古生菌 古生菌 1472 - 3654 1472 - 3646 Hindawi 10.1155 / 2017/5395293 5395293 研究文章 催化中间晶体结构的半胱氨酸Desulfurase Archaeon Thermococcus onnurineusNA1 何 Thien-Hoang 1 黄齐的 Kim-Hung 1 阮 吴廷琰琼 1 公园 Hyunjae 1 荣格 Kyoungho 1 苏尔 Bookyo 1 安 Yeh-Jin 2 查 Sun-Shin 3 http://orcid.org/0000 - 0002 - 1411 - 3132 康 Lin-Woo 1 Jebbar 默罕默德 1 生物科学学院 建国大学 Hwayang-dong Gwangjin-gu 05029年首尔 韩国 konkuk.ac.kr 2 生命科学部门 祥明大学 7 Hongji-dong Jongno-gu 03016年首尔 韩国 smu.ac.kr 3 化学和纳米科学的部门 梨花女子大学 52 Ewhayeodae-gil Seodaemun-gu 03760年首尔 韩国 ewha.ac.kr 2017年 24 4 2017年 2017年 12 10 2016年 19 02 2017年 24 4 2017年 2017年 版权©2017 Thien-Hoang Ho et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Thermococcus onnurineusNA1厌氧archaeon通常发现在深海热泉喷口附近区域,可以使用元素硫(S0)作为能源的终端电子受体。硫、必要的许多生物分子,如含硫氨基酸和辅因子包括iron-sulfur集群,通常是动员从半胱氨酸吡哆醛5′磷酸- (PLP)依赖酶的半胱氨酸desulfurase (CDS)。我们确定晶体结构的cd Thermococcus onnurineusNA1 (ToCDS),包括本机内部醛亚胺(NAT), gem-diamine (GD)和丙氨酸,内部醛亚胺结构与现有的丙氨酸(IAA)和内部醛亚胺与persulfide-bound Cys356 (PSF)结构。催化中间结构显示,二面角的旋转相对于领导,吡啶环席夫碱的联系。ToCDS结构与细菌相比cd结构,这将有助于我们理解的作用和催化机理ToCDS archaeon Thermococcus onnurineusNA1。

 建国大学 韩国政府(MSIP) 2015年r1a2a2a01004375 韩国国家研究基金会 1。介绍

Thermococcus onnurineusNA1是sulfur-reducing hyperthermophilic生物生活在一个严格的厌氧条件深海热液喷口区域高温80至100°C ( 1]。在高硫极端环境中, Thermococcus onnurineusNA1可以使用元素硫(S0)作为能源的终端电子受体通过异化的硫代谢和生产H2作为一个副产品。在缺乏硫, Thermococcus onnurineusNA1还可以使用有限公司、甲酸或可溶性淀粉和产生不同的生物副产品(H2)[ 2]。硫也基本thiol-containing代数余子式等多种生物分子,iron-sulfur ([Fe-S])集群,molybdopterin, tRNA thionucleosides [ 3- - - - - - 5),通过同化硫代谢合成。半胱氨酸desulfurase (cd;EC 2.8.1.7)是一个重要的同化硫代谢酶,它执行以下脱硫反应( 3, 6, 7(计划 1): (1) l 量 C y 年代 t e 我 n e + e n z y 米 e 量 c y 年代 t e 我 n e ↔ l 量 一个 l 一个 n 我 n e + e n z y 米 e 量 年代 量 年代 u l f 一个 n y l c y 年代 t e 我 n e

CDS的简化催化机理与守恒的半胱氨酸和赖氨酸残留物和辅因子中活跃的站点。催化残基,相应的剩余数量的ToCDS标签。衬底通道作为一个蓝色阴影表示。四催化中间ToCDS结构(NAT, GD, IAA和PSF)决定在这个研究上标签(黑色粗体的字母。

细菌的催化机理,信用违约互换(包含两个步骤 8]。在第一步中,半胱氨酸的硫原子转移到cd的催化半胱氨酸残基的侧链,形成一个persulfide-bound中间(Cys-S-SH)。在第二步中,硫原子转移到不同的受体蛋白质像Fe-S集群脚手架蛋白和sulfurtransferases。

(Fe-S)集群,最早的催化剂在生物分子进化,作为多功能电子运营商在氧化还原反应中,监管传感器、蛋白质结构的稳定剂和化学催化剂( 9, 10]。固氮细菌,三multiprotein系统(NIF) iron-sulfur集群(ISC),和硫(进而)动员参与Fe-S集群组装,各种信用违约互换的基本从免费的半胱氨酸硫转移到不同的硫中间受体如图萨IscU,上海,SufU, CsdE [ 5, 11- - - - - - 13]。

Thermococcus onnurineusNA1附近存在生命的进化树的根,数量有限的1976个预测基因( 1),几乎一半的基因 大肠杆菌。 Thermococcus onnurineusNA1 cd基因( ToCDS),没有硫中间受体基因已被确认。许多archaeons硫气热液喷口附近发现没有cd基因( 14]。目前,对古细菌同化硫代谢生物分子合成。感兴趣的cd基因的差异对硫循环的演变在生活 15]。

cd属于吡哆醛5′磷酸(PLP)依赖酶的家庭。PLP-dependent酶存在无所不在地:1.1%,1.3%,和0.5%的基因在archaeon,细菌和真核生物,分别是PLP-dependent酶( 16]。的提供了核心的催化力量通过革新劳工党吡啶环作为一个电子水槽( 17]。内部醛亚胺席夫碱之间的联系的和氨基活性部位的赖氨酸残基来回切换到外部醛亚胺席夫碱之间的联系和衬底氨基酸组中催化的中间。PLP-driven催化能力使PLP-dependent酶执行超过140种不同的氧化还原酶的酶活性,转移酶,水解酶,裂解酶和异构酶,包括五个六个一般类的所有酶( 16]。

在transaldimination PLP-dependent酶的催化,反应是严格守恒和至少两次发生在正向和反向方向:内部醛亚胺的反应是外部醛亚胺和逆反应亦然(计划 1)。最近,PLP的构象变化,尤其是之间的二面角的吡啶环和席夫碱的联系,提出了transaldimination反应中起着关键作用细菌L-serine水合酶(XometC) [ 18]。在这项研究中,我们克隆了 ToCDS基因 Thermococcus onnurineusNA1并确定ToCDS的晶体结构和复杂的催化中间配体从四个不同的晶体,然后与之相比 大肠杆菌CDS的结构。

 2。材料和方法 2.1。克隆

开放阅读框编码ToCDS蛋白质序列 Thermococcus onnurineusNA1放大了PCR使用基因组DNA分离 Thermococcus onnurineusNA1作为模板根据先前所描述的方法( 19]。序列的寡核苷酸引物设计基于基因组序列的数据 Thermococcus onnurineus从NCBI NA1网站。转发(5′ccc CC G CTA GCTGA TTC CGG gg ATG TTA-3′)和反向(5′ccc CC G CGG 20 CTT亚美大陆煤层气有限公司TCT柠檬酸广汽CTT TTA-3′)引物设计介绍 新人道我和 不我限制网站(粗体),分别。使用PCR扩增DNA片段被纯化菌进行净化设备(Bioneer,韩国),插入相同的限制性内切酶消化pET29b-His-Tev (pET29bHT)向量修改从原始pET-29b向量(Novagen、德国)有七个组氨酸残基的TEV裂解位点基因产物分子的n端,以促进蛋白质纯化。的表达载体pET29bHT - ToCDS变成了 大肠杆菌BL21 (DE3)和镀上仅有Bertani(磅) 20.包含50)琼脂 μ克毫升−1卡那霉素。kanamycin-resistant殖民地被选中,质粒DNA转化株被隔离使用质粒纯化工具包(Favorgen、台湾)。DNA测序证实的克隆进行了Macrogen设施(首尔,韩国)。

 2.2。超表达和纯化

大肠杆菌包含pET29bHT——BL21 (DE3)细胞 ToCDS种植在310 K光密度在600 nm (OD吗600年0.6磅中补充了50 μ克毫升−1卡那霉素。ToCDS是诱导的蛋白表达的异丙基 β-D-1-thiogalactopyrasnoside (IPTG)最后一个0.5毫米的浓度。细胞培养在同一温度310 K。经过一夜之间增长,细胞被离心法收获6000×g(视觉VS24-SMTi V5006A转子,韩国)20分钟在277 K。合成细胞颗粒resuspended在冰冷的裂解缓冲(25毫米Tris-HCl pH值7.5,300毫米氯化钠,15毫米咪唑、20% ( v/ v)甘油,3毫米 β巯基乙醇)和中断使用超声发生器(Sonomasher、韩国)。原油细胞提取离心机为30分钟21000×g(视觉VS24-SMTi V508A转子,韩国)在277 K去除细胞碎片。包含可溶性ToCDS的上层清液应用到Ni-NTA树脂与裂解产物(Novagen、德国)之前缓冲区,执行和亲和力净化根据制造商的协议。所有蛋白质纯化步骤进行了在277 K。列被缓冲B组成的25毫米Tris-HCl pH值7.5,1 M氯化钠,15毫米咪唑,20% ( v/ v)甘油。包含250毫米咪唑洗脱缓冲被用来洗提7×His-tagged ToCDS。的筛选了ToCDS透析8 h在277 K对透析缓冲区(25毫米Tris-HCl pH值7.5,15毫米氯化钠,3毫米 β巯基乙醇和20% ( v / v)甘油)。进一步净化HiTrap Q进行阴离子交换柱(美国通用电气医疗集团)平衡在缓冲区(25毫米Tris-HCl pH值7.5,15毫米氯化钠,3毫米 β巯基乙醇和20% ( v/ v)甘油)。ToCDS是清洗和筛选了一个梯度的0到100%缓冲b的净化协议的重组形式ToCDS持续了超过50毫克每升ToCDS培养基,在sds - page和蛋白质表现出一个乐队大约44 kDa。蛋白质结晶的解决方案集中使用离心过滤器(Amicon®Ultra-15, MWCO 10 kDa,德国)的最终浓度13毫克毫升−1在一个缓冲区组成的25毫米Tris-HCl pH值7.5和15毫米氯化钠。

 2.3。结晶和x射线数据收集

初始结晶筛选进行了在287 K sitting-drop扩散方法96 - Intelli-plates(美国艺术Robbins)使用九头蛇II电压降自动移液系统(美国矩阵)和筛选工具从汉普顿研究(水晶屏幕低温,水晶屏幕Lite,水晶屏幕HT,指数HT和SaltRx HT), MD1-46(美国睡眠™),向导和沉淀剂协同作用(美国翡翠生物)。两种ToCDS(13毫克毫升−1ToCDS单独和12毫克毫升−1ToCDS包含5毫米 l半胱氨酸和1毫米PLP)结晶。蛋白质溶液(0.5 μ0.5 l)混合 μl对50的储层解决方案和平衡 μ在287 K l储层的解决方案。

在两天内,仅ToCDS蛋白质晶体(水晶I)观察条件A11(水晶我条件)的MD1-46包含0.03 MgCl(美国睡眠)20.03米,CaCl2,15% ( v/ v甘油,15% ( w/ v4000年)挂钩,0.1三羟甲基氨基甲烷(基地)/ n -二甘氨酸液pH值8.5。成年晶体在液态氮在100 K flash-cooled cryoprotection解决水晶我条件与额外的5%甘油。试验获得反应中间体的结构、晶体我转移到解决晶体条件补充5毫米 l半胱氨酸和1毫米PLP不同的持续时间。gem-diamine的催化中间结构(GD)决定从水晶浸泡1 h(水晶II)。相同的水晶cryoprotection解我曾经flash-cool晶体二世在液态氮100 K。

同样,在两天内,ToCDS的晶体(水晶III)观察条件C2(水晶三世条件)的MD1-46(美国睡眠)包含0.03纳米3,0.03 Na2HPO4,0.03米(NH4)2所以4,15% ( v/ v)乙二醇,15% ( w/ v8000)挂钩,0.1米咪唑/ MES pH值6.5 ToCDS蛋白质样本包含5毫米 lPLP半胱氨酸和1毫米。成年晶体在液态氮在100 K flash-cooled cryoprotection解决水晶三世条件与额外的5%甘油。

ToCDS晶体的晶体(IV)中观察到的额外结晶溶液(水晶第四条件)含有10% ( v/ v)异丙醇,5% ( w/ v8000年)挂钩,从ToCDS imidazol /盐酸pH值5.9蛋白质样本包含5毫米 lPLP半胱氨酸和1毫米。成年晶体在液态氮在100 K flash-cooled cryoprotection解决水晶IV条件与额外的20%甘油。x射线数据收集在beamline 7和5 c浦项市光源(PLS),韩国。衍射数据集成和扩展使用Denzo和Scalepack,分别为( 21]。

 2.4。结构测定

自动标引程序( 21)表明,独自ToCDS(我)晶体的晶体,代表一个本地(NAT)结构,属于空间群P212121晶胞参数 一个 = 67.0 , b = 92.5 , c = 145.4 一个。P2的三个螺旋的轴12121被证实与系统化的缺席。衍射数据收集到2.6一项决议。ToCDS独自解决了利用分子结构的替代方法。的 MOLREP( 22)从 CCP4程序包( 23),使用cd结构 集胞藻属sp。PCC6803 (PDB条目1 t3i [ 24];42.8%序列身份)作为搜索模型,非常成功,显示一个二聚体的不对称单元。最初的 R因素从分子替换搜索是54.5%。分子结构建模和改进后的傻瓜( 25), REFMAC5( 26), R因素和自由下降到19.3% R因素是25.9%。确定原生ToCDS结构被用作模板来解决配体的复杂结构。基于结构的多序列比对中执行 T-Coffee( 27),然后使用 ESPript服务器( 28]。分子图形创建使用PyMOL [ 29日]。

 3所示。结果 3.1。ToCDS的主要结构

所有已知的cds显示氨基酸序列相似性和三维结构。然而,当地结构差异特征反应被用来分配信用违约掉期分为两类( 3, 30.]:我包括IscS-like序列和二级类包括进而CsdA-like序列(图 1)。类我信用违约掉期包含一个序列插入10多残留守恒的催化后半胱氨酸,和二类cds含有较短的守恒的催化赖氨酸后插入。的主要序列ToCDS符合二类;此外,与EcSufS ToCDS序列的39%,与EcCsdA 33%, 28%在399年与EcIscS残留。

与EcCDSs ToCDS结构序列比对。ToCDS cd从 Thermococcus onnurineusNA1;EcISCS、EcSUFS EcCSDA isc,进而,CsdA 大肠杆菌。守恒的催化半胱氨酸、赖氨酸残留物用星号标记。类我序列插入橘子所示矩形和二类序列中插入一个粉红色的矩形。的螺旋 α3和 α10 EcCDSs ToCDS和相应的螺旋线的蓝色矩形所示。

 3.2。本机ToCDS总体结构

本机ToCDS的晶体结构(NAT)决心(表2.6 1)。有一个二聚体有两个对称不对称单元(图 2(一个))。原体ToCDS由三个领域(图 2 (b))。n项域包含残留1 - 16,包括两个平行的 α螺旋线。大中央域有PLP结合位点含有残留17 - 285,由九个 α螺旋围绕九 β困,主要是平行的 β表。c项域(残留286 - 399)包含4个 α螺旋线,连同两股反平行的 β链。

数据收集和细化统计数据。

数据收集 NAT / NAT(水晶) GD / GD(水晶II) 第三IAA / GD(水晶) PSF / PSF(水晶(四)
PDB加入代码 5 b7 5 b87 5 b89 5 b7u
x射线源 PAL7A PAL5C PAL5C PAL5C
空间群 P212121 P212121 P212121 P212121
晶胞参数a, b, c (a) 67.0,92.5,145.4 67.1,93.6,145.0 62.9,78.7,171.9 62.8,78.5,171.3
分辨率范围(一) 50.0 - -2.6 50.0 - -2.3 50.0 - -1.5 50.0 - -1.9
数量的观察思考(独特的) 198476 (28968) 261138 (40955) 1605206 (128579) 635661 (66011)
完整性(%) 99.9 (100) 96.0 (100) 94.1 (91.9) 97.0 (91.9)
R合并(%) 11.9 (41.6) 9.5 (38.0) 8.9 (56.6) 6.2 (30.6)
平均 我/ σ( 我) 29.1 (7.1) 44.6 (5.3) 62.9 (6.5) 52.9 (12.2)
细化
分辨率(一个) 36.4 (2.6) 49.4 (2.3) 49。6 (1.5) 38.3 (1.9)
反射( F奥林匹克广播服务公司> 0 σ( F奥林匹克广播服务公司))
工作集 27449年 38845年 122068年 62613年
免费的 R集 1465年 2040年 6444年 3326年
R/ R免费的(%)c 19.3 (25.9) 17.7 (21.3) 16.7 (19.4) 16.5 (20.2)
蛋白质的原子数 6270年 6215年 6256年 6286年
配位原子数
丙氨酸 0 12 12 0
PLP 0 30. 30. 0
半胱氨酸 0 0 0 7
异丙醇 0 0 0 4
甘油 0 0 6 0
1,2-Ethanediol 0 0 4 0
水分子 0 137年 545年 259年
表示键的长度(A) 0.013 0.029 0.027 0.020
表示键角(o) 1.676 2.776 2.418 1.889
意味着B因子(A2)
主链原子 50.9 39.9 17.1 21.0
侧链原子 56.2 46.4 22.3 26.6
配位体
丙氨酸 厦门市。 51.8 32.1 厦门市。
PLP 厦门市。 32.5 22.9 厦门市。
半胱氨酸 厦门市。 厦门市。 厦门市。 46.6
异丙醇 厦门市。 厦门市。 厦门市。 36.7
水的原子 厦门市。 42.7 34.0 30.6
甘油 厦门市。 厦门市。 23.9 厦门市。
1,2-Ethanediol 厦门市。 厦门市。 31.6 厦门市。
拉马钱德兰情节(%)
支持地区 96.0 96.5 97.7 97.1
允许地区 2。9 2。8 1。8 2。4
离群值区域 1。1 0.7 0.5 0.5

括号中的值是最高的分辨率壳。NAT代表了原生结构,GD gem-diamine结构、IAA的内部醛亚胺结构产品丙氨酸,和PSF persulfide-bound结构。 R 合并 = ∑ h k l ∑ 我 我 我 h k l − 我 h k l / ∑ h k l ∑ 我 我 我 h k l ,在那里 我 我 h k l 的平均强度吗 我观察symmetry-related反射 hkl。 我/ σ( 我)代表一个反射的信号噪声。 R 免费的 = ∑ h k l F o b 年代 − F calc / ∑ h k l F o b 年代 , 在哪里 F calc 从原子模型计算蛋白质结构因素( R 免费的 计算与随机选择5%的反射)。 R 剩下的95%计算的反射在同一个方程 R 免费的 。RMSD代表均方根偏差。厦门市。:不是可用的。

本机结构ToCDS (NAT)在晶体。(a) ToCDS二聚体的整体内部醛亚胺结构。(b) ToCDS的原体结构。(c)活性部位ToCDS结构。衬底cysteine-binding网站显示为一个橙色的阴影。省略的地图PLP和Lys216的内部醛亚胺。省略地图显示2 fo-fc电子密度图(波状外形的1.0 σ;蓝色)和Fo-Fc电子密度图(波状外形的3.0 σ;绿色)。

ToCDS组成了一个预留功能二聚体,3882216979埋在二聚体界面2每个原体的溶剂可及表面。两个活动地点是位于中心PLP-binding域的二聚体界面。的席夫碱与Lys216在活性部位。领导,吡啶环是遍布His114和绑定到Ala192与范德瓦耳斯相互作用对边(图 2 (c))。5′的磷酸的紧密地绑定通过氢键与附近的残留Ser87, His215 Ser213, Thr268。

 3.3。结构比较ToCDS和EcCDSs之间

大肠杆菌有三个cd蛋白:EcIscS(一级),EcCsdA(二类),和EcSufS(二类),晶体结构的测定,在复杂[Fe-S]支架或硫受体蛋白质像IscU图萨和CsdE 8, 31日]。ToCDS结构叠加并与EcCDS结构在复杂硫受体蛋白(数据 3和 4)。整体的核心折叠ToCDS和三个EcCDSs保守但显示区域的差异。EcCDS复杂结构的受体蛋白质注定接近衬底的口通道通过与螺旋的交互 α3或 α10(二级结构遵循ToCDS编号)(数据 1和 4(一))。在EcIscS结构,没有 β词结构ToCDS (Ile247-Thr258 ToCDS二类序列插入)形成的上嘴衬底通道。相反,一个循环(EcIscS Ala327-Leu333)存在于衬底通道的另一侧,和c端域相对转移(图 3(一个))。通过与螺旋的交互IscU注定 α10(图 4 (b))。通过与螺旋的交互图萨注定 α3(图 4 (c))。在EcCsdA结构,长 α3螺旋向外弯曲,生成的一个大洞,活性部位(图 3 (b))。CsdE是弯曲的螺旋之间的绑定 α3、螺旋 α10 c端域主要通过与螺旋的交互 α10(图 4 (d))。与ToCDS EcSufS显示最相似的结构,包括拟议中的acceptor-binding站点和一个额外的 β在n端结构域(图词循环 3 (c))。没有EcSufS的受体蛋白结合的复杂结构尚未确定。

结构比较ToCDS和EcCDS结构。(一)叠加结构ToCDS(绿色)和EcCDS isc(橙色)。的 β词ToCDS结构由绿色箭头标记。一个错误的翻译导致的c端域isc橙色箭头所示。(b)的叠加结构ToCDS(绿色)和EcCDS CsdA(紫色)。弯曲的螺旋 α3 CsdA由紫色箭头标记。(c)叠加结构ToCDS(绿色)和EcCDS进而(红色)。

提出了受体此种ToCDS。(一)表面ToCDS的代表。衬底通道由一个粉色箭头标签,显示中粉红色。螺旋 α3和 α10个标签。(b) isc / IscU复杂结构叠加在ToCDS结构和只有IscU表示为一个卡通。图萨(c) isc /复杂结构叠加在ToCDS结构和只表示为一个卡通图萨。(d) CsdA / CsdE复杂结构叠加在ToCDS结构和只有CsdE表示为一个卡通。

 3.4。催化中间ToCDS结构

我们研究如果ToCDS是守恒的催化机理与细菌的信用违约掉期。确定ToCDS与基底材料的催化中间结构,产品,或反应中间配体,我们浸泡和共晶衬底 l半胱氨酸与本机ToCDS晶体并确定三种不同复杂结构的ToCDS(参见图S1在网上补充材料 https://doi.org/10.1155/2017/5395293)。复杂的ToCDS结构包括gem-diamine结构与persulfide-bound Cys356(图印地),内部醛亚胺结构与现有的丙氨酸(IAA)与persulfide-bound Cys356(图就是S1c),和内部醛亚胺结构persulfide-bound Cys356 (PSF)(图S1a和图 5 (c))如下催化反应的顺序(计划 1)。

比较ToCDS和XometC催化中间结构。(一)叠加ToCDS NAT(青色)和GD(黄色)结构附近的残留。(b)叠加XometC NAT(青色)和外部醛亚胺与丙氨酸(紫色)结构附近的残留。(c)活跃的站点结构ToCDS PSF。2 fo-fc电子密度地图轮廓线为1.0 σ(蓝色)。

 3.5。Gem-Diamine (GD)结构

在晶体II和III,三个原体的GD结构测定,显示清晰的电子密度的PLP-bound丙氨酸,PLP,席夫碱连杆债券(图印地)。过硫化物组从衬底半胱氨酸和转移到Cys356删除。当我们ToCDS GD结构叠加到ToCDS NAT结构,革新劳工党吡啶环的构象和His114结构守恒(图 5(一个))。XometC[催化中间结构的 18],L-serine PLP-dependent酶的酶,吡啶环和Tyr112 (ToCDS His114)显示,倾斜构象变化(图 5 (b))。然而,没有领导,吡啶环的倾斜和His114 ToCDS观察。

之间的二面角,吡啶环和席夫碱连杆与Lys216(内部二面角)ToCDS GD结构得到了更广泛的比ToCDS NAT结构近20°(图 6和表 2)。之间的二面角的吡啶环和席夫碱连杆与丙氨酸(外部二面角)被发现比内窄二面角(图S2a和表 2)。两个氨基酸组Lys216和产品丙氨酸的相似距离2.9近似等边三角形的羟基形式。的羟基的提出为催化基础deprotonate传入衬底XometC氨基集团( 18]。在 大肠杆菌NAT (PDB ID: 1 jf9)和GD(与硒代半胱氨酸在复杂;PDB ID: 1 kmk) CsdB结构(EcNifS_CsdB),这是一个NifS-like CDS [ 32),测定( 33]。类似于ToCDS中间结构,内部的二面角EcNifS_CsdB GD结构是更广泛的比EcNifS_CsdB NAT结构由35°。衬底硒代半胱氨酸的氨基酸组EcNifS_CsdB GD结构还存在接近领导,吡啶环上的羟基。

二面角角度ToCDS原体在晶体I, II, III和IV。(a)平均每个催化的二面角的状态。积极的反角都是内部醛亚胺。消极的二面角角度是外部醛亚胺。(b)的叠加结构ToCDS NAT(青色),GD(紫色),和IAA(黄色)。结构基础上叠加,吡啶环的位置。

二面角角度的吡啶环和席夫碱链接中ToCDS原体。

原体 (内部) (外部) B(内部) B(外部)
水晶我(NAT / NAT) 47.7 厦门市。 45.0 厦门市。
晶体二世(GD / GD) 69.1 −50.2 64.8 −53.6
水晶III (IAA / GD) 53.3 −51.4 64.9 −50.0
水晶IV (PSF / PSF) 38.3 厦门市。 50.3 厦门市。
平均 标准的开发。 平均 标准的开发。
NAT和PSF 45.3 5.2 厦门市。 厦门市。
GD 66.2 2。5 −51.2 2。0
国际宇航科学院 53.3 厦门市。 −51.4 厦门市。

积极的反角值为内部醛亚胺在NAT, PSF和GD结构和消极的反角值GD外部醛亚胺的结构,提出了外部IAA的醛亚胺结构。厦门市。:不是可用的。

 3.6。内部醛亚胺结构与现有的丙氨酸(IAA)

在水晶三世,内部醛亚胺结构与现有的丙氨酸(IAA)决定在原体,显示清晰的电子密度附近的丙氨酸PLP但不与PLP(图就是S1c)。过硫化物组转移必将Cys356,显示相同的构象GD的结构。内部之间的二面角,吡啶环和席夫碱连杆之间的债券是在中间的NAT和GD结构。革新劳工党之间拟议的虚构的外部二面角,吡啶环上的氨基丙氨酸在IAA结构,几乎是一样的外部二面角的GD结构。然而,产品的氨基丙氨酸IAA结构由0.7远离PLP,相比GD的结构。两个氨基酸组,Lys216和产品丙氨酸和羟基PLP做出了一个几乎完美的三角形(图开通)。

 3.7。Persulfide-Bound Cys356 (PSF)结构

在水晶IV,内部醛亚胺结构persulfide-bound Cys356决心在1.9(图S1a和图 5 (c))。在原体,persulfide-bound Cys356显示和定位在同一位置GD和IAA结构。在原体B, Cys356没有显示是因为灵活的构象。PSF结构是结构从半胱氨酸硫转移后从ToCDS ToCDS和丙氨酸释放产品。上过硫化物Cys356注定与His115 Gly245通过氢键和His355 Ile247通过范德华相互作用(图 5 (c))。绑定过硫化物面临衬底的口通道,这是公认的受体蛋白质链接的网站。过硫化物的立场提出了旋转Cys356侧链的构象变化后拿起从衬底半胱氨酸硫原子的活性部位。的persulfide-bound EcNifS_CsdB结构(PDB ID: 1 kmj) ( 33)也显示相同的旋转persulfide-bound侧链活性部位的半胱氨酸残基ToCDS GD、IAA和PSF结构,这意味着,终端过硫化物和附近的活性位点残基之间的相互作用对构象的变化很重要。的构象的和席夫碱连杆ToCDS PSF ToCDS NAT的结构很保守的结构(图 5(一个))。

 3.8。结构比较催化中间ToCDS结构

我们比较了催化中间结构和二面角角度,吡啶环和内部和外部之间的氨基酸组Lys216和丙氨酸ToCDS(图 6和表 2)。中间结构的整体构象是守恒的。然而,内部二面角显示灵活的构象变化从38°- 69°:内部二面角有广泛的NAT的顺序,IAA和GD结构。外部二面角和提出外部二面角GD和IAA结构保持几乎类似−51°。

 4所示。讨论

我们确定晶体的快照催化中间ToCDS结构(计划 1)。Transaldimine反应是所有PLP-dependent酶的守恒的关键一步。最近,双面角变化,吡啶环和席夫碱之间的联系,提出了发挥重要作用在transaldimination XometC基于催化反应中间产物晶体结构和高级计算计算( 18)(图S3)。二面角的构象变化有两个主要的角色。首先,它引起了衬底上氨基的亲核攻击的席夫碱PLP联系起来。第二,革新劳工党吡啶环上的羟基催化碱和酸作用传入衬底的去质子化氨基和两个氨基酸之间的协调一致的质子转移组在GD结构。

ToCDS显示类似的二面角的催化中间结构变化与XometC催化步骤。PLP-dependent催化机制是守恒的。的内部二面角ToCDS从45°NAT结构改为66°平均GD结构。在我们的理解中,位阻从传入衬底的氨基半胱氨酸推开氨基酸席夫碱联系群Lys216没有倾斜,吡啶环由于紧密的绑定。GD和IAA结构,氨基配体的定位只是旁边,吡啶环上的羟基,这是一个合适的构象deprotonate传入的衬底氨基和执行两个氨基酸组之间的质子转移衬底和活跃的站点赖氨酸在XometC提出( 18]。

PLP-dependent酶酶用途广泛,几乎占所有机密酶活动的4%。PLP-dependent各种类的酶,不同的氨基酸靠近的被提议作为催化基地deprotonate氨基的基质。XometC, ToCDS EcNifS_CsdB结构,革新劳工党吡啶环上的羟基是更紧密地将比任何其他公认的催化底物氨基基氨基酸。PLP-dependent酶,transaldimination反应耦合反应应该发生至少两倍的向前和向后的,两边向前和向后transaldimination反应是对称的两个氨基酸组赖氨酸侧链和衬底犯同样的席夫碱连杆的在两面。如果我们考虑氨基酸残基的活性部位大多数酶催化基础,需要两个单独的催化基础残留PLP两边。然而,革新劳工党吡啶环上的羟基可以执行催化基础角色双方两个氨基酸组的中心,这可能是PLP-dependent酶的更简单和更高效的模型。

GD结构允许我们衡量二面角的两个相反的方向,向内部醛亚胺(正值)和外部醛亚胺(负值)(表 2)。IAA结构,提出了二面角与丙氨酸也是衡量。在GD和IAA结构,外部的负面价值二面角角度几乎是守恒的−51°左右。活性部位的ToCDS IAA结构、丙氨酸是紧密地绑定:守恒Arg371侧链与丙氨酸的羧酸盐和分叉氢键Asn165也有氢键与丙氨酸羧酸盐(图S4)。传入的衬底半胱氨酸的绑定位置将类似的产品在国际上丙氨酸结构。结合紧密的固定位置的氨基可以保持外部的二面角醛亚胺的GD和IAA结构。IAA结构,三个氮原子在两个羟基的氨基酸组和氧气,吡啶环显示一个几乎完美的三角形状。在GD结构中,丙氨酸氨基之间的距离和alanine-attached的碳原子减少作为衬底接触,保持相同的外部二面角(图 6)。

晶体结构的平均结构很容易超过千数十亿蛋白质晶格排列。当提供衬底,ToCDS酶的晶体结构可以作为一个多催化国家存在,例如混合催化两个或两个以上的状态。我们收集了成千的不同ToCDS晶体多年来通过改变各种变量如衬底孵化期间,基质和配体的浓度和底物浸泡和共结晶的方法。我们推测,催化ToCDS中间结构的确定是可能通过捕获时刻的酶催化国家对其他国家举行的主要人口的晶体。

最近的研究热点硫代谢透露很多小说酶和通路( 14]。然而,热点信息同化硫代谢等生物分子合成(Fe-S)集群组装是有限的。我们不理解ToCDS的生理作用 Thermococcus onnurineusNA1。在一级和三级结构,ToCDS相似性最高,EcSufS EcCDSs相比三国。EcSufS属于进而系统参与集群(Fe-S)合成在不利条件下的氧化和重金属压力和铁饥饿( 34]。的环境条件 Thermococcus onnurineusNA1的栖息地也极端物化对温度范围2到100°C,氧化状态,流体速度( 1]。在进化过程中,ToCDS可能的祖先EcSufS-like cds在压力条件下工作。我们需要进一步的研究来找出ToCDS的生理作用。

 5。结论

我们克隆了 ToCDS基因的 Thermococcus onnurineusNA1并确定ToCDS的晶体结构(NAT)和在复杂催化中间配体(GD、IAA和PSF)。ToCDS属于二类cd基于主和三级结构和EcSufS显示最高的相似度。ToCDS PLP-dependent酶,催化中间体的晶体快照ToCDS显示席夫碱的守恒的二面角旋转连杆相对于领导,吡啶环所示EcNifS_CsdB XometC,这意味着ToCDS PLP-dependent催化机理是守恒的。本研究打算帮助理解ToCDS的催化机理和古细菌sulfur-trafficking系统合成含硫的生物分子。

 附加分

PDB的引用。原子坐标和结构性因素对晶体结构报道已经存入蛋白质数据银行加入代码下5 b7(水晶我、NAT / NAT), 5 b87(水晶II, GD / GD), 5 b89(水晶三世,IAA / GD)和5 b7u(水晶IV, PSF / PSF)。

 的利益冲突

没有利益冲突的手稿。

 作者的贡献

Thien-Hoang Ho和Kim-Hung Huynh贡献了同样的工作。

 确认

作者感谢Beamline 5 c的员工的浦项市加速器实验室(PAL),韩国。他们感谢朝鲜海洋研究和发展研究所(KORDI)的基因组DNA Thermococcus onnurineusNA1。这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府资助(MSIP)(没有。2015 r1a2a2a01004375)和由世界顶尖大学(WTU)韩国建国大学的联合研究拨款。

 李 h·S。 康 s G。 英国宇航系统公司 美国年代。 Lim j·K。 赵 Y。 金 y . J。 全 j . H。 查 美国年代。 Kwon K·K。 金 h·T。 公园 c·J。 李 h·W。 金 我美国。 春 J。 Colwell R R。 金 美国J。 李 j . H。 的完整基因组序列Thermococcus onnurineus NA1揭示了一个混合异养和carboxydotrophic新陈代谢 细菌学期刊 2008年 190年 22 7491年 7499年 PMC2576655 18790866 10.1128 / JB.00746-08 2 - s2.0 - 55549124188 金 y . J。 李 h·S。 金 大肠。 英国宇航系统公司 美国年代。 Lim j·K。 Matsumi R。 Lebedinsky 答:V。 Sokolova t·G。 科泽尼科瓦 d . A。 查 美国年代。 金 美国J。 Kwon K·K。 Imanaka T。 Atomi H。 Bonch-Osmolovskaya 大肠。 李 j . H。 康 s G。 Formate-driven增长加上H(2)生产 自然 2010年 467年 7313年 352年 355年 20844539 10.1038 / nature09375 2 - s2.0 - 77956936499 历经甲级 H。 江崎 N。 细菌半胱氨酸desulfurases:它们的功能和机制 应用微生物学和生物技术 2002年 60 1 - 2 12 23 12382038 10.1007 / s00253 - 002 - 1107 - 4 2 - s2.0 - 0037209757 Muhlenhoff U。 犹豫 J。 Richhardt N。 凯撒 j . T。 桃花心木 K。 Kispal G。 莉儿 R。 真核生物的功能描述半胱氨酸desulfurase Nfs1p 酿酒酵母 《生物化学》杂志上 2004年 279年 35 36906年 36915年 15220327 10.1074 / jbc.M406516200 2 - s2.0 - 4344595102 约翰逊 d . C。 迪安 d·R。 史密斯 答:D。 约翰逊 m·K。 结构、功能和生物iron-sulfur集群的形成 年度回顾生物化学 2005年 74年 247年 281年 15952888 10.1146 / annurev.biochem.74.082803.133518 2 - s2.0 - 20744446399 郑 l 白色的 r·H。 现金 诉L。 迪安 d·R。 机制提取l -半胱氨酸的脱硫催化nifS基因产物 生物化学 1994年 33 15 4714年 4720年 8161529 郑 l 白色的 r·H。 现金 诉L。 杰克 r F。 迪安 d·R。 半胱氨酸desulfurase活动表明NIFS在metallocluster生物合成的作用 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 1993年 90年 7 2754年 2758年 PMC46174 8464885 史 R。 Proteau 一个。 Villarroya M。 Moukadiri 我。 张 l Trempe j·F。 不光滑的 一个。 Armengod m E。 Cygler M。 集群结构基础Fe-S组装和tRNA thiolation由isc蛋白质相互作用 公共科学图书馆生物学 2010年 8 4、文章e1000354 PMC2854127 20404999 10.1371 / journal.pbio.1000354 2 - s2.0 - 77951749014 Beinert H。 对硫 欧洲生物化学杂志 2000年 267年 18 5657年 5664年 10971575 Yokoyama K。 Leimkuhler 年代。 菲斯的角色集群钼辅因子的生物合成和molybdoenzymes细菌 Biochimica et Biophysica学报 2015年 1853年 6 1335年 1349年 PMC4834969 25268953 10.1016 / j.bbamcr.2014.09.021 2 - s2.0 - 84939958818 莉儿 R。 iron-sulphur蛋白质的功能和生物转化 自然 2009年 460年 7257年 831年 838年 19675643 10.1038 / nature08301 2 - s2.0 - 68949128587 Py B。 彭 F。 构建Fe-S蛋白质:细菌的策略 自然评论。微生物学 2010年 8 6 436年 446年 20467446 10.1038 / nrmicro2356 2 - s2.0 - 77952813340 Blauenburg B。 Mielcarek 一个。 Altegoer F。 费奇 c, D。 Linne U。 邦格 G。 Marahiel m·A。 晶体结构的枯草芽孢杆菌半胱氨酸desulfurase进而及其动态交互frataxin和支架蛋白SufU 《公共科学图书馆•综合》 2016年 11 7条e0158749 PMC4934914 27382962 10.1371 / journal.pone.0158749 2 - s2.0 - 84978177102 刘 Y。 啤酒 L . L。 惠特曼 w·B。 硫古生菌的代谢过程揭示了小说的过程 环境微生物学 2012年 14 10 2632年 2644年 22626264 10.1111 / j.1462-2920.2012.02783.x 2 - s2.0 - 84867191342 Hidese R。 井上 T。 Imanaka T。 藤原 年代。 半胱氨酸desulphurase起着重要的作用在环境适应hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis 分子微生物学 2014年 93年 2 331年 345年 24893566 10.1111 / mmi.12662 2 - s2.0 - 84903980488 Percudani R。 Peracchi 一个。 一个基因组pyridoxal-phosphate-dependent酶的概述 EMBO报告 2003年 4 9 850年 854年 PMC1326353 12949584 10.1038 / sj.embor.embor914 2 - s2.0 - 0142186241 托尼 m D。 磷酸吡哆醛酶学 Biochimica et Biophysica学报 2011年 1814年 11 1405年 1406年 21871586 10.1016 / j.bbapap.2011.08.007 2 - s2.0 - 80054699132 非政府组织 h·P。 Cerqueira n·M。 金 j·K。 在香港 m·K。 费尔南德斯 p。 拉莫斯 m·J。 康 l·W。 的发生构象变化的酶反应 Acta Crystallographica。段D,生物晶体学 2014年 70年 Pt - 2 596年 606年 24531493 10.1107 / S1399004713031283 2 - s2.0 - 84894146310 Tran h·T。 在香港 m·K。 非政府组织 h·P。 黄齐的 k . H。 安 y . J。 王 Z。 康 l·W。 从鼠疫杆菌D-alanine-D-alanine结构连接酶:核苷酸磷酸丝氨酸识别的循环 晶体学报:D:卷结构生物学 2016年 72年 Pt 1 12 21 26894530 10.1107 / S2059798315021671 大理石 一个。 Hoglend P。 Ulberg R。 自保护离子变化和症状后动态心理治疗:预处理动机的影响 临床心理学杂志 2011年 67年 4 355年 367年 21305543 10.1002 / jclp.20771 2 - s2.0 - 79952124615 Zbyszek Otwinowski w·M。 处理x射线衍射数据的收集在振荡模式 方法酶学 1997年 276年 307年 326年 27754618 的胸前 一个。 Teplyakov 一个。 分子替代MOLREP Acta Crystallographica。段D,生物晶体学 2010年 66年 Pt 1 22 25 20057045 10.1107 / S0907444909042589 2 - s2.0 - 74549194551 韦恩 m D。 巴拉德 C . C。 卡谭 k·D。 道森 e . J。 Emsley P。 埃文斯 p R。 基冈 r·M。 Krissinel e . B。 莱斯利 a·G。 麦科伊 一个。 McNicholas 美国J。 Murshudov g . N。 Pannu n S。 Potterton 大肠。 鲍威尔 h·R。 读 r . J。 的胸前 一个。 威尔逊 k . S。 CCP4套件和当前发展的概述 Acta Crystallographica。段D,生物晶体学 2011年 67年 Pt 4 235年 242年 PMC3069738 21460441 10.1107 / S0907444910045749 2 - s2.0 - 79953737180 Tirupati B。 一 j·L。 庄士贤 c . L。 Bollinger j . M。 小 Slr0077 /进而动力学和结构表征,基本半胱氨酸desulfurase从集胞藻属PCC 6803 sp 生物化学 2004年 43 38 12210年 12219年 15379559 10.1021 / bi0491447 2 - s2.0 - 4644275046 Emsley P。 Lohkamp B。 斯科特 w·G。 卡谭 K。 傻瓜的特性和发展 Acta Crystallographica。段D,生物晶体学 2010年 66年 Pt 4 486年 501年 PMC2852313 20383002 10.1107 / S0907444910007493 2 - s2.0 - 77949535720 Murshudov g . N。 Skubak P。 列别捷夫 答:一个。 Pannu n S。 施泰纳 r。 尼科尔斯 r。 韦恩 m D。 长 F。 的胸前 答:一个。 REFMAC5大分子晶体结构的改进 Acta Crystallographica。段D,生物晶体学 2011年 67年 Pt 4 355年 367年 PMC3069751 21460454 10.1107 / S0907444911001314 2 - s2.0 - 79953763877 Notredame C。 希金斯 d·G。 Heringa J。 T-Coffee:小说多重序列比对方法快速、准确 分子生物学杂志 2000年 302年 1 205年 217年 10964570 10.1006 / jmbi.2000.4042 2 - s2.0 - 0034623005 Gouet P。 Courcelle E。 斯图尔特 d . I。 Metoz F。 ESPript:在PostScript多重序列比对分析 生物信息学 1999年 15 4 305年 308年 10320398 薛定谔 l PyMOL分子图形系统 2010年 1.3版本r1 5752775 0014435964 黑色的 k。 多斯桑托斯 p C。 Shared-intermediates thio-cofactors:生物合成的机理和半胱氨酸desulfurases和硫磺受体功能 Biochimica et Biophysica学报 2015年 1853年 6 1470年 1480年 25447671 10.1016 / j.bbamcr.2014.10.018 2 - s2.0 - 84926165314 金 年代。 公园 年代。 结构性变化在半胱氨酸desulfurase CsdA和硫磺接受者提供洞察trans-persulfuration CsdE交互 《生物化学》杂志上 2013年 288年 38 27172年 27180年 PMC3779715 23913692 10.1074 / jbc.M113.480277 2 - s2.0 - 84884574069 历经甲级 H。 藤井裕久 T。 加藤 年代。 栗原市 T。 哈塔 Y。 江崎 N。 外部醛亚胺的结构 大肠杆菌CsdB isc / NifS同族体:影响对硒代半胱氨酸的特异性 生物化学杂志 2002年 131年 5 679年 685年 11983074 秘鲁首都利马 c, D。 的分析 大肠杆菌NifS CsdB蛋白质2.0揭示了结构perselenide和过硫化物中间形成的基础 分子生物学杂志 2002年 315年 5 1199年 1208年 11827487 10.1006 / jmbi.2001.5308 2 - s2.0 - 0036303444 Outten f·W。 Djaman O。 Storz G。 进而操纵子要求Fe-S集群组装铁饥饿中 大肠杆菌 分子微生物学 2004年 52 3 861年 872年 15101990 10.1111 / j.1365-2958.2004.04025.x 2 - s2.0 - 2442567822