基于Web的体外转录/翻译系统优化硫矿硫化叶菌细胞裂解物

摘要

描述了一种系统，其允许有效地合成蛋白质体外在高温下。它是基于使用未分离的细胞裂解物（S30）从硫矿硫化叶菌以前在我们的预验证MRNA翻译实验室具有很好的特征，现在适于进行偶联的转录和翻译。该表达系统中的基本要素是衍生自源自的强大促进剂S. solfataricus.编码的rRNA-16S / 23S基因，从该特异性mRNA可以高效率地转录。两种不同蛋白质的合成的报道，其中包括S. solfataricus.DNA-烷基胍-DNA-烷基转移酶蛋白（SS.OGT），其显示用适当的荧光基质成功标记并在细胞提取物中可视化。蛋白质的实验程序和特异性活性的简单性提供了蛋白质结构函数关系研究的许多可能性。

1.介绍

最初用于研究细胞生物学的某些基本方面的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统，例如解读遗传密码的结构或阐明转录和平移控制的基本特征[1-3.］.后来，CFPS系统还成为强大的工具，用于生产高量蛋白质，用于各种应用范围从药物用作蛋白质结构分析[4.那5.］.

这些系统最简单的形式包括全细胞裂解物（S30提取物），包含转录、翻译、蛋白质折叠和能量代谢所需的所有元素。通常，CFPS系统使用两种不同的底物进行蛋白质表达编程：仅用于翻译的RNA模板或用于耦合转录/翻译的DNA模板[6.那7.］.

CFPS系统的优点体内方法是多方面的。一个可以与所有需要支持细胞活力和增长的程序免除;此外，处理的，而不是全细胞细胞提取物有利于主动监控，快速采样，和蛋白合成过程的直接操作。最后但并非最不重要的，简单和准备细胞提取物的低成本使系统感兴趣蛋白质的合成可用的工具中的优先选择。

最常用的无单元翻译系统包括大肠杆菌(ECE)提取液、兔网织红细胞(RRL)、小麦胚芽(WGE)和昆虫细胞(ICE)，每一种细胞都具有独特的特性[8.-10］.大肠杆菌CFPS是最经济方便的方法，因为提取液制备简单，价格低廉，可以高产地生产所需的蛋白质。然而，当需要生产某些类型的复杂蛋白或需要真核生物翻译后修饰时，来自真核细胞提取物的CFPS可能是最好的选择。

在我们的实验室中，我们已经开发了来自嗜热archaeon的CFPS. solfataricus.，我们已经成功地将其用于破译古细菌翻译和高温翻译的许多方面[11那12］.然而，我们的标准系统仅使用预先验证的RNA模板，而来自超嗜热嗜热嗜的CFPS允许基于所采用的系统的内源性组成部分的耦合转录/翻译，以至于我们的知识迄今为止，已经描述。

然而，出于许多原因，开发这样一个系统是非常必要的。首先，它代表了一个强大的工具，以扩展我们的理解分子机制的耦合转录-翻译古生菌。此外，重组蛋白在与天然蛋白相似的嗜热条件下表达，有助于相关因子的鉴定。此外，尽管中嗜菌宿主如大肠杆菌已用于生产用于生化和结晶表征的热稳定蛋白[13[许多高热蛋白质仅在高温的生理条件下正确折叠，或在其天然发生后改变的情况下进行[14那15］.

我们在这里报告一个耦合的发展体外嗜热太古菌无细胞蛋白质合成的转录/翻译系统S. solfataricus.．该系统与质粒载体的工作，获得克隆的强启动子从S. solfataricus.16S/23S rrna编码基因上游的一个先前已明确的特征苏尔菲罗博勒斯基因(16］.进行了影响蛋白质合成率和产量的各种参数和组分的初步评估。通过这个系统，我们获得了体外两种不同蛋白的表达，其中一个也显示在70℃的温度下酶促活性。

2。材料和方法

2.1。细胞提取物的制备和总TRNA

细胞裂解物能力体外用先前描述的方法制备翻译[17］.简单地说，用两倍量的氧化铝粉手工磨碎约2g冷冻细胞，并逐渐加入小于2体积(相对于细胞颗粒重量)的裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 10 mM Mg(OAc))₂， 40毫米NH_4.Cl和1mm DTT)。该过程是将砂浆放在冰上，并在寒冷的房间中工作不超过15分钟。通过在30000 ×g下旋转混合2次，30分钟，并注意只提取大约三分之二的上清液，来去除细胞碎片和氧化铝。细胞裂解液的等量(0.05 ml)储存在−80℃，Bradford测定的总蛋白浓度在相应的20-25 mg/ml范围内。未分离tRNA从S. solfataricus.通过进行粗S100分数的苯酚提取并用2.5体积的95％乙醇沉淀水相来制备。将RNA沉淀重悬于10mM甘氨酸（pH9.0）中，将溶液在37℃下孵育2小时，以实现其中含有的TRNA的碱性脱酰基化。最后，再次沉淀RNA，并将所得沉淀溶于足够的10mM Tris-HCl（pH7.5）中。

2.2。基因结构和体外转录

我们使用质粒pBluescript-SK(+)作为我们后续构建的起点。在16S/23S rRNA操纵子启动子序列上设计了两个合成DNA低聚物，包含48个核苷酸[18它的序列在所有情况下都是相同的守恒的S. solfataricus.物种：启动子RRNA SSO前进5 -CGAAGTTAGATTTATATGGGATTTCAGAACAATATGTATAATGGGTAC-3和启动子RRNA SSO反向5 -CCATTATACATATTGTTCTGAAATCCCATATAAATCTAACTTCGGTAC-3 ．两种引物在5结束对应于突出的粘性5的序列结束KpnI限制性内切位点，两者分别在25μ.l含有70mM Tris-HCl（pH7.6），10mM MgCl的反应混合物₂、5 mM二硫苏糖醇、1 mM三磷酸腺苷、4 mM三磷酸腺苷μ.M DNA, and 10 units of T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs). After incubation at 37°C for 1 h, the reaction mixtures were combined and the kinase was heat-inactivated at 70°C for 10 min. Annealing of the two oligomers was obtained by heating this mixture at 100°C for 4 min and slowly cooling down to 37°C. The integrity of the double-stranded 16S/23S rRNA promoter fragment DNA was checked by agarose gel electrophoresis. One pmol of the purified double-stranded fragment was incubated with 0.25 pmol ofKpn在25次的10个单位的T4 DNA连接酶（新英格兰Biolabs）存在下消化PBS-SK（+）质粒 μ.L 50 mm Tris-HCl（pH7.5），10mM MgCl₂， 10 mM二硫苏糖醇，1 mM ATP, 25μ.G / ml牛血清白蛋白在16℃下为20小时。然后直接使用该反应混合物的十分之一用于转化大肠杆菌前10名胜任的细胞。筛选含有质粒DNA的转化体用于使用A插入物的存在KpnI纯化质粒DNA的限制性内切分析。DNA测序后，选择具有正确插入方向的结构体的克隆，并将其命名为pBS-rRNA_P.．Successively, a fragment of 393 bp containing the gene termed ORF 104 with its Shine-Dalgarno (SD) motif was amplified from the construct pBS800 [12]通过PCR使用以下引物：PROM-104Xho我5 -tttttttctcgag.CCGGAATAGTTGAATTAACAATGAAGC-3（带下划线的序列对应于XhoI网站)和promo -104太平洋标准时间我5 -CATGGTATGCTGCAGTCATTGCTTCACCTCTTTAATAAACTCC-3（带下划线的序列对应于太平洋标准时间我的网站)。片段被插入到Xho一世太平洋标准时间我消化了质粒pbs-rRNA_P.，产生称为PBS-rRNA的构建体_P.-104.生成称为pBS rRNA的结构_P.-ogt我们切下的片段Xho一世太平洋标准时间一世from the previous plasmid and inserted a DNA fragment of 533 bp amplified from the construct pQE-ogt通过PCR与以下引物：转发rRNA /SS.OGTXho我5 -TTTTTctcgag.TGAGGTGAAATGTAAATGAGAGGATCTCACCATCACC-3（带下划线的序列对应于Xho我的网站）和反向rRNA基因/SS.OGT太平洋标准时间我5 -TTTTTTCTGCAGTCATTCTGGTATTTTGACTCCC-3（带下划线的序列对应于太平洋标准时间我的网站)。同样在这种情况下，质粒设计成具有上游的SD基序7核苷酸ogt开始密码子。

2.3。分析转录活动硫矿硫化叶菌裂解体外标签³²P-UTP

转录活动S. solfataricus.测试无细胞提取物³²在两种不同的反应条件下使用相当于100的裂解液加入P-UTPμ.g总蛋白质。从先前的研究中采用第一反应方案[16]:反应体积为50μ.l，在50 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 25 mM MgCl存在下₂，1mM EDTA，1mM二硫代噻唑，2mm ATP，1 mm GTP，1 mm CTP，0.6 mm UTP和100 μ.M（α-³²P) UTP (4Ci/mmol) in a reaction volume of 50 μ.l.反应在60℃下进行30 min。第二个协议是基于体外翻译实验在我们的实验室进行[12那17]：S. solfataricus.无细胞提取物在反应体积为50的条件下孵育μ.l、 当着10个人的面 毫米KCl，20 mM-Tris-HCl（pH 6.8), 20 毫米毫克（有机碳）₂2. 毫米ATP，1 毫米CTP，1 毫米GTP，0.5 毫米UTP和100 μ.M（α-³²p）UTP（4 CI / mmol）。在这种情况下，反应在70℃下进行30分钟。在两个反应结束时，加入20μl，将孵育在37℃下延长30分钟。添加DNase I添加以除去任何可以改变下一个QRT-PCR分析结果的质粒DNA的任何痕量。通过苯酚pH4.7萃取反应产物，并用2.5体积的95％乙醇沉淀。将粒料重悬于足够的废物处理的水中并分成两种等分试样。rnase a（20 μ.将G）加入其中一个，将两种等分试样在37℃下孵育30分钟。将新合成的RNA分离，分离8.5％的Nondenaturing聚丙烯酰胺凝胶，并使用即时成像器装置（Packard）和放射缩影膜（柯达XAR-5）检测。

2.4.体外翻译和耦合体外Transcription-Translation

转录 - 翻译活性在最终体积为25卷测量 μ.l，含10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 6.8)， 20 mM Mg(OAc)₂，1.5毫米ATP，1.5 mm CTP，1.5 mm GTP，1.5 mm UTP，3.3 μ.g块状S. solfataricus.TRNA，5 μ.l为20-25 mg / mlS. solfataricus.S30提取液(70℃预孵育10分钟)，0.5μ.l中的l-(³⁵S)-蛋氨酸(s.a 1175 Ci mmol .^-1在11 mci ml^-1，珀金埃尔默）。混合所有组件后，4 μ.加入所需mRNA的g或不同数量的不同质粒，在70℃下孵育至指定时间。整个细胞裂解液被编程体外翻译与成绩单S. solfataricus.基因orf104和SS.在表中描述的条件下，在T7 RNA聚合酶启动子下游的PBS-SK（+）质粒中克隆在PBS-SK（+）质粒中1．转录前，质粒线性化太平洋标准时间1、实验条件与上述相同，除了CTP和UTP不存在，ATP和GTP存在，最终浓度分别为1.8 mM和0.9 mM。翻译产品的分析通过加载15进行μ.在16%的聚丙烯酰胺/SDS凝胶中孵育混合物;跑步后，凝胶干燥和自动射线照相。

2．5．qPCR和rt - pcrSS.油气痕迹标签

在结束时体外转录或耦合体外transcription-translation, total RNA was purified from the reactions by phenol extraction at pH 4.7 and precipitated by adding of 2.5 volumes of 95% ethanol. The pellets were resuspended in an adequate volume of DEPC-treated water and treated with 2 U of DNase I, RNase-free (Thermo Fisher Scientific) in an appropriate buffer at 37°C for 45 min. The residual products were reextracted by phenol pH 4.7 and precipitated with 2.5 volumes of 95% ethanol. 0.5 μ.对于相对QRT-PCR分析（Sensifast TM cDNA合成试剂盒，Bioline）反向Gn总RNA。使用Applied Biosysystem Stepone实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）使用CDNA和10的QPCR进行QPCR进行QPCR μ.l GoTaq®qPCR Master Mix (Promega)的最终体积为20μ.L循环参数为95°C，持续2小时 min，然后在95℃下进行40次变性循环，持续3小时 秒，并在60℃下退火/延伸30 秒。每个mRNA的相对数量通过2^−ΔΔCt方法并归一化到内源性aIF6 mRNA。qPCR引物序列如下:正向pBS 5 -TGGTAACAGGATTAGCAGAG-3和反向PBS 5 -AccaAatactgtcctTCTAGTG-3. ;aIF6向前5 -ATAAGCGGTAACGATACGG-3和AIF6反向5 -AATCCCTTAGATTCTCCTTCAG-3 ．

通过如上所述进行RT-QPCR，我们测量了从质粒PBS-rRNA转录的RNA的绝对量_P.-104在体外转录-翻译系统中孵育。具体来说，我们将从这些样本中获得的Ct值与连续稀释为1的Ct值绘制的标准曲线进行了比较μ.g的体外转录RNA (pBS-rRNA_P.-104）。对于半定量的RT-PCR，如上所述从混合物反应中提取总RNA。2 μ.在最后的25卷中逆转录g总RNAμ.l为20 u m-mlv逆转录酶20 μ.L根据供应商（Promega）的说明，在42°C下的混合物反应1小时。反应包含1 μ.m以下反向底漆：5 -ggtttcccgactggaaaagcgggcag-3 ．在反应结束时，将混合反应的最终体积调整为50μ.L和RT反应的十分之一是用Taq DNA聚合酶（Promega）在95℃，30秒的30秒，60℃，45秒的延伸步骤中的延长步骤（25个循环），在95℃下进行30秒，并在60℃下扩增30秒。在74°C时7分钟。用于PCR扩增的反向引物在RT反应中使用与下列正向底漆的RT反应相同：5 -CGAATTCCTGCAGCCGGGGGATCC-3 ．反应产物经琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色检测。

对照对应于在不存在质粒的情况下从样品中纯化的RNA和RTA减去CDNA反应的反应。

2.6。SS.OGT体外标签

活动的活动体外-表达SS.分析OGT孵育8 μ.克pBS-rRNA_P.-ogt质粒或200ng重组质粒SS.OGT OGT 200 μ.GS. solfataricus.在上述实验条件下的全细胞提取物，用于在体外转录/翻译和BG-F1基板存在下（2.5 μ.M） 。混合反应在70℃下培养60分钟 通过变性停止反应，并对样品进行SDS-PAGE，然后使用VersaDoc 4000进行荧光成像分析™ 系统（Bio-Rad Laboratories Inc.）采用蓝色LED带通滤波器作为激发/发射参数。对于蛋白质印迹分析，使用Trans-blot®Turbo将蛋白质转移到PVDF过滤器（Bio-Rad Laboratories Inc.）上™ 印迹系统（Bio-Rad Laboratories Inc.）。存在SS.OGT蛋白是通过在兔体内培养的多克隆抗体发现的S. solfataricus.OGT作为一抗，山羊抗兔IgG-HRP（Pierce）作为二抗，以及Amersham Biosciences ECL Plus套件。根据制造商的说明孵育，洗涤和开发过滤器。使用VerseDoc设备（Bio-Rad Laboratories Inc.）揭示了化学发光条带。

3.结果和讨论

3．1.分析体外S30组分的转录S. solfataricus.

为了制备一种高效的S30提取液，我们进行了初步的实验，以验证整个细胞是否裂解S. solfataricus.根据我们的描述的方案[制备17]是胜任的体外转录。具体来说，我们比较了我们的系统的转录活性与之前描述的苏尔菲罗博勒斯体外转录测定[16]测试S30提取物的容量α-³²P-UTP。表中总结了盐和温度条件下的反应1并详细描述材料和方法．在这两种情况下，我们在每个核苷三磷酸盐的最终浓度为1毫米(ATP到2毫米除外)的情况下执行了反应，S30馏分的制备省略了对裂解液的DNase I处理，不像之前公布的协议，添加DNase I以去除基因组DNA [17］.如图所示1在美国，两种S30提取物都显示出招募标记尿苷三磷酸的能力，支持内源性RNA聚合酶活性的观点。然而，根据我们的方案制备的提取物具有更高的三磷酸尿苷掺入效率。

基于一项研究表征促进剂的单拷贝16s / 23s rRNA基因簇的启动子，其急性嗜热archaebacterium苏尔菲罗博勒斯[18[我们将该启动子克隆到PBS-SK（+）质粒中，如下所述材料和方法．构建体含有从-1至-40bp跨越-1至-40bp的16S / 23s RDNA基因的转录开始部位的DNA的upromb的区域。构建体的结构，称为PBS-rRNA_P.，如图所示2（a）．将质粒与S30提取物一起温育，并通过RT-PCR通过退火对克隆基因下游的质粒的特定区域进行的RT-PCR分析其转录，从而排除了内源靶的扩增。结果显示在70℃温育后的质粒的有效转录（图2（b）)．

从这个构建开始，我们克隆了一个以前其特征的特征苏尔菲罗博勒斯编码推定核糖体蛋白的基因[12]，在16S / 23S RDNA启动子的转录控制下。这种质粒的结构，称为PBS-rRNA_P.-104，如图所示2（c）;通过qPCR分析表明，它也转录（图2（d）)．最后,pBS-rRNA_P.用T7 RNA聚合酶在体外转录-104构建体，并使用已知量的相应纯化的RNA绘制校准曲线，用于量化转录反应（图2（e）)．此分析允许我们评估金额体外-将RNA转录到一个数量级，对应于μ.G质粒使用，在25μ.我的反应。

4.优化体外关于NTP和MG的翻译条件⁺⁺离子

接下来，我们调查了是否采取的条件体外转录与S. solfataricus.S30提取物能影响其翻译活动。具体来说，我们力图确定的NTPs的最佳浓度，因为它是公知的是游离的核苷酸螯合Mg的比例数⁺⁺离子，其在明确定义的浓度范围内的存在对于翻译至关重要[19］.为此目的，在不存在或存在不同浓度的NTP的情况下，用预先致致的104 mRNA温育S30提取物，并确定其平移效率。实际上，混合反应中的NTP水平的增加对体外翻译有害（图3（a）)．然而，这可以通过增加MG的浓度来补偿部分补偿⁺⁺离子如图所示3（b）．另一方面，混合物反应中没有NTP完全抑制了系统的活性，因为外源ATP和GTP是能量源（数据未示出的数据）。总的来说，基于数字的结果3（a）和3（b）我们选择在NTP和Mg之间取得平衡⁺⁺，将它们分别设定在6和20 mM的最终浓度。

4.1。转录和翻译偶联蛋白质合成

然后，我们继续验证先前建立的实验条件是否允许偶联转录和翻译。通过孵化不同量的PBS-rRNA来解决这个问题_P.-104质粒与70°C下的裂解物一起作用1小时 h在表中总结的条件下1．如前所述，预期从强RRNA启动子转录该构建体的转录，得到编码核糖体蛋白（ORF 104）的mRNA。预测的mRNA被赋予5 -orf104的AUG起始密码子上游含有SD motif 7的UTR。如图所示3（c），该反应产生约12kDa的主要蛋白质带，对应于ORF 104的预期尺寸。

将上述结果推广到其他方面S. solfataricus.基因，我们亚克隆了O.^6.-DNA-烷基 - 鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶基因（SS.来自pQE的OGT）-ogt构建，以前特征在于Perugino等。[20.］.该基因的产物是普遍存在的蛋白质为约17kDa，参与由烷基化剂引起的DNA病变的直接修复的进化。SS.OGT是其自杀催化反应特有的蛋白质：该蛋白质不可逆的烷基从DNA转移到在其活性位点的催化半胱氨酸。使用强抑制剂荧光衍生物的，所述O.^6.- 苄基 - 鸟嘌呤（O.^6.-BG），导致这种蛋白质的不可逆的荧光形式。这种所谓的Snap-Tag™的嗜热变体[21]表示基于GFP的系统的替代方案，并有资格获得我们的选择。

将pBS-rRNA-104中的104基因替换为ogt吉恩，如材料和方法．构建体的结构称为PBS-rRNA_P.-ogt示意图见图图4（a）．

具体地，保留了八个起始密码子上游上游的强烈SD基序7核苷酸，并将其编码三胞胎放置在上游ogt开放阅读框。结果如图所示4（b）结果表明，该基因的表达产生了约18条主蛋白带 kDa，对应于ORF的预期大小SS.OGT-6HIS。作为一个积极的控制，我们就业ogtmRNA转录体外从T7启动子（泳道2），其如预期的，在效率较低比的mRNA在反应混合物中直接转录翻译。这可能是由于两种mRNA的不同5'-UTR，但也可以想到的是，当翻译发生在转录mRNA的稳定，同时与核糖体可能更容易结合到翻译起始位点。

为了深入了解影响效率等因素的影响SS.在OGT蛋白表达方面，我们用固定量的相同结构分析了反应的时间过程。该蛋白在60分钟后达到最高表达水平 分钟孵育，但时间较长（90和120 min）效率降低（图4（c）和4（d）)，如其他体外表达系统[22］.这种效果可能是由于系统连续使用的低分子量底物（ATP，GTP和氨基酸）的缺点，其随后的反应滴加。

此外，我们测试了结构的线性化是否能在基因与我们的利益的产品随之增加后产生的转录径流。这种情况并非如此，但是。与线性化的质粒孵育的样品没有产生相应于ORF OGT-的6His的预期大小的条带（图5（a）)．进一步分析表明，这是由于反应混合中线性化的质粒的降解(图)5（b）)类似于其他作者使用不同的无细胞耦合转录翻译系统获得的结果[23］.

4.2。表征SS.OGT活动

测试体外- 推出SS.OGT在功能上是活跃的，我们培养构建pBS rRNA_P.-ogt在荧光素衍生物的存在下，在70°C下裂解1小时O.^6.-BG (SNAP-Vista Green™，New England BioLabs)。正如上面提到的,SS.OGT催化Bg的苄基与其活性位点的特异性半胱氨酸残基之间的共价键的形成;因此，成功完成反应使蛋白质荧光[21］.实际上，我们观察了对应于预期大小的荧光带SS.在反应条件下采用的OGT(图6.），证明所表达的蛋白质的活性状态。的水平体外-表达SS.通过将其荧光与已知数量的重组蛋白获得的荧光进行比较，评估了OGT。实验结果也允许排除这种可能性体外- 推出SS.在其翻译后，荧光苄基的不可逆转移到活性位点后，OGT降解，如前所述[24那25］.实际上，重组蛋白在70℃下孵育60分钟SS.油气痕迹的S. solfataricus.在SNAP-Vista Green™存在下的裂解物不影响活性和获得的荧光信号(图6.，第3巷）。

这个分析让我们可以估计体外-translatedSS.OGT的数量级相当于大约10-20 ng的蛋白质产生μ.G质粒使用，在25μ.我的反应。

5.讨论

本研究报告了在高温（70℃）中合成蛋白质的转录/翻译系统的发展，基于来自嗜热克纳基的S30提取物S. solfataricus.．工程的系统利用古典pBS-SK质粒,在高效转录是由一个强大的启动子,对应的DNA区域上游16 s / 23 s rDNA基因,而翻译是刺激的存在一个强大的SD主题之前,开始选择基因的密码子。反应的最佳温度为70°C，孵育1 h后蛋白合成达到最大。

我们用两个不同的基因来测试这个系统，一个编码核糖体蛋白，另一个编码SS.OGT是一种酶，其活性是用荧光探针测定的，如上所述。前一种基因已经在体外从预转录的mRNA中有效地翻译出来[12]，并作为调整系统的起点。转录/翻译ogt-编码基因使我们能够证明蛋白质产物是有活性的，从而证明它在体外反应。此外，使用该酶的荧光底物的可能性是用于定量基因产物的明显优势，使得该系统柔性。

我们在文献中描述的先前尝试的系统的重要新颖之处在于它只需要在细胞裂解物中存在的内源性组分。实际上，唯一描述的蛋白质合成系统与高温翻译相结合利用a柯达热球菌裂解物，但它需要添加的热稳定T7 RNA聚合酶来工作[26］.因此，我们的测定法是一种经济方便的选择，因为提取物制剂是简单且廉价的。

虽然目前的工作描述了一种有前景的新技术，主要用于基因表达分析，但它还不能用于基因表达分析体外扩大重组蛋白的生产。要实现这一点，还需要进一步的实验和改进。例如，可以设想将反应分为两个室，一个室含有改性的萃取物，另一个室含有含有氨基酸、ATP和GTP等底物的饲喂液，并通过连续流动进行更新，允许底物补充和副产物去除。

此外，还应观察到，存在偶联CFPS对DNA的利用有三种形式:线性PCR产物、线性化质粒和圆形质粒。使用线性PCR产物具有明显的简单性优势，因为它消除了耗时的克隆步骤。然而，圆形DNA质粒通常比线性质粒或PCR产物更受青睐，因为线性DNA更容易发生核裂解。的确，在我们的案例中，与线性化的质粒孵育的样品由于反应混合中线性化的质粒降解而不能产生预期的蛋白产物。去除核酸酶和/或利用悬挑延伸环化PCR产物，可以在未来用于体系的优化。

总之，我们认为这里描述的系统具有很好的用途潜力，例如蛋白质显示技术，互乱分析和对古代偶联转录翻译的分子机制的理解。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作是PL的赠款支持史Pasteur-Fondazione森西Bolognetti项目“检测和描述专业核糖体翻译特定类的mrna古生菌”和“Sapienza大学的基金罗马DB的2016项目“eIF5A p53的平移控制执行”,协议号:RP116154B8B63CB0。

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