细胞溶解产物胜任 在体外根据前面描述的方法翻译准备与轻微的预防措施 17]。短暂,约2 g的冷冻细胞被地面手动双逐渐氧化铝粉和添加量对小于2卷(相对于细胞颗粒的重量)裂解缓冲(20毫米Tris-HCl (pH值7.4),10毫米毫克(OAc)₂,40毫米NH₄Cl, 1毫米德勤)。这个过程是由将砂浆在冰上和工作在一个寒冷的房间不超过15分钟。细胞碎片和氧化铝被旋转混合两次在30000 g×30分钟和照顾撤回只有三分之二的上层清液。整除的细胞溶解产物(0.05毫升)存储在−80°C,和总蛋白浓度,由布拉德福德化验,在相应的范围约为20 - 25毫克/毫升。未分离tRNA从 美国solfataricus准备通过执行酚提取原油S100分数和沉淀的水相2.5量的95%的乙醇。RNA颗粒在10毫米resuspended甘氨酸(pH值9.0),和解决方案是孵化2 h在37°C实现tRNA其中含有的碱性脱酰作用。最后,RNA再次沉淀和由此产生的颗粒溶解在一个适当的体积是10毫米Tris-HCl (pH值7.5)。

我们使用了质粒pBluescript-SK(+)对我们的后续结构作为起点。两个合成DNA寡聚物的48个核苷酸的序列上设计一个16 s / 23 s rRNA操纵子子(其它地方描述的那样 18)的序列是相同的守恒 美国solfataricus物种:发起人rRNA SSO向前5 ′ -CGAAGTTAGATTTATATGGGATTTCAGAACAATATGTATAATGGGTAC-3 ′ 和启动子rRNA SSO逆转5 ′ -CCATTATACATATTGTTCTGAAATCCCATATAAATCTAACTTCGGTAC-3 ′ 。两种引物所包含的5 ′ 结束一个序列对应于突出的有凝聚力的5 ′ 结束 Kpn我限制的网站,都是磷酸化在单独的25 μl反应混合物包含70毫米Tris-HCl (pH值7.6),MgCl 10毫米₂二硫苏糖醇、5毫米,1毫米ATP, 4 μM DNA,和10个单位的T4多核苷酸激酶(新英格兰生物学实验室)。孵化后37°C 1 h,反应混合物相结合,激酶在70°C heat-inactivated 10分钟。退火的两个寡聚物是通过加热混合物在100°C 4分钟,慢慢冷却到37°C。双链的完整性16 s / 23 s rRNA启动子片段DNA琼脂糖凝胶电泳检查了。净化的一个pmol双链片段与0.25 pmol孵化 Kpn我消化pBS-SK(+)质粒的10个单位的T4 DNA连接酶(新英格兰生物学实验室)25 μl(50毫米Tris-HCl (pH值7.5),MgCl 10毫米₂二硫苏糖醇,10毫米,1毫米ATP, 25岁 μ为20 h g / ml牛血清白蛋白16°C。这个反应混合物的十分之一被直接用于转换的 大肠杆菌十大能力的细胞。转化株窝藏质粒DNA插入使用的筛查 Kpn我限制分析纯化的质粒DNA。克隆窝藏构造正确的插入方向选择DNA测序和称为pBS-rRNA之后_p。先后,393个基点的片段,其中包含的基因称为ORF 104 Shine-Dalgarno (SD)的主题从构造pBS800[放大 12通过使用以下引物PCR):舞会- 104 Xho我5 ′ -TTTTTTTAT CTCGAGCCGGAATAGTTGAATTAACAATGAAGC-3 ′ (强调序列对应 Xho我网站)和舞会- 104 太平洋标准时间我5 ′ -CATGGTATG CTGCAGTCATTGCTTCACCTCTTTAATAAACTCC-3 ′ (强调序列对应 太平洋标准时间我的网站)。插入片段 Xho我 太平洋标准时间我消化质粒pBS-rRNA_p,产生的构造称为pBS-rRNA_p-104年。生成构造称为pBS-rRNA_p- - - - - - 油气痕迹我们切除片段 Xho我 太平洋标准时间我从以前的质粒和插入533个基点的DNA片段构建pQE——放大 油气痕迹通过PCR引物如下:向前rRNA / 党卫军油气痕迹 Xho我5 ′ -TTTTT CTCGAGTGAGGTGAAATGTAAATGAGAGGATCTCACCATCACC-3 ′ (强调序列对应 Xho我的网站)和反向rRNA / 党卫军油气痕迹 太平洋标准时间我5 ′ -TTTTTT CTGCAGTCATTCTGGTATTTTGACTCCC-3 ′ (强调序列对应 太平洋标准时间我的网站)。也在这种情况下,质粒设计有SD主题7核苷酸的上游 油气痕迹起始密码子。

的转录活动 美国solfataricus无细胞提取物进行了测试³²P-UTP公司在两个不同的反应条件使用一个整除的溶解产物对应于100年 μ总蛋白质的g。协议采用第一反应从一项研究 16):无细胞提取物是孵化反应体积的50 μl,在50 mM Tris-HCl (pH值8.0),MgCl 25毫米₂二硫苏糖醇,EDTA 1毫米,1毫米,2毫米ATP, 1毫米三磷酸鸟苷,CTP 1毫米,0.6毫米UTP, 100 μ米( α- - - - - -³²P) UTP Ci /更易与(4)反应体积的50 μl。60°C的反应进行了30分钟。第二个协议是基于 在体外翻译在我们实验室进行的实验 12, 17]: 美国solfataricus无细胞提取物中孵化反应体积的50 μl,在10毫米氯化钾,20毫米Tris-HCl (pH值6.8),20毫米毫克(OAc)₂2毫米ATP, CTP 1毫米,1毫米三磷酸鸟苷,0.5毫米UTP, 100 μ米( α- - - - - -³²P) UTP (4 Ci /更易)。反应中,在这种情况下,进行了30分钟的70°C。两种反应结束时,20 U DNase我添加和潜伏期延长30分钟在37°C。DNase我添加删除任何跟踪plasmidic DNA可能会改变未来存在分析的结果。反应的产物是由酚提取pH值4.7和2.5的95%乙醇沉淀。丸resuspended在足够的DEPC-treated量水和分为两个整除。核糖核酸酶A (20 μg)添加到其中的一个,两个整除孵化在37°C为30分钟。新合成RNA分离nondenaturing 8.5%的聚丙烯酰胺凝胶和使用即时成像仪检测设备(Packard)和放射自显影法电影(柯达XAR-5)。

transcription-translation活动测量在最后一卷25 μl和包含10毫米氯化钾,20毫米Tris-HCl (pH值6.8),20毫米毫克(OAc)₂1.5毫米,1.5毫米ATP, CTP, 1.5毫米三磷酸鸟苷,1.5毫米UTP, 3.3 μ克散装 美国solfataricustRNA, 5 μl(20 - 25毫克/毫升 美国solfataricusS30提取(preincubated 10分钟在70°C),和0.5 μl - l (³⁵蛋氨酸(S.A. 1175 Ci更易⁻¹11点mCi毫升⁻¹PerkinElmer)。混合所有的组件后,4 μg所需的信使rna或添加了不同数量的各种质粒的混合物被孵化表示时间在70°C。完整的细胞溶解产物被编程 在体外成绩单的翻译 美国solfataricus基因开放104和 党卫军油气痕迹的克隆pBS-SK(+)质粒的下游T7 RNA聚合酶启动子表中描述的条件下 1。转录前,质粒线性化了 太平洋标准时间我上面描述的实验条件是一样的,除了没有CTP UTP和ATP和三磷酸鸟苷的存在的最终浓度1.8和0.9毫米,分别。翻译产品的分析是由装载15 μl孵化的混合物在16% polyacrilamide / SDS凝胶;运行后,凝胶干燥和放射能照像。

结束的时候 在体外转录或耦合 在体外transcription-translation,总RNA被酚提取纯化的反应在pH值为4.7,通过添加2.5的95%乙醇沉淀。丸resuspended在足够的DEPC-treated量水和2 U DNase我对待,RNase-free(热费希尔科学)在一个合适的缓冲37°C 45分钟。剩余产品是由苯酚reextracted pH值4.7和2.5的95%乙醇沉淀。0.5 μ克总RNA retrotranscribed相对存在分析(SensiFAST™互补脱氧核糖核酸合成装备,Bioline)。qPCR执行与应用生物系统StepOne实时PCR系统(热费希尔科学)使用的互补和10的1/20 μl (GoTaq®qPCR大师混合(Promega)在最后一卷20 μl。循环参数为2分钟95°C,紧随其后的是40变性的周期在95°C 3秒,和退火/扩展60°C,持续30秒。每个信使rna的相对量计算了2^−ΔΔCt方法和规范化内生aIF6信使rna。引物序列用于qPCR如下:向前pBS 5 ′ -TGGTAACAGGATTAGCAGAG-3 ′ 和反向pBS 5 ′ -ACCAAATACTGTCCTTCTAGTG-3 ′ ;aIF6向前5 ′ -ATAAGCGGTAACGATAACGG-3 ′ 和aIF6扭转5 ′ -AATCCCTTAGATTCTCCTTCAG-3 ′ 。

通过执行RT-qPCR如上所述,我们测量的绝对数量从质粒pBS-rRNA RNA转录_p-104年在体外孵化transcription-translation系统。具体来说,我们将从这些样本获得的Ct值与标准曲线绘制与Ct值获得系列稀释1 μ克体外转录RNA (pBS-rRNA_p-104)。半定量rt - pcr,总RNA提取的混合反应如上所述。2 μ克总RNA retrotranscribed在最后一卷25 μ20 l与200 U M-MLV逆转录酶 μl 1 h 42°C的混合反应根据供应商的指令(Promega)。反应包含1 μ米以下的反向引物:5 ′ -GGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAG-3 ′ 。结束时的反应,最终混合物的体积反应是调整到50 μl和十分之一的RT与聚合反应是PCR扩增DNA聚合酶(Promega)在95°C为30秒,30秒60°C,和45秒74°C(25周期),最终在74°C扩展步骤7分钟。反向引物PCR扩增反应中使用的是相同的RT加上以下正向引物:5 ′ -CGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCC-3 ′ 。产品的反应被琼脂糖凝胶电泳分离和检测到溴化乙锭染色。

控制对应的反应进行RNA纯化样品没有质粒和RT - cDNA反应。

的活动 在体外表达了 党卫军分析了油气痕迹孵化8 μ克pBS-rRNA_p- - - - - - 油气痕迹重组质粒或200 ng 党卫军与200年油气痕迹油气痕迹 μ克 美国solfataricus完整的细胞提取物在上述实验条件下耦合体外转录/翻译和BG-FL衬底(2.5的存在 μ米)。70°C的混合反应是孵化了60分钟。反应停在变性,样本进行sds - page,紧随其后的是荧光成像分析使用VersaDoc 4000™系统(Bio-Rad实验室Inc .)通过应用激发/发射参数一个蓝色的带通滤波器。免疫印迹分析,蛋白质被转移到PVDF过滤器(Bio-Rad实验室Inc .)使用Trans-Blot®涡轮™印迹系统(Bio-Rad实验室Inc .)。的存在 党卫军油气痕迹蛋白质被曝使用多克隆抗体在兔子长大 美国solfataricus油气痕迹作为主要抗体,山羊anti-rabbit IgG-HRP(皮尔斯)作为二级抗体和Amersham生物科学ECL +工具包。过滤器被孵化,水洗,根据制造商的指示和发达。化学发光乐队公布使用VersaDoc装置(Bio-Rad实验室Inc .)。

准备一个S30提取物能够有效耦合transcription-translation,我们进行了初步实验,以验证是否整个细胞溶解产物 美国solfataricus准备根据我们描述协议( 17)是胜任 在体外转录。具体来说,我们比较的转录活动与先前描述的系统 硫化叶菌体外转录分析( 16),测试的能力S30提取合并 α- - - - - -³²P-UTP。盐和温度条件下的反应进行了总结在表 1和详细描述 材料和方法。在这两种情况下,我们实现了核苷三磷酸腺苷的反应在1毫米的最终浓度每2毫米(ATP除外)和S30分数制备省略DNase我治疗溶菌产物,与以前公布的协议,DNase我添加删除基因组DNA ( 17]。如图 1,S30招募标记三磷酸尿苷提取物显示能力支持这个想法,内源性RNA聚合酶活跃。然而,提取准备根据我们的协议有较高的效率三磷酸尿苷掺入。

先后,基于特征研究启动子的单份16 s / 23 s rRNA极端嗜热archaebacterium的基因簇 硫化叶菌( 18),我们克隆启动子pBS-SK(+)质粒,所述 材料和方法。上游地区的构造包含DNA的转录起始点16 s / 23 s rDNA基因从−−1 40个基点。的结构构造,称为pBS-rRNA_p示意图见图 2(一个)。S30提取质粒是孵化,其转录分析通过rt - pcr引物退火到特定区域的质粒克隆基因的下游,从而排除放大内生的目标。结果显示一个高效转录的孵化后的质粒在70°C(图 2 (b))。

从这个构造,我们克隆之前特征明显 硫化叶菌基因编码一种假定的核糖体蛋白( 12)的转录控制下16 s / 23 s rDNA启动子。这个质粒的结构,称为pBS-rRNA_p-104年,示意图见图 2 (c);qPCR的分析表明,它也是转录(图 2 (d))。最后,pBS-rRNA_p-104年建立体外转录和T7 RNA聚合酶,和已知的数量相应的净化RNA被用来绘制校准曲线,用来量化转录反应(图 2 (e))。这种分析允许我们评估的数量 在体外转录RNA RNA的数量级对应ng μ克的质粒,用于25 μ我的反应。

然后我们继续验证先前建立的实验条件是否允许耦合的转录和翻译。这个问题是解决孵化pBS-rRNA不同数量的_p-104质粒溶菌产物在70°C 1 h条件下总结表 1。之前说过,这个构造从强大的核糖体rna的转录启动子将产生一个信使rna编码核糖体蛋白(ORF 104)。预测的信使rna被赋予一个5 ′ utr包含SD主题7核苷酸从104年8月开始密码子子上游。如图 3 (c),反应产生的主要蛋白带大约12 kDa,对应的预期大小ORF 104。

将上述结果 美国solfataricus基因,我们subcloned O⁶-DNA-alkyl-guanine-DNA-alkyl-transferase基因( 党卫军从pQE——油气痕迹) 油气痕迹构造,以前以佩鲁基诺et al。 20.]。这个基因的产物是一种无处不在的蛋白约17 kDa,进化参与的直接修复DNA损伤造成的烷基化剂。 党卫军油气痕迹为其自杀的催化反应是一种特殊的蛋白质:蛋白质不可逆转的烷基转移DNA催化活性部位半胱氨酸。使用荧光衍生品的一个强有力的抑制剂, O⁶-benzyl-guanine ( O⁶bg),导致不可逆fluoresceinated形式的这种蛋白质。这所谓的高温变体SNAP-tag™( 21]代表另一种古典GFP-based系统和符合我们的选择。

构造是通过替换104基因构造pbs - rrna——104的 油气痕迹基因,如中描述 材料和方法。构造的结构称为pBS-rRNA_p- - - - - - 油气痕迹示意图见图 4(一)。

具体来说,强劲的SD主题7核苷酸上游从8月开始密码子被保留,和6他的编程三胞胎的上游 油气痕迹开放阅读框。结果在图 4 (b)显示,基因表达产生的主要蛋白带18 kDa,对应于预期的开放框架的大小 党卫军OGT-6His。作为一个积极的控制,我们使用一个 油气痕迹信使rna转录 在体外从T7启动子(巷2),正如所料,直接被翻译效率小于mRNA转录在反应中混合。这可能是由于不同的5′utr mRNA,但也可以想象,当翻译发生的同时mRNA转录是稳定和核糖体可能更容易地绑定到翻译网站开始。

了解其他因素影响的效率 党卫军油气痕迹蛋白表达,我们分析了反应的时间进程与一个固定的金额相同的结构。最高的蛋白质表达水平观察60分钟后孵化,而在长时间(90和120分钟)效率下降(数字 4 (c)和 4 (d)),如在其他 在体外表达系统( 22]。这种效应可能是由于缺乏低分子量的基质(ATP、三磷酸鸟苷、氨基酸),不断使用的系统,随之下降的反应。

此外,我们测试的线性化构造是否能产生一个末端的基因转录径流由此增加了我们的兴趣的产物。然而,这并非如此。样品孵化与线性化质粒未能产生一个带对应于预期的ORF OGT-6His(图的大小 5(一个))。进一步分析表明,这是由于降解反应的线性化质粒混合(图 5 (b))类似于其他作者结果与不同耦合transcription-translation游离系统( 23]。

测试是否 在体外冲击波 党卫军油气痕迹功能活跃,我们在构建pBS-rRNA孵化_p- - - - - - 油气痕迹与1 h的溶解产物在70°C的荧光素衍生物的存在 O⁶bg (SNAP-Vista绿色™,新英格兰生物学实验室)。正如上面提到的, 党卫军油气痕迹催化苄基之间的共价键的形成群BG和特定的半胱氨酸残基的活性部位;因此,成功完成反应呈现荧光的蛋白质( 21]。事实上,我们观察到的荧光带对应于预期的大小 党卫军反应条件(图采用油气痕迹 6),演示表达蛋白质的活动状态。的水平 在体外表达了 党卫军油气痕迹的评估是通过比较它与已知的重组蛋白质的荧光与获得。实验的结果也允许扣除的可能性 在体外冲击波 党卫军油气痕迹是退化后的翻译和不可逆fluoresceinated-benzyl集团转移到活动网站,正如前面演示( 24, 25]。实际上,孵化60分钟70°C的重组 党卫军油气痕迹的 美国solfataricus溶菌产物在SNAP-Vista绿色™的存在并不影响活动和获得的荧光信号(图 6,莱茵3)。

这一分析允许我们估计的数量 在体外翻译 党卫军油气痕迹一个数量级相应约10 - 20 ng的蛋白 μ克的质粒,用于25 μ我的反应。