穿心莲内酯作为NS3-4A蛋白酶的有效抑制剂及其耐药突变体的研究在网上方法

摘要

目前针对丙型肝炎病毒(HCV)基因-1感染的PEG-INF和利巴韦林联合治疗在维持50%感染病例的持续病毒应答方面无效。蛋白酶抑制剂形式的新化合物可以补充联合疗法。作为NS3-4A蛋白酶抑制剂，Asunaprevir是该药物团的新成员，但它易受蛋白R155K和D168A两种突变的影响。因此，在我们的研究中，我们试图评价穿心莲内酯，一种labdan二萜穿心莲香通过分子对接和动态模拟，研究了一种有效抑制NS3-4A蛋白酶及其伴随的耐药突变体的化合物。结果表明，穿心莲内酯与野生型R155K和D168A突变体的对接评分分别为−15.0862、−15.2322和−13.9072，而与Asunaprevir的−3.7159、−2.6431和−5.4149相比，其对接评分最高。此外，如MD模拟所示，该化合物能很好地与目标蛋白质结合，并保持牢固的键，对蛋白质主链结构的扰动很小，可以忽略不计。从对接研究和轨道周期分析来看，我们的结果验证了Asunaprevir对蛋白质变异的敏感性。因此，从我们的研究中，我们希望在药物团中增加一种解决HCV感染耐药的方案。

1.介绍

在发现丙型肝炎病毒超过25年后，丙型肝炎病毒(HCV)仍然被认为是对人类健康的主要全球威胁。全世界有超过1.3 - 1.7亿人感染了这种病毒[1据世界卫生组织统计，每年约有35万至50万人死于与丙型肝炎有关的肝病[2］．聚乙二醇化干扰素-α(PEG-INF)和利巴韦林已被用作感染的主要治疗方法[3.，4］．然而，50%的HCV基因1型感染者由于联合用药未表现出持续的病毒学应答(SVR)， Padmanabhan等人最近使用系统生物学方法探索了其原因[5］．已经确定了与这些无反应观察相关的几个因素，其中一些是个体之间的基因组差异、病毒基因型和干扰素-中的单核苷酸多态性(SNPs)λ轨迹(6，7］．以蛋白酶和聚合酶抑制剂形式出现的新型药物化合物作为直接作用抗病毒药物(DAAs)正在开发中。研究表明，结合PEG-INF和利巴韦林的联合治疗，这些抗病毒化合物已显示在HCV基因-1患者中使SVR从不足50%提高到约70% [8］．然而，这些DAAs的潜力已经被病毒的高突变率和基因组异质性所掩盖[9］．由于病毒复制酶的非亲和性，病毒基因组频繁突变的引入给寻找新的抗病毒药物的药物研究人员带来了困境。

病毒蛋白酶对病毒的感染和增殖至关重要，因此可以认为它们是DAAs干预病毒周期的潜在靶点。在我们的工作中，我们选择了负责切割单前体多肽的NS3- 4a蛋白酶，以及长度为3010-3011的NS2-NS3和NS3蛋白酶，并从长阅读框中翻译出活性蛋白[10- - - - - -12］．许多蛋白酶抑制剂如telaprevir或boceprevir已经被FDA批准作为蛋白酶的有效抑制剂;然而，这种蛋白质的突变导致药物迅速失效[13，14］．Asunaprevir是百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb)开发的另一种有效蛋白酶抑制剂，目前正处于第三临床试验阶段。然而，Asunaprevir的结合能力受到了两个蛋白结构突变的限制，即R155K和D168A [15］．这些蛋白酶的晶体结构可在蛋白质数据库(PDB)网站上公开，基于结构的药物设计方法可用于筛选过剩的新DAAs，这些新DAAs可以对蛋白质中的任何伴随突变具有最大的结合效率。植物被认为是药用化合物的重要来源，它们可以在最小的预算关注下快速、顺利地推动药物发现过程[16］．穿心莲香楝属棘科草本植物。它具有广泛的药理作用也包括抗病毒活性[17- - - - - -19］．该植物提取物含有多种植物化学物质，其中以二萜和类黄酮为主。穿心莲内酯，一种labdan二萜，是从植物提取物中提取的主要生物活性化合物[20.］．

因此，我们的工作旨在探索穿心莲内酯对蛋白质突变的分子对接和动力学结合潜力，并与Asunaprevir进行计算比较。

2.材料和方法

2．1．蛋白质制备

使用查询ID 4NWL从蛋白质数据库(PDB)检索野生型NS3蛋白酶的3D结构[21］．共结晶配体、水分子和锌离子从目标结构中去除，获得干净的蛋白质[22］．通过将蛋白中的天然残基替换为突变残基(R155K和D168A)制备蛋白突变体[23使用ds3.5“构建突变体”选项。通过使用ds3.5中的CHARMm力场对结构进行经典优化，采用共轭梯度能量最小化协议进行最小化，然后再进行收敛能量最小化(0.001 kcal/mol)，为结构对接和模拟做好准备[24］．活性部位残留(Q41, F43, H57, G58, D81, R109, K136, G137, S138, S139, G140, G141, F154, R155, A156, A157, D168, M485, V524, Q526，和H528) ［25]分别为野生型蛋白和突变型蛋白进行分子对接研究。

2．2．配体的准备

研究化合物穿心莲内酯和Asunaprevir采用Marvin sketch [26］．配体优化是利用哈佛大学分子力学化学(CHARMm)和大分子力场(MMF)进行的，遵循能量最小化协议[27］．根据键能、粲能、二面体能、静电能、初始势能和初始RMS梯度值生成了几种配体构象。通过Lipinski药物过滤协议使用Lipinski 5规则评估药物的可能性[28］．对ADME的水溶解度、血脑屏障水平、肝毒性、血浆蛋白结合水平、CYP2D6进行研究[29］．利用TOPKAT预测配体分子的毒性分布，TOPKAT应用一系列稳健的、交叉验证的、定量结构-毒性关系(QSTR)模型来评估特定毒理学终点。毒性概况还包括国家结核控制计划的致癌性、诱变性、发育毒性和皮肤刺激评估[30.］．研究使用Discovery studio 3.5 (Accelrys)进行。

2．3.分子对接与动力学

在分子对接研究中，采用了一种灵活的对接方法，使用LeadIT [31，其中野生NS3蛋白酶和突变体R155K和D168A被认为是受体蛋白。受体-配体配合物的对接结果包括分子间相互作用能，即氢键和疏水静电相互作用。用最小结合能的受体-配体复合物推断最佳结合化合物。以灵活的方式对蛋白质和配体进行分子动力学模拟，允许配体周围的结合位点放松，并直接估计外显水分子的影响。基于md的计算方法包括热力学积分(TI)、自由能微扰(FEP)、线性相互作用能(LIE)和分子力学/泊松-玻尔兹曼和表面积(MM/PB-SA)方法。三个最好的受体-配体配合物的分子动力学研究的基础上最大体面的最小化方案。动力学研究中，考虑整个生产周期为20 ns，时间步长为0.001，温度因子为300 K，加热步长为2000，时间步长为0.001，平衡步长为1000，时间步长为0.001。根据最小的势能值选择最佳构象[32］．

3.结果和讨论

3．1.蛋白质制备

获得的蛋白结构具有C型肝炎病毒基因1a型蛋白酶结构域的单链结构，在n端有一个共价连接的辅因子4A [21］．该蛋白酶属于EC (Enzyme Commission)分类中的水解酶类，EC编号3.4.21.98。它是一种双功能酶，具有图中所示的两个结构域1，即位于−7 ~ 87 aa之间的丝氨酸蛋白酶n端结构域和位于88 ~ 182 aa之间的具有NTPase核酸结合和解旋酶活性的DExH/D-box解旋酶超家族II的c端结构域。DS中的“构建突变体”选项为突变R155K和D168A生成了具有离散优化势能分数的单一优化结构[33(DOPE得分)分别为−19975.94和−20031.18。通过保持如图所示的并排结构，比较了氨基酸主链的变化2．从图中可以清楚地看出主链结构的差异，由此可以推断，这种变化可能导致药物分子结合的空间位阻增加。活性位点残留已从结构的PDB记录中提取。数字3.显示活性位点内及周围残基的结构构象。它清楚地显示了结构中的空腔，配体分子应该在那里。

3．2．配体的准备

穿心莲内酯是一种labdan二萜化合物，具有广泛的药理潜力。它已被证明具有抗病毒和抗疟疾的作用。因此，我们认为它是一种解决HCV感染耐药的有效化合物，并比较了其对突变敏感的Asunaprevir的效力。所研究化合物的二维结构和分子性质如表所示1．Asunaprevir可能生成的3D构象为1，穿心莲内酯可能生成的3D构象为16。在生成的构象中，选择势能最低的构象进行进一步研究。与ADME和TOPKAT预测的一致性如表所示2和3.．这两种化合物预计都是安全的，毒性很小。Asunaprevir被预测有轻微的肝毒性;然而，需要注意的是，这些预测是基于某些已建立的算法定义的，有时在真实的设置中可能不可靠，这是合理的，因为Asunaprevir已经通过了临床试验的初始阶段(即，I和II)。这两种化合物的致突变性水平也被预测是低的，因此预测它们对任何系统给药都是无毒的。

3．3.分子对接与动力学

分子对接是预测配体与三维结构蛋白初步结合模式的有效方法。结合位形的研究对于阐明小分子与受体之间的关键相互作用至关重要，为设计有效的抑制剂提供了有用的数据。本研究采用柔性对接方法，利用Biosolve LeadIT将化合物对接到蛋白质结构的活性位点。使用柔性对接的基本原理是给予化合物足够的灵活性，以获得所有可能的三维空间构象，而不是只限制某些刚性结构。对接结果表明，穿心莲内酯有效占据了天然蛋白及其结构变体的结合区域，对接得分高于Asunaprevir。绑定评分和交互留数的详细概述如表所示4．此外，配体-受体相互作用的对接位姿如图所示4．铅- it对接得分与自由结合能相关。穿心莲内酯与天然蛋白结合，Lead-IT评分为−15.0862，并通过氢键与三个氨基酸残基相互作用，即SER138, SER139和HIS57。在R155K突变结构中，化合物与SER138、SER139、ALA157、HIS57、LYS136和GLY137残基形成6个氢键，对接评分为−15.2322。同样，该化合物与D168A突变结构的对接得分为−13.9072，并通过与SER138、SER139、ALA157、HIS57、LYS136、SER139等氨基酸残基的6个氢键再次相互作用。在所有的蛋白结构中，Asunaprevir的结合得分都很低，R155K突变得分最低，仅为−2.6431。这是预期的，因为在不同的文献中描述了对突变的高易感性;原因是Asunaprevir与底物包膜外的R155残基接触，因此由D168残基稳定，因此任何残基中的任何一个突变都会破坏Asunaprevir和酶之间的相互作用[15］．因此，我们的结果表明，穿心莲内酯与蛋白结构的结合能力优于Asunaprevir。

为了比较野生型和突变型蛋白质的结构行为和灵活性，这两种先导化合物都被纳入Discovery studio MD模拟运行中，并进行了20次研究如材料和方法中提到的，每个配合物的所有参数的ns。动态模拟运行创建了一个系统，试图模拟生理环境，以检查配体是否真的在靶蛋白空洞内稳定，维持键，并能够抑制活性一段时间，从而导致治疗行动。可以看出，配体-蛋白质体系很容易达到给定的300 K的温度，并在整个运行过程中保持在其附近(图)5）.均方根偏差(RMSD) [34]的初始结构计算了突变体和野生型的蛋白质-配体复合物的初始结构，并生成了图表来比较配体与结构结合后的灵活性。在模拟过程中，蛋白质的主链保持相当稳定，如图所示6．Asunaprevir的结合没有干扰D168A和野生蛋白结构的蛋白主干稳定性。然而，在突变体R155K结构中，结合引起了主链的相当大的扰动，最终RMSD值偏移0.5 nm。与Asunaprevir相比，穿心莲内酯在野生型和D168A突变体中均干扰了脊柱。然而，在R155K突变体结构中，与Asunaprevir相比，穿心莲内酯的结合并没有对主干造成太大的破坏，这意味着穿心莲内酯与突变体的结合是稳定的。这可能是由于穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的小分子大小,给它足够的自由空间,而Asunaprevir,鉴于其规模和翻边化学根,不会有更多的自由,在模拟周期短Asunaprevir和蛋白质的原子之间的空间障碍开始使系统不稳定。为保证候选药物在蛋白质活性位点的结合稳定性，生成各导联分子配体位置RMSD并绘制。从图中可以看出7与R155K突变体相比，Asunaprevir在2.0-3.5 nm明显波动较大。与我们的配体分子相比，它与D168A突变体结合不稳定;但与野生型的结合稳定性稳定，偏差很小。穿心莲内酯与所有蛋白质结构均表现出稳定的结合。

4.结论

大多数直接作用的抗病毒药物是针对抑制蛋白酶和聚合酶的。NS3-4A丝氨酸蛋白酶是HCV最有趣的靶点之一，在HCV感染和增殖中起关键作用。许多抑制这种蛋白酶的抗病毒药物已经在临床试验阶段，其中Asunaprevir是靶向HCV丝氨酸蛋白酶NS3-4A的第一批竞争性抑制剂。然而，由此产生的副作用和药物对HCV突变体R155K和D168A的敏感性限制了其潜力。在本研究中，我们比较了Asunaprevir和二萜穿心莲内酯与野生型HCV蛋白酶及其突变体的互作效率。LeadIT分子对接研究显示，Asunaprevir与野生型R155K和D168A结构的对接得分分别为−3.7159、−2.6431和−5.4149,Andrographolide与野生型R155K和D168A结构的对接得分分别为−15.0862、−15.2322和−13.9072。由此推断，与Asunaprevir相比，穿心莲内酯在野生型和突变体中都能以最少的能量与蛋白质的活性位点残基发生强烈的相互作用。通过ds3.5的分子动态模拟工具对配体-蛋白复合物的稳定性进行了评估。通过计算主链RMSD数据，我们发现Asunaprevir在野生型和D168A结构中都保持了蛋白的稳定性，但干扰了R155k主链。与Asunaprevir相比，穿心莲内酯确实扰乱了野生和突变体D168A的主干结构，但对突变体R155K的干扰不大。 We used ligand RMSD calculation data to infer about the binding stability of ligands with the structures. Asunaprevir showed more fluctuations in R155K complex than in others. Andrographolide was binding stably in all the structure types inferring the interactions are strong. Therefore, our study reports that Andrographolide can act as a promising option to target and inhibit NS3-4A along with its drug resistive mutants.

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者要感谢印度卡纳塔克邦图姆库尔Siddaganga理工学院的管理人员、校长、主任和生物技术系主任。作者也感谢KBITS的支持，为他们提供了开展这个项目所需的计算资源。

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