使用几个实验条件。这些测试包括不同浓度的重折叠代理和添加剂,如精氨酸、减少和氧化谷胱甘肽和/或聚乙二醇( 31日]。已经表明,登革热信封DIII可能作为主要感染过程的消极抑制剂( 10, 32- - - - - - 35];因此,我们决定使用这一标准来评估复合DIII的功能。重折叠后测试,每个蛋白质制备透析TBS,过滤消毒,并测试在DENV2病毒绑定阻断试验州立细胞。我们发现,重组蛋白复合缓冲RB7(1.1胍,55毫米Tris-HCl, pH值8.2,氯化钠21毫米,0.88毫米氯化钾,谷胱甘肽1毫米,和1毫米EDTA)显示显著抑制感染(图 1 (b)),而没有细胞毒性的迹象(数据未显示),这表明蛋白质折叠和功能。这个过程被使用在一个更高的规模来隔离,biopan和进一步的重组EDIII步骤。

 3.2。选择Phage-Displayed信封绑定肽

为了选择peptidic绑定两个目标,我们使用一个随机heptapeptides图书馆提出了M13噬菌体pIII蛋白质。这些噬菌体将包含1到5的副本肽/衣壳,理论上允许更高的亲和力的选择绑定。鱼饵的平移过程中,两个来源的蛋白质被使用,(1)重组,insect-expressed DENV2信封和(2)重组, 大肠杆菌表示域三世。平移过程涉及四个轮的噬菌体选择固体phase-bound蛋白质和随后的洗脱和放大。在平移过程对蛋白质,筛选了噬菌体的数量逐步增加(图 2),提出一个有效的浓缩特定的噬菌体。决赛后,24个噬菌体随机选择从每个平移方案,传播,净化来测试他们的绑定能力phage-ELISA各自的诱饵。

筛选了噬菌体被浓缩在连续轮或平移。在每个平移,1011输入噬菌体是孵化与目标蛋白(全DENV2信封或域III)和筛选了在材料与方法中描述。筛选了噬菌体是中和效价估计。数据筛选了噬菌体的绝对数量在每一个步骤。

ELISA筛选了噬菌体的分析显示,许多似乎绑定在一个特定的方式,由吸光度值高表示目标相比背景(BSA)(图 3)。24从每个随机挑选噬菌体平移,12人证实了E糖蛋白和21 E为正域三世片段。这种行为是由噬菌体展示肽STSFWIT轴承,NERALTL, ELLASPW, SPSTHWK, LALAEIT NLQIYAV, SLSSVHD。其他一些克隆没有显示好target-to-background信号比和没有用于测序或后续分析。这一结果并不出人意料,因为工件平移过程可能产生约束力的噬菌体后不绑定在ELISA的上下文。

体外克隆选择的绑定phage-ELISA如图所示。吸光度值通过ELISA噬菌体孵化时的固体phase-bound特定配体(目标)或非特定的配体(牛血清白蛋白作为背景)。anti-M13了噬菌体抗体的绑定。(一)phage-ELISA使用E第三域作为目标的结果。(b)结果时使用完整的E糖蛋白作为目标。

phage-ELISA阳性噬菌体,总共33,提交随机区域的DNA测序。DNA测序显示绑定噬菌体肽有着一些共同的特质,与类似的共识序列包膜糖蛋白(SxSAxxx)和第三域蛋白质(SxSxHTL)(表 1,图 4)。相应的肽有大量的负电荷氨基酸残基构成,与带正电的插入,亲水和脂肪族/疏水残基(图 4)。由此产生的肽序列是一致的蛋白质(DIII)被另一个更小的部分(E),分享一些共识序列相似之处,共识对DIII肽选择似乎更明确。有趣的是,一些噬菌体轴承选择同一肽与蛋白质和似乎在最后一轮洗脱(表重复 1)。一些噬菌体观察几次也像是一个成功的浓缩特定绑定在平移的步骤。

肽序列的随机区域和频率的噬菌体。

目标:信封 目标:第三域
肽 频率(%) 肽 频率(%)
DYPANKH 10 AAHYEHR 5
ELLASPW 20. FMXSHNG 5
LGSPMSN 20. HAMRAQP 5
NERALTL 20. HFWHLTP 5
SPSTHWK 10 LALAEIT 5
STSFWIT 10 LSNNNLR 10
YHKQIGP 10 MNPSKSL 5
NERALTL 15
NLQIYAV 5
SLSSVHD 5
SPSTHWK 15
STSFWIT 5
SYQSHYY 5
VSSTHLY 5
WNAKYTL 5

造成粘结剂噬菌体肽序列得到phage-ELISA确认。(a)肽产生平移充分DENV2信封。(b)产生的肽重组DENV2信封上平移域三世。序列标识和共识序列,计算使用JalView,下面描述每个列表的肽。着色的残留物和序列标识按Zappo计划,残留在哪里彩色根据其理化性质如下:粉红、脂肪族/疏水;橙色,芳香;红色的,积极的;绿色,消极;蓝色、亲水;品红色,脯氨酸/甘氨酸; and yellow, cysteine.

绑定的噬菌体所示进行肽序列已经报道,biopan数据银行存储库,写这篇文章的时候,有超过23700年,biopan数据序列出现( 36]。之前报道的肽SPSTHWK和WNAKYTL也将水晶Ni3B纳米颗粒( 37]。此外,肽NERALTL数据库中出现两次,有约束力的环氧覆盖表面的活动( 38)和传染性鲑鱼贫血病毒融合蛋白( 39]。以前曾有报道称,此外,肽LSNNNLR绑定保利(dimethylsiloxane) [ 40]。

 3.3。活动选择的肽和绑定的可能模式

从ELISA验证绑定噬菌体肽合成含有附加Gly-Gly-Gly-Ser间隔的c端酰胺化和羧酸盐块负电荷,按照制造商的建议来模拟演示的上下文M13 pIII蛋白质。然后合成肽进行测试检查能力损害DENV2州立细胞的感染。合成肽ELLASPW、SYQSHYY STSFWIT显示抑制活动对DENV2感染蚀斑减少测试(图 5 (b))。一些肽显示好的体外绑定到目标蛋白质并没有显示出一致性抑制病毒活动,也就是说,肽SPSTHWK,被认为是不利于病毒抑制(图 5 (b))。自从肽被孵化只吸附期间(1 h在37°C),可以观察到抑制是由于干涉这个病毒生命周期的初始步骤或由于杀病毒的活动。需要更多的实验来阐明这些缩氨酸的确切的作用机制。活性肽孵化时单独与维洛细胞与病毒感染的相同的条件,没有细胞毒性观察(图的迹象 5(一个))。

生物活性肽在维洛细胞活动。(a)活性肽的细胞毒性。细胞被孵化的肽的浓度增加1 h和冲走和细胞培养在维护中24。然后使用发光细胞毒性估计从ATP水平。参与细胞的生存能力估计进行比较。数据的均值和标准差作为两个独立的实验。中位数比较参与控制和所有其他组之间利用克鲁斯卡尔-沃利斯和邓恩的多重比较检验。(b) DENV2传染性抑制肽,如血小板减少化验所示。减少斑块数量的估计相比单独感染病毒的细胞。肽SPSTHWK呈现消极的控制,因为它显示不一致的抗击病毒的抑制活性。 Data is presented as means and standard deviations of two independent experiments.

一些其他肽具有良好的绑定活动在平移和ELISA检测没有抑制DENV2感染并不奇怪,这些小肽可能是绑定到目标区域不重要的功能在绑定和条目。可能是也有可能这些肽合成的形式不同的互动与他们的目标相比,这样当他们在噬菌体的背景下蛋白质机器。

为了探索可能的模式绑定这些肽的目标,我们进行了计算对接分析使用CABS-dock在线服务器( 25]。算法管道之后,这个软件允许灵活,完全盲目的蛋白质肽对接,完成与所有原子重建和优化的最佳姿势( 41, 42]。蛋白质的结构用于对接不是从数据库获得的蛋白质结构(DENV2信封的蛋白质,PDB 1赶紧走吧)或在我们的实验室获得的同源性建模(对于DENV2 EDIII)。

允许对接模拟预测可能的姿势绑定目标蛋白质的活性肽。疏水相互作用的最佳模型预测表明优势氢键(图 6)。有趣的是,包膜糖蛋白的最佳姿势预测和相应的肽ELLASPW也提出了一个结合位点的第三域蛋白质(图 6)。最低的建议构成相互作用能的肽ELLASPW包膜糖蛋白表明疏水相互作用的肽与蛋白质残留I335, K334, L351, V354, F337, E338, V347, K344, R345, M340, Q386, V382 E383氢键。建议的交互与DIII包括疏水肽STSFWIT联系Y377, E403, L387, L389, K307, E311, K310, F402和氢键K388和V308。同样,最好的构成提出了肽与V382 SYQSHYY包括疏水相互作用,M301, P336, E338, L294, K334, F337, I339, N355, M340, K295,与K291 V354, R350和氢键。

活性肽的目标,可能绑定模式探索的分子对接模拟。(a)最优惠的姿势的肽ELLASPW DENV2信封。插图显示了假定的结合位点的更多细节。(b)最优惠的姿势肽STSFWIT和SYQSHYY域三世。肽STSFWIT占据了上层分子的结合位点在这个图。蛋白质中描述他们的疏水性的表面,而肽棍模型。(c)为ELLASPW-envelope交互图。STSFWIT-domain III (d)交互图。SYQSHYY-domain III (e)交互图。交互图是在LigPlot +完成。 Intermolecular hydrogen bonds are indicated by green dashed lines, while hydrophobic interactions are represented by arcs and radiating spokes. Pose figures were prepared using UCSF Chimera.

第三域的登革热信封已被证明是参与的初始步骤绑定病毒受体/附件的因素,特别是氨基酸序列中的380 - igvepgqlkl - 389 ( 13, 43, 44]。有趣的是,仿真表明提出的最佳姿势与这个地区的一些重叠。肽STSFWIT似乎绑定DIII重叠区域380 - 389年的序列,和三个氨基酸的肽:互动L387 K388, L389。肽ELLASPW没有出现阻止或干扰受体结合序列,尽管两残留与肽参与疏水相互作用,E383 Q386。肽SYQSHYY不绑定重叠的受体结合区域,尽管它的一个氨基酸与肽(V382)交互。有趣的是,最后一个肽似乎也非常接近DKLQLK序列结合,互动与残留K291 Q293, L294。这种结合位点可能相关的条目过程赖氨酸291和赖氨酸295被证明是绑定的关键细胞石斑鱼( 45]。尽管最佳姿势这里提出这些肽及其目标之间的交互显示良好的相互作用能概要文件(数据未显示),它还应该指出,由于建模的复杂性小肽,可能还有其他有效的结合位点。可能需要进一步的研究来验证该绑定模式的肽和执行合理,结构改善其生物活性。

噬菌体展示技术已经被几个作者搜索肽互动,与新药开发的最终目标与一些病毒。一些例子包括与活动对抗HIV肽描述( 21, 46),Puumala病毒( 47),西尼罗河病毒( 48纽卡斯尔),病毒( 49, 50)、丙型肝炎病毒( 51, 52),猪繁殖与呼吸综合征病毒( 53, 54)、传染性支气管炎病毒( 55),乙型肝炎病毒( 56[],水貂肠炎病毒 57),日本脑炎病毒( 58),古典猪瘟病毒( 59],流感病毒( 60]。

关于peptidic登革热病毒抑制剂,三个主要策略一直遵循:(1)在计算机设计的多肽,(2)肽模仿病毒蛋白质序列,和(3)肽对病毒蛋白通过平移。虽然抗病毒肽的开发对DENV一直由报告使用前两种方法[ 61年- - - - - - 64年已经做了一些努力,利用通用的噬菌体展示技术寻找新的抗病毒药物。肽识别使用随机肽库包括那些报道Panya et al ., 2014 65年目标信封疏水口袋),这些报道咀嚼et al ., 2015 66年),目标全部DENV2病毒粒子。肽报道这里不共享相同的发现这些作者,尽管结果可能不会完全可比的不同的目标和库。

 4所示。结论

总之,我们使用了一个新策略来识别DENV2传染性的抑制剂,我们发现三肽的随机肽库,能够具体的绑定病毒包膜蛋白在体外抑制传染性,不显示细胞毒性。绑定模式盲目对接仿真表明,提出的这些活性肽及其目标之间的相互作用可以通过疏水相互作用,稳定提供信息有关未来改进新的抗病毒药物对这个重要的病毒。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

卡罗莱纳de la Guardia参与实验工作,起草的手稿。马里奥Quijada参与实验工作的执行。里卡多Lleonart参与设计、试验工作,手稿准备。

 确认

这部分工作是支持由Banco de Desarrollo Interamericano(批准号IND-JAL-02-DENGUE), Secretaria Nacional de Ciencia Tecnologia e Innovacion de巴拿马(SENACYT)和Sistema Nacional de Investigacion de巴拿马(SNI)。作者也感谢亚莲恩的修订手稿和协调小组的研究人员,巴拿马,病毒DENV2应变的捐赠。

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