催化中间晶体结构的半胱氨酸Desulfurase Archaeon Thermococcus onnurineus NA1 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

文摘

Thermococcus onnurineusNA1厌氧archaeon通常发现在深海热泉喷口附近区域,可以使用元素硫(S⁰)作为能源的终端电子受体。硫、必要的许多生物分子,如含硫氨基酸和辅因子包括iron-sulfur集群,通常是动员从半胱氨酸吡哆醛5′磷酸- (PLP)依赖酶的半胱氨酸desulfurase (CDS)。我们确定晶体结构的cdThermococcus onnurineusNA1 (ToCDS),包括本机内部醛亚胺(NAT), gem-diamine (GD)和丙氨酸,内部醛亚胺结构与现有的丙氨酸(IAA)和内部醛亚胺与persulfide-bound Cys356 (PSF)结构。催化中间结构显示,二面角的旋转相对于领导,吡啶环席夫碱的联系。ToCDS结构与细菌相比cd结构,这将有助于我们理解的作用和催化机理ToCDS archaeonThermococcus onnurineusNA1。

1。介绍

Thermococcus onnurineusNA1是sulfur-reducing hyperthermophilic生物生活在一个严格的厌氧条件深海热液喷口区域高温80至100°C (1]。在高硫极端环境中,Thermococcus onnurineusNA1可以使用元素硫(S⁰)作为能源的终端电子受体通过异化的硫代谢和生产H₂作为一个副产品。在缺乏硫,Thermococcus onnurineusNA1还可以使用有限公司、甲酸或可溶性淀粉和产生不同的生物副产品(H₂)[2]。硫也基本thiol-containing代数余子式等多种生物分子,iron-sulfur ([Fe-S])集群,molybdopterin, tRNA thionucleosides [3- - - - - -5),通过同化硫代谢合成。半胱氨酸desulfurase (cd;EC 2.8.1.7)是一个重要的同化硫代谢酶,它执行以下脱硫反应(3,6,7(计划1):

细菌的催化机理,信用违约互换(包含两个步骤8]。在第一步中,半胱氨酸的硫原子转移到cd的催化半胱氨酸残基的侧链,形成一个persulfide-bound中间(Cys-S-SH)。在第二步中,硫原子转移到不同的受体蛋白质像Fe-S集群脚手架蛋白和sulfurtransferases。

(Fe-S)集群,最早的催化剂在生物分子进化,作为多功能电子运营商在氧化还原反应中,监管传感器、蛋白质结构的稳定剂和化学催化剂(9,10]。固氮细菌,三multiprotein系统(NIF) iron-sulfur集群(ISC),和硫(进而)动员参与Fe-S集群组装,各种信用违约互换的基本从免费的半胱氨酸硫转移到不同的硫中间受体如图萨IscU,上海,SufU, CsdE [5,11- - - - - -13]。

Thermococcus onnurineusNA1附近存在生命的进化树的根,数量有限的1976个预测基因(1),几乎一半的基因大肠杆菌。Thermococcus onnurineusNA1 cd基因(ToCDS),没有硫中间受体基因已被确认。许多archaeons硫气热液喷口附近发现没有cd基因(14]。目前,对古细菌同化硫代谢生物分子合成。感兴趣的cd基因的差异对硫循环的演变在生活15]。

cd属于吡哆醛5′磷酸(PLP)依赖酶的家庭。PLP-dependent酶存在无所不在地:1.1%,1.3%,和0.5%的基因在archaeon,细菌和真核生物,分别是PLP-dependent酶(16]。的提供了核心的催化力量通过革新劳工党吡啶环作为一个电子水槽(17]。内部醛亚胺席夫碱之间的联系的和氨基活性部位的赖氨酸残基来回切换到外部醛亚胺席夫碱之间的联系和衬底氨基酸组中催化的中间。PLP-driven催化能力使PLP-dependent酶执行超过140种不同的氧化还原酶的酶活性,转移酶,水解酶,裂解酶和异构酶,包括五个六个一般类的所有酶(16]。

在transaldimination PLP-dependent酶的催化,反应是严格守恒和至少两次发生在正向和反向方向:内部醛亚胺的反应是外部醛亚胺和逆反应亦然(计划1)。最近,PLP的构象变化,尤其是之间的二面角的吡啶环和席夫碱的联系,提出了transaldimination反应中起着关键作用细菌L-serine水合酶(XometC) [18]。在这项研究中,我们克隆了ToCDS基因Thermococcus onnurineusNA1并确定ToCDS的晶体结构和复杂的催化中间配体从四个不同的晶体,然后与之相比大肠杆菌CDS的结构。

2。材料和方法

2.1。克隆

开放阅读框编码ToCDS蛋白质序列Thermococcus onnurineusNA1放大了PCR使用基因组DNA分离Thermococcus onnurineusNA1作为模板根据先前所描述的方法(19]。序列的寡核苷酸引物设计基于基因组序列的数据Thermococcus onnurineus从NCBI NA1网站。转发(5′ccc CCG CTA GCTGA TTC CGG gg ATG TTA-3′)和反向(5′ccc CCG CGG 20 CTT亚美大陆煤层气有限公司TCT柠檬酸广汽CTT TTA-3′)引物设计介绍新人道我和不我限制网站(粗体),分别。使用PCR扩增DNA片段被纯化菌进行净化设备(Bioneer,韩国),插入相同的限制性内切酶消化pET29b-His-Tev (pET29bHT)向量修改从原始pET-29b向量(Novagen、德国)有七个组氨酸残基的TEV裂解位点基因产物分子的n端,以促进蛋白质纯化。的表达载体pET29bHT -ToCDS变成了大肠杆菌BL21 (DE3)和镀上仅有Bertani(磅)20.包含50)琼脂μ克毫升⁻¹卡那霉素。kanamycin-resistant殖民地被选中,质粒DNA转化株被隔离使用质粒纯化工具包(Favorgen、台湾)。DNA测序证实的克隆进行了Macrogen设施(首尔,韩国)。

2.2。超表达和纯化

大肠杆菌包含pET29bHT——BL21 (DE3)细胞ToCDS种植在310 K光密度在600 nm (OD吗_600年0.6磅中补充了50μ克毫升⁻¹卡那霉素。ToCDS是诱导的蛋白表达的异丙基β-D-1-thiogalactopyrasnoside (IPTG)最后一个0.5毫米的浓度。细胞培养在同一温度310 K。经过一夜之间增长,细胞被离心法收获6000×g(视觉VS24-SMTi V5006A转子,韩国)20分钟在277 K。合成细胞颗粒resuspended在冰冷的裂解缓冲(25毫米Tris-HCl pH值7.5,300毫米氯化钠,15毫米咪唑、20% (v/v)甘油,3毫米β巯基乙醇)和中断使用超声发生器(Sonomasher、韩国)。原油细胞提取离心机为30分钟21000×g(视觉VS24-SMTi V508A转子,韩国)在277 K去除细胞碎片。包含可溶性ToCDS的上层清液应用到Ni-NTA树脂与裂解产物(Novagen、德国)之前缓冲区,执行和亲和力净化根据制造商的协议。所有蛋白质纯化步骤进行了在277 K。列被缓冲B组成的25毫米Tris-HCl pH值7.5,1 M氯化钠,15毫米咪唑,20% (v/v)甘油。包含250毫米咪唑洗脱缓冲被用来洗提7×His-tagged ToCDS。的筛选了ToCDS透析8 h在277 K对透析缓冲区(25毫米Tris-HCl pH值7.5,15毫米氯化钠,3毫米β巯基乙醇和20% (v / v)甘油)。进一步净化HiTrap Q进行阴离子交换柱(美国通用电气医疗集团)平衡在缓冲区(25毫米Tris-HCl pH值7.5,15毫米氯化钠,3毫米β巯基乙醇和20% (v/v)甘油)。ToCDS是清洗和筛选了一个梯度的0到100%缓冲b的净化协议的重组形式ToCDS持续了超过50毫克每升ToCDS培养基,在sds - page和蛋白质表现出一个乐队大约44 kDa。蛋白质结晶的解决方案集中使用离心过滤器(Amicon®Ultra-15, MWCO 10 kDa,德国)的最终浓度13毫克毫升⁻¹在一个缓冲区组成的25毫米Tris-HCl pH值7.5和15毫米氯化钠。

2.3。结晶和x射线数据收集

初始结晶筛选进行了在287 K sitting-drop扩散方法96 - Intelli-plates(美国艺术Robbins)使用九头蛇II电压降自动移液系统(美国矩阵)和筛选工具从汉普顿研究(水晶屏幕低温,水晶屏幕Lite,水晶屏幕HT,指数HT和SaltRx HT), MD1-46(美国睡眠™),向导和沉淀剂协同作用(美国翡翠生物)。两种ToCDS(13毫克毫升⁻¹ToCDS单独和12毫克毫升⁻¹ToCDS包含5毫米l半胱氨酸和1毫米PLP)结晶。蛋白质溶液(0.5μ0.5 l)混合μl对50的储层解决方案和平衡μ在287 K l储层的解决方案。

在两天内,仅ToCDS蛋白质晶体(水晶I)观察条件A11(水晶我条件)的MD1-46包含0.03 MgCl(美国睡眠)₂0.03米,CaCl₂,15% (v/v甘油,15% (w/v4000年)挂钩,0.1三羟甲基氨基甲烷(基地)/ n -二甘氨酸液pH值8.5。成年晶体在液态氮在100 K flash-cooled cryoprotection解决水晶我条件与额外的5%甘油。试验获得反应中间体的结构、晶体我转移到解决晶体条件补充5毫米l半胱氨酸和1毫米PLP不同的持续时间。gem-diamine的催化中间结构(GD)决定从水晶浸泡1 h(水晶II)。相同的水晶cryoprotection解我曾经flash-cool晶体二世在液态氮100 K。

同样,在两天内,ToCDS的晶体(水晶III)观察条件C2(水晶三世条件)的MD1-46(美国睡眠)包含0.03纳米₃,0.03 Na₂HPO₄,0.03米(NH₄)₂所以₄,15% (v/v)乙二醇,15% (w/v8000)挂钩,0.1米咪唑/ MES pH值6.5 ToCDS蛋白质样本包含5毫米lPLP半胱氨酸和1毫米。成年晶体在液态氮在100 K flash-cooled cryoprotection解决水晶三世条件与额外的5%甘油。

ToCDS晶体的晶体(IV)中观察到的额外结晶溶液(水晶第四条件)含有10% (v/v)异丙醇,5% (w/v8000年)挂钩,从ToCDS imidazol /盐酸pH值5.9蛋白质样本包含5毫米lPLP半胱氨酸和1毫米。成年晶体在液态氮在100 K flash-cooled cryoprotection解决水晶IV条件与额外的20%甘油。x射线数据收集在beamline 7和5 c浦项市光源(PLS),韩国。衍射数据集成和扩展使用Denzo和Scalepack,分别为(21]。

2.4。结构测定

自动标引程序(21)表明,独自ToCDS(我)晶体的晶体,代表一个本地(NAT)结构,属于空间群P2₁2₁2₁晶胞参数,,一个。P2的三个螺旋的轴₁2₁2₁被证实与系统化的缺席。衍射数据收集到2.6一项决议。ToCDS独自解决了利用分子结构的替代方法。的MOLREP(22)从CCP4程序包(23),使用cd结构集胞藻属sp。PCC6803 (PDB条目1 t3i [24];42.8%序列身份)作为搜索模型,非常成功,显示一个二聚体的不对称单元。最初的R因素从分子替换搜索是54.5%。分子结构建模和改进后的傻瓜(25),REFMAC5(26),R因素和自由下降到19.3%R因素是25.9%。确定原生ToCDS结构被用作模板来解决配体的复杂结构。基于结构的多序列比对中执行T-Coffee(27),然后使用ESPript服务器(28]。分子图形创建使用PyMOL [29日]。

3所示。结果

3.1。ToCDS的主要结构

所有已知的cds显示氨基酸序列相似性和三维结构。然而,当地结构差异特征反应被用来分配信用违约掉期分为两类(3,30.]:我包括IscS-like序列和二级类包括进而CsdA-like序列(图1)。类我信用违约掉期包含一个序列插入10多残留守恒的催化后半胱氨酸,和二类cds含有较短的守恒的催化赖氨酸后插入。的主要序列ToCDS符合二类;此外,与EcSufS ToCDS序列的39%,与EcCsdA 33%, 28%在399年与EcIscS残留。

图1

与EcCDSs ToCDS结构序列比对。ToCDS cd从Thermococcus onnurineusNA1;EcISCS、EcSUFS EcCSDA isc,进而,CsdA大肠杆菌。守恒的催化半胱氨酸、赖氨酸残留物用星号标记。类我序列插入橘子所示矩形和二类序列中插入一个粉红色的矩形。的螺旋α3和α10 EcCDSs ToCDS和相应的螺旋线的蓝色矩形所示。

3.2。本机ToCDS总体结构

本机ToCDS的晶体结构(NAT)决心(表2.61)。有一个二聚体有两个对称不对称单元(图2(一个))。原体ToCDS由三个领域(图2 (b))。n项域包含残留1 - 16,包括两个平行的α螺旋线。大中央域有PLP结合位点含有残留17 - 285,由九个α螺旋围绕九β困,主要是平行的β表。c项域(残留286 - 399)包含4个α螺旋线,连同两股反平行的β链。


数据收集	NAT / NAT(水晶)	GD / GD(水晶II)	第三IAA / GD(水晶)	PSF / PSF(水晶(四)
PDB加入代码	5 b7	5 b87	5 b89	5 b7u
x射线源	PAL7A	PAL5C	PAL5C	PAL5C
空间群	P2₁2₁2₁	P2₁2₁2₁	P2₁2₁2₁	P2₁2₁2₁
晶胞参数a, b, c (a)	67.0,92.5,145.4	67.1,93.6,145.0	62.9,78.7,171.9	62.8,78.5,171.3
分辨率范围(一)	50.0 - -2.6	50.0 - -2.3	50.0 - -1.5	50.0 - -1.9
数量的观察思考(独特的)	198476 (28968)	261138 (40955)	1605206 (128579)	635661 (66011)
完整性(%)	99.9 (100)	96.0 (100)	94.1 (91.9)	97.0 (91.9)
R_合并(%)	11.9 (41.6)	9.5 (38.0)	8.9 (56.6)	6.2 (30.6)
平均我/σ(我)	29.1 (7.1)	44.6 (5.3)	62.9 (6.5)	52.9 (12.2)
细化
分辨率(一个)	36.4 (2.6)	49.4 (2.3)	49。6 (1.5)	38.3 (1.9)
反射(F_{奥林匹克广播服务公司}> 0σ(F_{奥林匹克广播服务公司}))
工作集	27449年	38845年	122068年	62613年
免费的R集	1465年	2040年	6444年	3326年
R/R_免费的(%)^c	19.3 (25.9)	17.7 (21.3)	16.7 (19.4)	16.5 (20.2)
蛋白质的原子数	6270年	6215年	6256年	6286年
配位原子数
丙氨酸	0	12	12	0
PLP	0	30.	30.	0
半胱氨酸	0	0	0	7
异丙醇	0	0	0	4
甘油	0	0	6	0
1,2-Ethanediol	0	0	4	0
水分子	0	137年	545年	259年
表示键的长度(A)	0.013	0.029	0.027	0.020
表示键角(^o)	1.676	2.776	2.418	1.889
意味着B因子(A²)
主链原子	50.9	39.9	17.1	21.0
侧链原子	56.2	46.4	22.3	26.6
配位体
丙氨酸	厦门市。	51.8	32.1	厦门市。
PLP	厦门市。	32.5	22.9	厦门市。
半胱氨酸	厦门市。	厦门市。	厦门市。	46.6
异丙醇	厦门市。	厦门市。	厦门市。	36.7
水的原子	厦门市。	42.7	34.0	30.6
甘油	厦门市。	厦门市。	23.9	厦门市。
1,2-Ethanediol	厦门市。	厦门市。	31.6	厦门市。
拉马钱德兰情节(%)
支持地区	96.0	96.5	97.7	97.1
允许地区	2。9	2。8	1.8	2。4
离群值区域	1.1	0.7	0.5	0.5

括号中的值是最高的分辨率壳。NAT代表了原生结构,GD gem-diamine结构、IAA的内部醛亚胺结构产品丙氨酸,和PSF persulfide-bound结构。,在那里的平均强度吗我观察symmetry-related反射hkl。我/σ(我)代表一个反射的信号噪声。在哪里从原子模型计算蛋白质结构因素(计算与随机选择5%的反射)。剩下的95%计算的反射在同一个方程。RMSD代表均方根偏差。厦门市。:不是可用的。

(一)

(b)

(c)

图2

本机结构ToCDS (NAT)在晶体。(a) ToCDS二聚体的整体内部醛亚胺结构。(b) ToCDS的原体结构。(c)活性部位ToCDS结构。衬底cysteine-binding网站显示为一个橙色的阴影。省略的地图PLP和Lys216的内部醛亚胺。省略地图显示2 fo-fc电子密度图(波状外形的1.0σ;蓝色)和Fo-Fc电子密度图(波状外形的3.0σ;绿色)。

ToCDS组成了一个预留功能二聚体,3882²16979埋在二聚体界面²每个原体的溶剂可及表面。两个活动地点是位于中心PLP-binding域的二聚体界面。的席夫碱与Lys216在活性部位。领导,吡啶环是遍布His114和绑定到Ala192与范德瓦耳斯相互作用对边(图2 (c))。5′的磷酸的紧密地绑定通过氢键与附近的残留Ser87, His215 Ser213, Thr268。

3.3。结构比较ToCDS和EcCDSs之间

大肠杆菌有三个cd蛋白:EcIscS(一级),EcCsdA(二类),和EcSufS(二类),晶体结构的测定,在复杂[Fe-S]支架或硫受体蛋白质像IscU图萨和CsdE8,31日]。ToCDS结构叠加并与EcCDS结构在复杂硫受体蛋白(数据3和4)。整体的核心折叠ToCDS和三个EcCDSs保守但显示区域的差异。EcCDS复杂结构的受体蛋白质注定接近衬底的口通道通过与螺旋的交互α3或α10(二级结构遵循ToCDS编号)(数据1和4(一))。在EcIscS结构,没有β词结构ToCDS (Ile247-Thr258 ToCDS二类序列插入)形成的上嘴衬底通道。相反,一个循环(EcIscS Ala327-Leu333)存在于衬底通道的另一侧,和c端域相对转移(图3(一个))。通过与螺旋的交互IscU注定α10(图4 (b))。通过与螺旋的交互图萨注定α3(图4 (c))。在EcCsdA结构,长α3螺旋向外弯曲,生成的一个大洞,活性部位(图3 (b))。CsdE是弯曲的螺旋之间的绑定α3、螺旋α10 c端域主要通过与螺旋的交互α10(图4 (d))。与ToCDS EcSufS显示最相似的结构,包括拟议中的acceptor-binding站点和一个额外的β在n端结构域(图词循环3 (c))。没有EcSufS的受体蛋白结合的复杂结构尚未确定。

(一)

(b)

(c)

图3

结构比较ToCDS和EcCDS结构。(一)叠加结构ToCDS(绿色)和EcCDS isc(橙色)。的β词ToCDS结构由绿色箭头标记。一个错误的翻译导致的c端域isc橙色箭头所示。(b)的叠加结构ToCDS(绿色)和EcCDS CsdA(紫色)。弯曲的螺旋α3 CsdA由紫色箭头标记。(c)叠加结构ToCDS(绿色)和EcCDS进而(红色)。

(一)

(b)

(c)

(d)

图4

提出了受体此种ToCDS。(一)表面ToCDS的代表。衬底通道由一个粉色箭头标签,显示中粉红色。螺旋α3和α10个标签。(b) isc / IscU复杂结构叠加在ToCDS结构和只有IscU表示为一个卡通。图萨(c) isc /复杂结构叠加在ToCDS结构和只表示为一个卡通图萨。(d) CsdA / CsdE复杂结构叠加在ToCDS结构和只有CsdE表示为一个卡通。

3.4。催化中间ToCDS结构

我们研究如果ToCDS是守恒的催化机理与细菌的信用违约掉期。确定ToCDS与基底材料的催化中间结构,产品,或反应中间配体,我们浸泡和共晶衬底l半胱氨酸与本机ToCDS晶体并确定三种不同复杂结构的ToCDS(参见图S1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/5395293)。复杂的ToCDS结构包括gem-diamine结构与persulfide-bound Cys356(图印地),内部醛亚胺结构与现有的丙氨酸(IAA)与persulfide-bound Cys356(图就是S1c),和内部醛亚胺结构persulfide-bound Cys356 (PSF)(图S1a和图5 (c))如下催化反应的顺序(计划1)。

(一)

(b)

(c)

3.5。Gem-Diamine (GD)结构

在晶体II和III,三个原体的GD结构测定,显示清晰的电子密度的PLP-bound丙氨酸,PLP,席夫碱连杆债券(图印地)。过硫化物组从衬底半胱氨酸和转移到Cys356删除。当我们ToCDS GD结构叠加到ToCDS NAT结构,革新劳工党吡啶环的构象和His114结构守恒(图5(一个))。XometC[催化中间结构的18],L-serine PLP-dependent酶的酶,吡啶环和Tyr112 (ToCDS His114)显示,倾斜构象变化(图5 (b))。然而,没有领导,吡啶环的倾斜和His114 ToCDS观察。

之间的二面角,吡啶环和席夫碱连杆与Lys216(内部二面角)ToCDS GD结构得到了更广泛的比ToCDS NAT结构近20°(图6和表2)。之间的二面角的吡啶环和席夫碱连杆与丙氨酸(外部二面角)被发现比内窄二面角(图S2a和表2)。两个氨基酸组Lys216和产品丙氨酸的相似距离2.9近似等边三角形的羟基形式。的羟基的提出为催化基础deprotonate传入衬底XometC氨基集团(18]。在大肠杆菌NAT (PDB ID: 1 jf9)和GD(与硒代半胱氨酸在复杂;PDB ID: 1 kmk) CsdB结构(EcNifS_CsdB),这是一个NifS-like CDS [32),测定(33]。类似于ToCDS中间结构,内部的二面角EcNifS_CsdB GD结构是更广泛的比EcNifS_CsdB NAT结构由35°。衬底硒代半胱氨酸的氨基酸组EcNifS_CsdB GD结构还存在接近领导,吡啶环上的羟基。

(一)

(b)


原体	(内部)	(外部)	B(内部)	B(外部)

水晶我(NAT / NAT)	47.7	厦门市。	45.0	厦门市。
晶体二世(GD / GD)	69.1	−50.2	64.8	−53.6
水晶III (IAA / GD)	53.3	−51.4	64.9	−50.0
水晶IV (PSF / PSF)	38.3	厦门市。	50.3	厦门市。

一个€‰	平均	标准的开发。	平均	标准的开发。

NAT和PSF	45.3	5.2	厦门市。	厦门市。
GD	66.2	2。5	−51.2	2。0
国际宇航科学院	53.3	厦门市。	−51.4	厦门市。

积极的反角值为内部醛亚胺在NAT, PSF和GD结构和消极的反角值GD外部醛亚胺的结构,提出了外部IAA的醛亚胺结构。厦门市。:不是可用的。

3.6。内部醛亚胺结构与现有的丙氨酸(IAA)

在水晶三世,内部醛亚胺结构与现有的丙氨酸(IAA)决定在原体,显示清晰的电子密度附近的丙氨酸PLP但不与PLP(图就是S1c)。过硫化物组转移必将Cys356,显示相同的构象GD的结构。内部之间的二面角,吡啶环和席夫碱连杆之间的债券是在中间的NAT和GD结构。革新劳工党之间拟议的虚构的外部二面角,吡啶环上的氨基丙氨酸在IAA结构,几乎是一样的外部二面角的GD结构。然而,产品的氨基丙氨酸IAA结构由0.7远离PLP,相比GD的结构。两个氨基酸组,Lys216和产品丙氨酸和羟基PLP做出了一个几乎完美的三角形(图开通)。

3.7。Persulfide-Bound Cys356 (PSF)结构

在水晶IV,内部醛亚胺结构persulfide-bound Cys356决心在1.9(图S1a和图5 (c))。在原体,persulfide-bound Cys356显示和定位在同一位置GD和IAA结构。在原体B, Cys356没有显示是因为灵活的构象。PSF结构是结构从半胱氨酸硫转移后从ToCDS ToCDS和丙氨酸释放产品。上过硫化物Cys356注定与His115 Gly245通过氢键和His355 Ile247通过范德华相互作用(图5 (c))。绑定过硫化物面临衬底的口通道,这是公认的受体蛋白质链接的网站。过硫化物的立场提出了旋转Cys356侧链的构象变化后拿起从衬底半胱氨酸硫原子的活性部位。的persulfide-bound EcNifS_CsdB结构(PDB ID: 1 kmj) (33)也显示相同的旋转persulfide-bound侧链活性部位的半胱氨酸残基ToCDS GD、IAA和PSF结构,这意味着,终端过硫化物和附近的活性位点残基之间的相互作用对构象的变化很重要。的构象的和席夫碱连杆ToCDS PSF ToCDS NAT的结构很保守的结构(图5(一个))。

3.8。结构比较催化中间ToCDS结构

我们比较了催化中间结构和二面角角度,吡啶环和内部和外部之间的氨基酸组Lys216和丙氨酸ToCDS(图6和表2)。中间结构的整体构象是守恒的。然而,内部二面角显示灵活的构象变化从38°- 69°:内部二面角有广泛的NAT的顺序,IAA和GD结构。外部二面角和提出外部二面角GD和IAA结构保持几乎类似−51°。

4所示。讨论

我们确定晶体的快照催化中间ToCDS结构(计划1)。Transaldimine反应是所有PLP-dependent酶的守恒的关键一步。最近,双面角变化,吡啶环和席夫碱之间的联系,提出了发挥重要作用在transaldimination XometC基于催化反应中间产物晶体结构和高级计算计算(18)(图S3)。二面角的构象变化有两个主要的角色。首先,它引起了衬底上氨基的亲核攻击的席夫碱PLP联系起来。第二,革新劳工党吡啶环上的羟基催化碱和酸作用传入衬底的去质子化氨基和两个氨基酸之间的协调一致的质子转移组在GD结构。

ToCDS显示类似的二面角的催化中间结构变化与XometC催化步骤。PLP-dependent催化机制是守恒的。的内部二面角ToCDS从45°NAT结构改为66°平均GD结构。在我们的理解中,位阻从传入衬底的氨基半胱氨酸推开氨基酸席夫碱联系群Lys216没有倾斜,吡啶环由于紧密的绑定。GD和IAA结构,氨基配体的定位只是旁边,吡啶环上的羟基,这是一个合适的构象deprotonate传入的衬底氨基和执行两个氨基酸组之间的质子转移衬底和活跃的站点赖氨酸在XometC提出(18]。

PLP-dependent酶酶用途广泛,几乎占所有机密酶活动的4%。PLP-dependent各种类的酶,不同的氨基酸靠近的被提议作为催化基地deprotonate氨基的基质。XometC, ToCDS EcNifS_CsdB结构,革新劳工党吡啶环上的羟基是更紧密地将比任何其他公认的催化底物氨基基氨基酸。PLP-dependent酶,transaldimination反应耦合反应应该发生至少两倍的向前和向后的,两边向前和向后transaldimination反应是对称的两个氨基酸组赖氨酸侧链和衬底犯同样的席夫碱连杆的在两面。如果我们考虑氨基酸残基的活性部位大多数酶催化基础,需要两个单独的催化基础残留PLP两边。然而,革新劳工党吡啶环上的羟基可以执行催化基础角色双方两个氨基酸组的中心,这可能是PLP-dependent酶的更简单和更高效的模型。

GD结构允许我们衡量二面角的两个相反的方向,向内部醛亚胺(正值)和外部醛亚胺(负值)(表2)。IAA结构,提出了二面角与丙氨酸也是衡量。在GD和IAA结构,外部的负面价值二面角角度几乎是守恒的−51°左右。活性部位的ToCDS IAA结构、丙氨酸是紧密地绑定:守恒Arg371侧链与丙氨酸的羧酸盐和分叉氢键Asn165也有氢键与丙氨酸羧酸盐(图S4)。传入的衬底半胱氨酸的绑定位置将类似的产品在国际上丙氨酸结构。结合紧密的固定位置的氨基可以保持外部的二面角醛亚胺的GD和IAA结构。IAA结构,三个氮原子在两个羟基的氨基酸组和氧气,吡啶环显示一个几乎完美的三角形状。在GD结构中,丙氨酸氨基之间的距离和alanine-attached的碳原子减少作为衬底接触,保持相同的外部二面角(图6)。

晶体结构的平均结构很容易超过千数十亿蛋白质晶格排列。当提供衬底,ToCDS酶的晶体结构可以作为一个多催化国家存在,例如混合催化两个或两个以上的状态。我们收集了成千的不同ToCDS晶体多年来通过改变各种变量如衬底孵化期间,基质和配体的浓度和底物浸泡和共结晶的方法。我们推测,催化ToCDS中间结构的确定是可能通过捕获时刻的酶催化国家对其他国家举行的主要人口的晶体。

最近的研究热点硫代谢透露很多小说酶和通路(14]。然而,热点信息同化硫代谢等生物分子合成(Fe-S)集群组装是有限的。我们不理解ToCDS的生理作用Thermococcus onnurineusNA1。在一级和三级结构,ToCDS相似性最高,EcSufS EcCDSs相比三国。EcSufS属于进而系统参与集群(Fe-S)合成在不利条件下的氧化和重金属压力和铁饥饿(34]。的环境条件Thermococcus onnurineusNA1的栖息地也极端物化对温度范围2到100°C,氧化状态,流体速度(1]。在进化过程中,ToCDS可能的祖先EcSufS-like cds在压力条件下工作。我们需要进一步的研究来找出ToCDS的生理作用。

5。结论

我们克隆了ToCDS基因的Thermococcus onnurineusNA1并确定ToCDS的晶体结构(NAT)和在复杂催化中间配体(GD、IAA和PSF)。ToCDS属于二类cd基于主和三级结构和EcSufS显示最高的相似度。ToCDS PLP-dependent酶,催化中间体的晶体快照ToCDS显示席夫碱的守恒的二面角旋转连杆相对于领导,吡啶环所示EcNifS_CsdB XometC,这意味着ToCDS PLP-dependent催化机理是守恒的。本研究打算帮助理解ToCDS的催化机理和古细菌sulfur-trafficking系统合成含硫的生物分子。

附加分

PDB的引用。原子坐标和结构性因素对晶体结构报道已经存入蛋白质数据银行加入代码下5 b7(水晶我、NAT / NAT), 5 b87(水晶II, GD / GD), 5 b89(水晶三世,IAA / GD)和5 b7u(水晶IV, PSF / PSF)。

的利益冲突

没有利益冲突的手稿。

作者的贡献

Thien-Hoang Ho和Kim-Hung Huynh贡献了同样的工作。

确认

作者感谢Beamline 5 c的员工的浦项市加速器实验室(PAL),韩国。他们感谢朝鲜海洋研究和发展研究所(KORDI)的基因组DNAThermococcus onnurineusNA1。这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府资助(MSIP)(没有。2015 r1a2a2a01004375)和由世界顶尖大学(WTU)韩国建国大学的联合研究拨款。

补充材料

图S1。省略的活跃的站点地图ToCDS PSF, GD, IAA结构。图S2。活跃的站点ToCDS GD和IAA结构。图S3。提出从XometC transaldimination机制结构。图S4。紧丙氨酸ToCDS substrate-binding网站的识别。

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