rF1V和rBV A/B疫苗的先进开发:进展和挑战

抽象的

开发微生物和细菌毒素疫苗，有可能用作生物战和生物恐怖剂，是美国生物防御计划的一个重要组成部分。DVC正在开发两种疫苗，一种用于预防吸入性接触肉毒杆菌神经毒素A1和B1，另一种用于治疗yersinia pestis.，最终目标是在动物规则下获得食品和药物管理局的许可。在所有技术领域都取得了进展，包括疫苗的制造、非临床和临床开发和测试，以及化验开发。本章描述了这些疫苗的目前发展状况和仍然存在的挑战。

1.介绍

某些高致病性微生物及其产品已被用来作为对任何军事或平民的武器的可能性。美国疾病控制和预防中心（CDC）根据以下曝光后果严重性分类这些试剂分成三类（A，B，或C）一个（http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp；2011年4月7日)。美国国防部国防部（DoD）的发展治疗学和预防药物（疫苗）的悠久历史，以防止攻击性使用这些药物的战士。直到最近，这些措施可能会在研究新药申请（IND）机制来使用。现在，美国国防部的任务是给予美国作战人员任何此类产品通过了美国食品和药物管理局（FDA）的许可。目前，DVC正在开发两种疫苗的国防部的联合疫苗采办项目（JVAP）;这些包括重组疫苗，以防止致命肉毒中毒以下吸入暴露于A1和肉毒杆菌神经毒素的血清型B1（RBV A / B），以及作为重组疫苗，以防止肺鼠疫以下吸入暴露于yersinia pestis.（Y. Pestis.) (rF1V)。下面将对每个项目的具体表现和监管要求、进展、挑战和成功进行回顾。

2.疾病特征

2.1。肉类主义

肉毒中毒是由细菌产生的神经毒素引起的肉毒梭状芽胞杆菌（c .肉毒)，疾病以不同形式出现，包括婴儿、伤口、成人定植和食源性肉毒杆菌中毒[1］．临床表现为胆碱能抑制，特征性征象包括下降肌无力、口干、吞咽困难、言语模糊、视力重影或模糊、眼睑下垂。肉毒杆菌神经毒素(BoNT)最终导致呼吸肌肉瘫痪，从而阻止无辅助呼吸，并在短时间内导致死亡。暴露于雾化BoNT会导致另一种形式的疾病，称为吸入型肉毒中毒，其症状类似[2］．目前，唯一的毒理后唯一的毒性参考点是基于非人类灵长类动物（NHP）研究（基于Bont / 70千克体重的质量）和食物造成的血液水平的估算肉毒株病例。肌肉内（IM）曝光的难以血管型A的人类致死性估计在0.09至0.15的范围内 μ.g/70 kg bodyweight and from 0.7 to 0.9 μ.g/ 70kg体重，根据NHP研究的外推[2，3.］．目前还没有关于BoNT血清B型对人类致死率的已发表的估计。肉毒中毒患者血清中BoNT水平通常低于10只小鼠腹腔内致死剂量的50% (MIPLD)₅₀) /毫升(2］．

在美国的肉毒杆菌中毒病例治疗通常包括马抗毒素血清和支持治疗的管理。马抗毒素包括有执照的二价和含有中和抗的BoNT类型分别为A / B和E，抗体的单价抗毒素，和一种调查七价（ABCDEFG）抗毒素。七价肉毒抗毒素（HBAT，Cangene公司），可通过一个CDC赞助IND协议。继2010年3月的二价和单价产品到期，HBAT成为美国可自然产生的肉毒杆菌noninfant唯一肉毒抗毒素。婴儿肉毒中毒的病例都与这是从与5价（ABCDE）类毒素疫苗免疫人供体的血液的最近许可BabyBIG处理。在暴露于致死攻击NHP中，当18至36小时的暴露内施用治疗是唯一有效的。

2.2。瘟疫

鼠疫是一种人畜共患感染Y. Pestis.这通常是由啮齿类动物传染给人类，当人类被感染跳蚤咬伤。有三种表现该疾病的，与其中引流淋巴结的疼痛的肿胀（腹股沟淋巴结炎）发生跳蚤叮咬通常使所述腺形式[4，5］．留下未经处理的，感染将在大约一半的病例中导致败血症和死亡。Bubo形成不存在于第二种疾病中，这直接导致败血症，并发生在大约三分之一的病例中。Bubonic和血管血症感染偶尔进展到次生肺炎感染。感染Y. Pestis.也很少通过吸入生物体，并且在1至6天后，疾病在其肺炎形式中表现出来，除非患者在症状发作后20小时内用抗生素治疗患者，否则几乎总是致命的致命形式6]，并通过咳嗽时形成的呼吸道飞沫在人与人之间传播[7- - - - - -11］．临床症状包括咳嗽和呼吸困难发烧，并有可能成为生产血性，水样痰。恶心，呕吐，腹痛，腹泻也可能存在。

除了用抗生素对鼠疫进行早期诊断和治疗(这对生存至关重要)外，美国没有获得许可的鼠疫疫苗。杀鼠疫全细胞疫苗(福尔马林灭活)的生产Y. Pestis.)，先前授权为Plague疫苗美国药典于1999年停产。此外，该疫苗对预防原发性肺鼠疫无效。

3.国防部疫苗性能要求

有需要一种可以保护呼吸道接触肉毒杆菌神经毒素和鼠疫疫苗。这些疫苗由DVC的发展是由国防部的性能要求，并按照动物规则功效的示范引导（21 CFR 601.91子部分H，“生物制品的审批人时的疗效研究是不道德的或可行的”）。

国防部产品的性能是基于在能力发展文件提供用户要求（表1）.对于本文描述的两种疫苗，关键的性能参数是FDA许可。所有其他需求被描述为阈值(即，绝对最低可接受的性能水平)或目标(被认为是理想的特征)。表格1列出了rBV A/B和rF1V疫苗的一些特征。这些需求构成了在开发过程中评估产品的基础。

鉴于FDA执照是美国国防部的医疗措施的最终关键性能参数，整个生命周期的发展计划是没有什么不同的正在开发的产品由私营部门。然而，国防部的产品也必须按照采购条例（联邦采购条例，国防联邦采购条例补充，等）开发。此外，这些方案都受到防御资金，这并不总是灵活，因为可能与商业发展的情况。

4.监管策略:FDA动物规则

在RBV A / B和rF1V疫苗的执照将使用FDA动物规则。动物规则是由FDA建立允许的，但其不能用传统的功效测试许可产品的开发和执照。动物规则可以用于执照时效力研究是不道德由于高致病性，和疾病在本质上是罕见以至于实地研究将是不可能或至少不切实际（http://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/98fr/053102a。htm；2011年4月7日)。

是FDA的动物法则的四个主要要求如下：（一世）要求1号：有该物质的毒性和其预防或这种毒性由产品的显着降低的相当容易理解的病理生理机制。（ii）要求2号：效果证明在多于一个动物物种预期与用于人的响应预测反应，除非效果表明在表示足够良好表征的动物模型，用于预测在人体中的响应的单一动物物种．（iii）没有要求。3.: The animal study endpoint is clearly related to the desired benefit in humans, generally the enhancement of survival or prevention of major morbidity.（ⅳ）要求4号：产品或其他相关数据或信息，动物或人类的动力学和药物动力学的数据或信息允许在人类中选择有效剂量。

截至2011年7月，没有疫苗根据FDA动物规则获得FDA批准，因此获得批准所需的时间和成本尚未确定。传统的许可证从发现到批准可能需要15年;由于额外的非临床要求，FDA动物规则对疫苗的批准可能需要更长时间(图)1)以及开发和描述动物模型和挑战系统的必要性。

5. RBV A / B和rF1V疫苗的开发

rBV A/B和rF1V候选疫苗最初是由美国陆军传染病医学研究所(USAMRIID)开发的。在开发的早期阶段，它们被转移到JVAP(随后转移到DVC)。这些疫苗的目标适应症是保护18至55岁的成年人免受吸入BoNT/A1、BoNT/B1或Y. Pestis.．

RBV A / B疫苗候选人[12包括重组50kDa羧基末端的抗原A和抗原B的重链末端Pichia Pastoris.使用甲醇感应系统。抗原A衍生自表达的Bont / A1c .肉毒菌株NCTC 2916（组I，蛋白水解），和抗原B从由下式表示的BoNT / B1衍生c .肉毒丹麦株(ⅰ组，蛋白水解)。抗原A通过去除易水解氨基酸的密码子来防止基因表达过程中n端蛋白的水解裂解。每0.5 mL rBV A/B-40由1:1的20的混合物组成μ.g抗原A和20μ.g抗原B吸附于水凝胶。

鼠疫候选rF1V疫苗[13]包括F1荚膜蛋白和中的V蛋白的毒力Y. Pestis.科罗拉多92（CO92）稠合到一个单一的蛋白质，这是在生产大肠杆菌（E大肠杆菌），并制定了与铝胶。

对于任何产品来说，获得许可的成功进展都需要整合不同的功能小组，从研发概念验证阶段开发可扩展的制造流程，协调适合测试的制造材料的发放和适当的非临床、和临床研究。下文描述了rBV A/B和rF1V疫苗的生产、非临床和临床工作进展情况。

5.1。制造工艺

rBV A/B和rF1V疫苗最初是在美国医学和免疫研究所开发的，并在图中灰色箭头所示的阶段转入高级开发阶段2. 黑色箭头表示每个产品的制造开发阶段。这些产品成功地克服了以下挑战，进入了制造阶段：（1）向合同制造组织进行技术转让，并因设备变更而重新设计工艺；（2）开发支持临床试验材料生产并可验证的制造方法，（3）与所需部队等效剂量数量增加或不可缩放技术步骤相关的放大问题，（4）开发产品定量、纯度和工艺杂质所需的试剂和分析方法，以及（5）确定在整个制造过程中支持产品稳定性的条件。

这Pichia Pastoris.用于产生RBV A / B疫苗的抗原A和抗原B表达菌株的母细胞和工作细胞库是通过扩大为每种抗原制备的加入细胞库来产生，并根据FDA和国际会议表征纯度，身份和适用性论协调（ICH）指导。抗原A和抗原B分别制造并吸附到Alhydrogel上，然后组合形成最终配制的散装疫苗。制造过程处于商业规模（抗原A和600L用于抗原B的100L）。目前的良好制造实践（CGMP）填充/结束活动在5,000个小瓶中进行，以支持1B期和第2期临床试验。目前，配制的FDP制造过程正在扩大到全部商业规模（约300,000瓶/批次）。

融合rF1V蛋白由F1荚膜蛋白和V毒力蛋白组成Y. Pestis.是生产的E大肠杆菌并用佐剂Alhydrogel配制。编码RF1V抗原的序列衍生自USAMRIID中产生的质粒PPW731 [13]并且最初从pT5.F1V.1细胞库表达，但是后来过渡到从pPW731细胞库表达由于知识产权约束。两种表达系统使用用于基因表达和用于质粒维持相同的抗生素抗性基因相同的调控元件。根据FDA和ICH指导细胞库进行表征的纯度，身份和适用性。这manufacturing process was scaled to a final commercial process, which is 1,500 L (working volume for fermentation) and 500 L purification scale.

每种疫苗的临床批次被制造并释放用于完成的阶段1和正在进行的第2阶段试验，如下所述。稳定性计划正在进行中，旨在建立，维护和执行符合FDA和ICH指导的测试策略。

5.2。支持动物规则要求的非临床研究

动物模型对于FDA的动物规则许可来说既严重重要，因为它们用于评估疫苗疗效，并且将疫苗诱导的动物免疫应答与人免疫反应进行比较，以预测临床效益。“行业 - 动物模型的指导指南 - 在2009年发布的动物统治下解决疗效的基本要素”的基本要素的基本要素的基本要素的基本要素的基本要素的基本要素的基本要素的效果“是为了指导非临床研究的设计和执行。非临床计划与每种疫苗的临床开发计划相结合，以支持对物种的免疫反应的比较，并能够选择适当的人剂量。

研究下面描述的动物在被认可的设施分配研究主管的监督和主治兽医下根据从学院和美国国防部批准的动物方案进行并完成。Every effort was made to minimize the suffering and distress of animals exposed to challenge agents or subjected to procedures, using approved anesthetics (1 to 6 mg/kg Telazol for macaques and isoflurane for mice). Biostatisticians were consulted in the study design phase to ensure the study used the proper number of animals needed to achieve interpretable data. Animals were observed multiple times per day for signs of clinical illness during the in-life phase. Macaques were anesthetized and humanely euthanized with an overdose of a euthanasia agent containing pentobarbital when meeting preapproved euthanasia criteria such as decreased body temperature to <93.0°F, >20% loss of body weight from prechallenge weight, respiratory distress/failure, significant reduction in activity (e.g., unable to right itself, complete lack of activity, persistent prostration, or total paralysis), or signs of pneumonia. Mice were euthanized using CO₂在麻醉动物后，通过腹膜内或直接注入腹膜内或直接进入心脏的巴比妥酸盐过量而使毒性和豚鼠安乐死。

使用的研究材料和导频大量由USAMRIID进行验证的概念研究证明RBV A / B和rF1V疫苗的免疫原性和功效在各种动物模型的，包括啮齿动物和NHP中。为RBV A / B和rF1V非临床发展计划继续在阶段测试：执行初始毒性研究，以支持临床开发（2）（3）（1），显影和表征气溶胶攻击模型中，识别接种方案诱导免疫应答类似（4），这表明在动物模型中的功效，和（5）进行最终枢转接种/气雾攻击和生殖毒性研究在临床志愿者中观察到的反应，。

良好的实验室行为─（GLP-）标准的非临床安全性研究，以支持RBV A / B和rF1V疫苗的临床试验。在小鼠和家兔疫苗的完整人类剂量给药的局部反应的重复剂量给药，这些评估一般毒性。用于RBV A / B疫苗进行额外的研究以评价神经行为毒性。疫苗制备在注射部位没有明显的全身性毒性和只有轻微的炎症。的RBV A / B疫苗生产没有明显的神经行为毒性。这些非临床研究协力支持临床试验第一阶段的开始。

开发动物模型的一个重要方面是对具有良好特征的激发剂的要求。在非临床疗效研究中使用的挑战剂被疾控中心列为A类选择剂，所有拥有或转让挑战剂的美国设施必须在疾控中心和/或美国农业部注册。对BoNT/A1和BoNT/B1进行了完全表征，以确认其身份、纯度和强度(生物活性或效力)。蛋白浓度和生物活性(在MIPLD方面₅₀单位)的两个bont分别通过微bradford蛋白测定和小鼠(毒素)效价测定得到验证。建立了检测方案来监测瓶装bont的实时和加速稳定性。稳定性计划包括年度测试，以确定维持强度和纯度，使用微量bradford蛋白测定，小鼠(毒素)效价测定，SDS-PAGE和大小排除色谱。

该rF1V挑战研究使用的CO92或C12株Y. Pestis.．为了确保这些菌株的质量和完整性，挑战材料在一个三层的银行系统中生长、特征和存储。这些库的特征如下:(1)选择性培养基纯度，(2)滴度，(3)表型，(4)革兰氏染色，(5)聚合酶链反应(PCR)的质粒和染色体标记(致病性岛)，(6)硝酸盐还原，(7)抗生素敏感性，(8)生长曲线，和(9)甘油发酵。

动物规则的第一个要求涉及理解毒性的病理生理机制和说明该病理是类似于人类。这是一个显著的挑战，尤其是当有可用于人类疾病（例如，吸入肉毒杆菌）的资料很少。通常有两种动物物种的研究为此需要，除非病以及其特征在于一个动物物种，是人类疾病的接受的模型。对于RBV A / B和rF1V疫苗开发计划，啮齿动物和NHP模型，制定出评价以下BoNT中的吸入暴露与疾病的病理生理学Y. Pestis.．疾病什么是人类已知的动物标志的对比呈现于表2和3.．

BoNT/A1和BoNT/B1的致死率在CD-1小鼠和豚鼠（未发表）以及最近在恒河猴中进行了测定[14］．使用甲阶段式方法来估计吸入半数致死量（LD₅₀）和暴露浓度（LCT₅₀）.评估了每个物种对气溶胶暴露的病理生理反应，以确定疗效研究的相关终点。在小鼠和恒河猴中最相关的病理生理反应是死亡和发展肉毒中毒的临床症状。所有物种的临床观察均与已知的人类肉毒杆菌病进展模式一致(见表)2）.关于致命性和每种物种中临床症状的发病和持续时间观察到显着的剂量反应。在小鼠或恒河猴中没有观察到临床血液学和化学和化学以及总病理学的显着变化。在恒河猴中通过遥测测量的生理参数的变化也与死亡率不相关。

通过诱导病理Y. Pestis.CO92在动物通过临床化学，血液学，遥测猕猴（CMS）只，详细的组织病理学瑞士韦伯斯特小鼠和CMS中评价。暴露的动物表现出多叶肺炎，巨噬细胞和淋巴组织，发烧，败血症和死亡的细菌渗透。从估计LD小鼠模型的开发研究收集的数据₅₀CO92为约2,000个菌落形成单位（CFU）。

在CMS，如通过体积描记法测定的吸入剂量，使用的总累计潮气量计算[15]. 劳工处₅₀was estimated to be 24 cfu by Probit analysis. Telemetry provided useful information on the clinical course of disease not captured by clinical observations. A rise in temperature routinely coincided with the loss of diurnal rhythm, while increased heart and respiration rate followed by inactivity strongly correlated with a lethal outcome. All CMs withY. Pestis.血液培养阳性的人死于肺鼠疫。所有CMs的肺病理与在人肺鼠疫中观察到的病理一致。表中对不同物种的重要发现进行了比较3.．

5.3。鉴定疫苗接种方案和动物模型疗效的示范

《动物规则》的第二项要求涉及证明动物和人类对反措施的反应是相似的。第三个要求是在动物身上证明预期在接种疫苗的人身上达到的终点。对于rBV A/B和rF1V疫苗，终点是生存。

的RBV A / B方案接种用相同的材​​料NHP中在临床试验中施用于健康的成年人和随后用于人的疫苗接种时间表。一个简短的时间表被用于小鼠。中和到的BoNT / A1和BoNT / B1在CD-1小鼠和猕猴抗体应答跨各种疫苗剂量进行评价和比较在临床试验的志愿者中观察到的中和抗体应答。剂量诱导相似的抗体水平，确定了动物模型，并使用3期临床材料举足轻重的动物研究中使用。

在猕猴初步疗效研究使用所确定的接种方案论证从气溶胶攻击保护。在人类引起的抗体水平的保护效力使用被动转移研究评估。豚鼠被动转移模型的开发和用于从人类RBV A / B疫苗接种证明纯化的免疫球蛋白的保护效力[17］．

rF1V项目使用了类似的方法。在CMs和小鼠中的疫苗剂量滴定研究正在进行中，使用2b期临床试验中使用的材料来评估免疫反应和疗效。第一个目标是评估五种疫苗剂量的生存情况，以选择后续研究中使用的疫苗剂量。第二个目标是收集所有组动物的血清，用于被动转移研究的评估，并在桥酶联免疫吸附试验(Bridge ELISA)中确定抗体滴度(下文详细描述)。后续研究的目的是确定疫苗的最小保护剂量，并估计在接种rf1v的动物中与气溶胶暴露有关的最低抗体水平Y. Pestis.CO92。

鼠标被动转移模型来评估免疫血清从气溶胶挑战提供保护的能力。从CMS或具有rF1V接种人类志愿者的血清在模型中测试，结果描述18］．CMs存活率和抗体水平之间的明确相关性仍有待确定。

以满足动物规范要求采取的方法总结在表4用于RBV A / B和rF1V疫苗和在下面更详细描述。简言之，将正在使用的动物模型中具有类似疾病特征的那些暴露的人中观察到，以评估由疫苗诱导的免疫应答和功效。进展到日期的具体要求的状态如表所示4．设计和进行关键GLP非临床疗效研究统计分析计划将需要做好准备，并与FDA讨论。这些研究的目标是生成数据支持动物规则要求证明疗效及可能推断的剂量以产生在人类临床益处。这些研究将使用3期临床试验材料，性和生殖毒性会被同时评估。

5.4。临床试验和人类安全

rBV A/B和rF1V候选疫苗已(或正在)在第一阶段和第二阶段临床试验中进行测试。所有临床试验都由一个由独立专家组成的科学价值审查委员会进行评估，并由一个独立的调查审查委员会和美国陆军人类研究保护办公室批准。这些研究由一个签约的临床研究组织管理。安全性由独立医生持续监测，并由数据安全监测委员会(DSMB)监督。所有研究均按照适用的美国联邦法规(21 CFR Parts 50、56和312)和ICH指南的要求进行。

在签署知情同意书后，招募并评估了男性和女性志愿者。受试者必须健康，通过标准筛查评估确定，包括病史，体检和实验室测试（血液学，化学品和尿液分析）。对于RBV A / B试验，排除了具有神经障碍史，免疫疾病或用肉毒杆菌毒素的治疗的受试者。在研究中，疫苗的试验中，具有免疫抑制药物的使用历史，包括糖皮质激素和最近的疫苗接种。研究疫苗在三角肌中以0.5ml IM注射施用。

安全监控通过交互式语音应答系统包括注射部位和全身反应原性数据在志愿者日记收集的接种后，在预定的治疗出现的不良事件（TEAE的）评估和特别指定如果需要，在整个研究中访问。注射部位反应（局部反应）被定义为疼痛，柔软，瘙痒，红肿/红斑，其他皮疹和肿胀或硬结。预先发现的全身反应包括发烧，疲劳，肌痛，头痛，恶心，呕吐和腹泻。还将记录和评估任何其他系统器官表现为不良事件（AE）。AES的分级是通过研究的特定于预防性疫苗临床试验中最新的毒性分级的最新FDA准则进行的。据报告，任何异常的实验室价值，异常的生命体征或异常的物理发现被认为是临床上的临床意义或达到毒性的分级标准，均为AE。

5.5。临床试验用于RBV A / B

的RBV A / B疫苗在两个成年人（18-45岁）第1阶段进行评价（RBV A / B-01和RBV A / B-01B）和一个第2阶段（RBV A / B-02）的临床试验（未公布）。收集血液以确定NAC到的BoNT / A1和BoNT /使用MNA在研究期间和血清转化率的计算预先确定的时间间隔B1。还收集了用于评估动物疗效的被动转移研究的血液。

第一项试验，rBV A/B-01，是一项单中心、开放标签、剂量递增的研究，旨在评估两剂方案(第0天和28天)的安全性、耐受性和免疫原性μ.克，20 μ.g，40 μ.与佐剂g总免疫蛋白），并且在40中的佐剂仅抗原制剂 μ.G总免疫蛋白。44名志愿者参与了这项研究，4个治疗组各11人。第二项研究，rBV A/B-01B，是一项后续研究，评估两种剂量(40μ.g和100m μ.使用四种不同的三剂量方案（第0天，28个，56，第0天，28个，112或第0天，28，182，或第0天，56，182）g总免疫蛋白）。在1B期研究第三疫苗剂量的增加，预计增加免疫反应的大小和持续时间。八十志愿者参加了这项研究中（每次接种队列10名志愿者，每剂量组40名志愿者）。剂量提升到更高的剂量在两项研究中的所有安全性数据的DSMB审查后发生。

大多数志愿者的经历至少一次TEAE，大部分不良事件为轻度强度和自限在两个临床试验第一阶段至中度。在TEAE的约30％被认为与接种疫苗有关，而这些通常包括注射部位反应，疼痛为最普遍。瘙痒，红斑，肿胀报道更频繁。最常见的相关的全身反应包括头痛，腹泻，全身乏力。在实验室测试结果零星异常，最常见的血红蛋白的变化，大多数志愿者接种疫苗后的报道，但并没有考虑临床显著，以及内或跨有从基线通过各研究（末次疫苗接种后6个月）的末尾没有显着的变化同伙。没有严重不良事件（SAE）。的TEAE的总发病率和给药部位反应发生率中相比，只有在RBV A / B-01研究中接受抗原群组接受RBV A / B疫苗群组较高。没有明显的剂量关系被视为跨越接受在任一研究佐剂RBV A / B组群。

在RBV A / B-01试验中，志愿者的至少80％与所述两个最高剂量接种（20 μ.g和40μ.GV A / B的GOT总免疫蛋白质在抗BONT / A1和抗BONT / B1抗体的定量下限上方发出的持续NAC。仅抗原制剂不是免疫原性的。在RBV A / B-01B试验中，施用40个剂量 μ.g或100 μ.RBV A的克/ B疫苗引发中和抗体两者的BoNT / A1和BoNT / B1在所有的志愿者的可检测水平。再接种程序（在182天给予第三次接种疫苗）引起更大的NAC比（在第56天或112天给予第三次接种疫苗）更短的时间表。基于最大NAC和抗体动力学，第0天，28的疫苗接种计划，和182引起的最高水平的NAC，并有剂量之间没有显著差异。

的RBV A / B-02 2期试验是一项多中心，双盲，随机化的研究，旨在评估的安全性，耐受性，和三剂量方案的免疫原性的（0天，28，182和第0天，56，182）RBV A / B在40单剂量给定 μ.G总免疫蛋白与生理盐水安慰剂比较。在这项研究中有440名志愿者被分配到2个队列，165名受试者分别接受rBV A/B和2个队列，55名受试者分别接受生理盐水。受试者在最后一次接种疫苗后随访至12个月。对最后一次疫苗接种后4周的中期数据进行分析;最终的数据分析尚未完成。

几乎所有志愿者都经历了至少一个AE，在疫苗治疗和安慰剂治疗的志愿者中具有大致相同的数量。大多数AES强度轻微或中度温和，治疗队列中茶叶的总体发病率没有差异。由于疫苗（过敏性皮炎，红斑和肿胀，所有在注射部位）的AES，已经停止了三个受试者。没有与研究疫苗有关的Saes。与RBV A / B治疗的更多志愿者报告的注射部位反应与安慰剂治疗的人相比，最常见的痛苦，痛苦，肿胀，红斑，瘙痒和腋窝疼痛。最常见的全身反应是头痛，肌痛，关节痛，感觉异常，发热，焦虑，不适和恶心。然而，大多数茶叶在正常范围之外的实验室值被称为每种协议的AES。这些发生在约96％的受试者中，治疗RBV A / B或安慰剂。最常见的实验室AES是血红蛋白从基线减少或从基线增加，治疗队列之间没有显着差异。大多数实验室相关的茶被认为是轻度或中等的严重程度，而不是临床上显着并解决而没有治疗。

抗BoNT/A1和抗BoNT/B1的中和抗体率在最后一次疫苗剂量后的第210天和第28天观察到最高，两种疫苗接种计划的中和抗体率相似。最终数据将评估最后一次疫苗接种后一年的免疫反应。

5.6。对于rF1V临床试验

在一个相1（RF1V-01）和一个相2（RF1V-02A）临床试验中评价RF1V疫苗。第二阶段2（RF1V-02B）临床试验正在进行中。在RF1V-01审判中，男女志愿者，在RF1V-01审判中的18至40岁，在签署知情同意书后招募并评估和评估资格。如RBV A / B所述进行，监测，监测和审查这些研究。通过在研究期间通过桥ELISA测量对RF1，RV和RF1V的抗体的浓度来评估对疫苗的免疫应答，并在研究期间的预定间隔和血清转换率的计算。还收集了用于评估动物疗效的被动转移研究的血液。

第一项试验，rF1V-01，是一项单中心、开放标签、剂量递增的研究，旨在评估两剂方案(第0天和28天)的安全性、耐受性和免疫原性μ.克，40 μ.克,80μ.g，160 μ.G总免疫蛋白)。44名受试者参与了这项研究，每组11人。在免疫原性数据分析的基础上，一项扩展研究评估了第三次剂量160的效果μ.克施用有关谁曾接受相同剂量的疫苗8 11受试者的第一次剂量后230天。所有志愿者随访最后一次疫苗接种后180天。

所有的志愿者经历至少一次TEAE，大部分要么轻度或中度强度。注射部位反应是最常见的相关的TEAE和一般轻微或中度，在两个最高剂量两种或三种疫苗接种后更加频繁。最常见的注射反应是疼痛，肿胀，和红斑。全身反应被认为与接种疫苗有关为头痛，乏力，恶心和腹泻。大多数这些反应也是轻度或中度并且不认为临床显著。目前还没有临床显著或相关实验室变化。津贴对于不同长度的疫苗接种之间的时间后，没有明显的增加的TEAE的频率的第二或第三接种后相比于第一次疫苗接种。串行心电图是前两个剂量的所有同伙后记录，并没有观察到临床显著异常。

该rF1V疫苗具有免疫原性两种剂量的20后 μ.克，40 μ.克,80μ.克，或160 μ.g疫苗。在接受三剂160的志愿者中，抗体反应显著增加 μ.克疫苗的，与两个160之后它们的响应 μ.g剂量。三种抗体(抗rf1、抗rv和抗rf1v)的GMCs均在第三次注射后14天达到峰值。第三次注射也增加了对所有三种抗原检测出抗体的比率。根据这项研究，两种最高剂量(80μ.克和160 μ.选择G）在三剂量方案中的第2A期研究中选择评估。

rF1V-02a 2期试验是一项多中心、双盲研究，旨在评估三剂量方案(第0、28、182天和第0、56、182天)的安全性、耐受性和免疫原性μ.克和160 μ.g总免疫蛋白）。研究中有400名受试者（每个队列100名）。接种疫苗的受试者在最后一次接种疫苗后随访12个月。

所有受试者经历至少一次TEAE，并没有统计，观察各组总发病率显著差异。共因为注射部位反应的停止引起的TEAE，二6名志愿者。大部分TEAE为轻度或中度强度。没有与研究疫苗有关的Saes。大多数志愿者有这样的内下列接种28天发生的TEAE，而这些主要是注射部位反应。大多数这些反应是轻度或中度强度，最常见的是疼痛，肿胀，红斑和瘙痒。最常见的相关的全身反应表现为头痛，全身乏力，恶心和腹泻。大多数这些反应也为轻度或中度。报告为AE的最常见的实验室异常升高血糖，蛋白存在于尿中和血红蛋白下降。这些的TEAE被零星的，不与其他临床异常相关，且无治疗解决。 In general, no clinically meaningful trends were noted in changes to laboratory parameters in any vaccination group, dosage, or schedule. Overall, the 80 μ.摹用量有一个稍微好一点的安全性和耐受性比160的个人资料 μ.第0、56和182天剂量组的安全性和耐受性略优于第0、28和182天剂量组。此外，在接种后续疫苗后的28天内，地方或一般teae发生率似乎没有增加。

免疫原性数据表明，在第三次疫苗接种后，抗RF1，抗RV和抗RF1V抗体的GMCs比第二次疫苗接种后高得多，并且几乎所有受试者在最后一次接种后7至14天有血清转换的证据。在接种疫苗接种后，在选定的剂量和调度方面是难以区分的血清转化率。在第0,56和182天的时间表中接受疫苗接种的两组显示出较高的抗RF1，抗RF1，抗RF1V GMC和血管转换率为7第二次疫苗接种后的几天，预期3评估比在0,28和182日附表上接受疫苗的群体进行评估。根据本研究的结果，80 μ.g剂量和第0,56,182天疫苗接种计划被选择用于2b期临床试验的进一步试验。此外，在2b期临床试验中，正在评估更短的疫苗接种计划，以评估是否通过更早接种第三次疫苗而实现同等免疫原性。

在已完成的人体试验中，rF1V疫苗在所用剂量和时间表上安全且耐受性良好，并引发对疫苗重组抗原（rF1V）及其每种成分（rF1和rV）的免疫反应。

6.建立动物反应桥梁以预测人类疗效的计划

其中一个根据FDA动物规则许可的疫苗的最困难的挑战是缩小动物和人类的免疫反应，表明在动物实验中产生的定性和/或定量的免疫反应有关的那些人类观察到的，并且可以使用预测临床益处，并建立有效剂量。这要求用作保护的桥梁动物和临床数据的相关关系的验证试验（或多个）。与此相关的挑战变得显著如果免疫的机制（S）不能很好地理解，如对于鼠疫的情况。

6．1.各类单体A / B计划

在动物身上证明了BoNT特异性抗体的保护能力[19- - - - - -23］．很多基础阐明性中和抗体的保护性免疫的相关成分被Iakovlev在20世纪50年代进行的，谁证明提供给小鼠和豚鼠被动免疫足以保护这些动物的血清型特异性的BoNT [吸入的挑战24］．基于Charlella方法，在小鼠（毒素）中和抗体测定法（MNA）中评估血清中的骚动A / B NAC [25］．NAC通常被认为是免受暴露于骚乱的衡量标准。

人类研究的数据结果表明，RBV A / B疫苗是安全的，耐受性良好，免疫原性和。反性BoNT顾问委员会观察到保护动物会相比，在接种疫苗的人观察到的顾问委员会在人类（桥接）预测临床益处。如上所述，基于其诱导类似于在临床上获得的那些顾问委员会能力选择动物疫苗的剂量，并且这些疫苗剂量和方案将被用于在枢转研究，以评估功效。设计为代表观察到的人类反应的被动转移的研究将展示RBV A / B疫苗提供保护人类和桥接的临床和非临床信息的能力的重要手段。

6.2。rF1V计划

相比之下，目前还没有一种可接受的检测方法与保护Y. Pestis.．动物从肺鼠疫在与接种疫苗保护Y. Pestis.F1和V抗原[26，27］．F1 is a 17 kDa protein that forms a capsule and may interfere with complement-mediated opsonisation [26，28］．这37 kDa V virulence factor is a component of the Type 3 secretion system known as the “Yop virulon.” The Yop virulon induces apoptosis in host phagocytes through the injection of effector proteins from the bacterial cell. The V antigen is secreted in response to environmental stimuli and is critical for virulence [27，29]独立并作为其在促进烨效应易位作用的结果。

在F1和V抗原在小鼠中诱导，NHP中体液和细胞介导的免疫应答，和人类[7，13，30- - - - - -38]. 通过将F1特异性单克隆抗体被动转移到小鼠身上，证明了体液反应有助于预防淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的能力。同样，V-特异性抗体保护小鼠免受F1+和F1-毒株的气溶胶攻击Y. Pestis.[39，40］．最近，针对rF1、rV或rF1V的多克隆和单克隆抗体保护naïve小鼠免受皮下、鼻内和气溶胶暴露鼠疫菌，[41，42]提供抗体保护作用的额外证据。

很少有人知道有关的细胞介导的免疫反应瘟疫提供保护作用。细胞因子由T细胞分泌，包括IFN-γ.肿瘤坏死因子-α.，被认为是激活吞噬细胞，限制细胞内Y. Pestis.复制和促进细胞内杆菌的杀灭正在研究中[37]. 此外，这些细胞因子似乎有助于体液反应的保护，因为在接受亚最佳剂量F1或V特异性抗体的小鼠中，这些细胞因子的中和显著降低了这些小鼠的存活率[38］．阻断细胞因子活性与细胞因子特异性中和抗体通过呼吸途径的挑战主动或被动免疫的小鼠也妨碍了保护Y. Pestis.CO92 [43]. 白细胞介素-17在预防疾病中的作用Y. Pestis.也正在研究[44］．

弥合rF1V免疫应答的预测临床益处，因此，更具挑战性。由于体液响应已知参与从保护Y. Pestis.几种基于抗体的测定被认为支持桥接。这些包括一个桥ELISA（图3.），抗体的被动转移，和巨噬细胞的细胞毒性测定法。

6.3。大桥ELISA

桥的ELISA使用RF1，Rv和rF1V抗原来评估的体液免疫应答，以rF1V接种，使用单一的标准曲线，其允许跨越临床和非临床样品直接比较。该测定法是基于反应性抗体在涂覆有他-F1，他-V，或他的-F1V抗原免疫使用血清平板上捕获。结合的抗体是通过将随后稀释的辣根生物素化的抗原（RF1，RV，或rF1V）过氧化物酶缀合的链霉抗溶液和四甲基联苯胺底物检测。甲鸡IgY标准曲线来定量抗体的水平RF1，Rv和rF1V待检血清英寸桥ELISA用于rF1V的表示在图呈现3.，相同的格式用于rF1和rV分析。

Bridge ELISA相对于标准直接ELISA的关键优势是，相同的试剂在不同的检测中使用，具有物种中性的能力。物种中性的优点是避免了物种特异性二次试剂引入的偏置。桥酶联免疫吸附试验的一个局限性是，它不是一种评估免疫血清中保护性抗体的功能试验，而是测量任何能够结合抗原的抗体，而不管其保护能力如何。

在桥ELISA中测量的滴度统计评估与小鼠和CMS中的直接攻击性研究的生存数据相关。获得迄今为止的数据表明与生存期相关的持续趋势，但是需要额外研究的数据来完全评估该测定作为相关性的效用。类似地，将需要来自相2B试验的免疫原性数据，以根据动物滴度和功效分析人类反应。

6.4. 被动迁移研究

被动转移的研究评估抗体F1和V.鼠标被动转移系统以前用来支持在1941年决定接种军事人员在暴露于与被杀鼠疫杆菌鼠疫的严重威胁的综合防护能力。鼠标被动转移的读出评估都死亡百分率和死亡时间为比值称为鼠标保护指数（MPI）。根据动物实验数据，MPI值被采纳为一个可靠的指标，在​​非临床鼠疫疫苗有效性的研究和确定何时在人类[被要求进行加强接种成活率预测45，46］．

被动传输系统涉及免疫血清的管理从接种疫苗的动物或人类Y. Pestis.天真的老鼠。根据已完成的药代动力学研究，当血清滴度达到稳定水平时，小鼠暴露于气溶胶刺激。完整的cm -小鼠被动转移试验结果表明体液免疫和肺鼠疫保护之间的关联。生存分析结果显示抗体水平与生存有关，尽管小鼠或供体血清中循环抗体(抗rf1、抗rv或抗rf1v)的特定水平尚未被定义为提供特定水平的保护。免疫血清组小鼠的平均生存时间大于对照组小鼠的中位生存时间。在小鼠和CMs的直接气溶胶挑战研究中，接受试验小鼠的生存、死亡时间和MPI与生存的相关性正在进行统计评估。来自临床试验的人血清也正在桥式酶联免疫吸附试验(Bridge ELISA)和被动转移系统中进行统计测试和评估，以连接到动物数据。

6.5。巨噬细胞毒性检测

Y. Pestis.和其他致病菌种的yersinia.是细胞毒性的用于巨噬细胞和抗由巨噬细胞培养的吞噬作用，但细胞毒性和电阻可以通过抗-V抗体中和．几种以巨噬细胞为基础的免疫试验Y. Pestis.据报道(47- - - - - -51］．

Y. Pestis.诱导通过胱天蛋白酶-3依赖性凋亡途径的巨噬细胞的细胞死亡。正在积极调查一个测试检查免疫血清从rF1V接种个体中和能力鼠疫的- - - - - -通过测量胱天蛋白酶-3的水平降低引起的巨噬细胞的细胞毒性。关键测定组分包括小鼠巨噬细胞样细胞系，J774A.1，y伪（Y. PTB ），其中内源V基因已经被替换为从V基因Y. Pestis.从免疫的个体的血清样品，并且EnzChek试剂的caspase-3 II试剂盒。所述试剂盒使用微量滴定荧光测定和capsase -3-特异性底物，Z-DEVD-R110，这是由活性胱天蛋白酶3切割以释放高荧光R110。该测试被评价其作为潜在的相关成分测定可行性。

首先评估接种V或rF1V的兔子血清，以验证免疫血清中和巨噬细胞细胞毒性的能力，并定量检测血清细胞毒性中和活性的差异。如前所述，在USAMRIID进行细胞毒性试验[48]，以及血清中和值（NT₅₀)确定。NT₅₀数值与血清稀释的倒数相对应，导致caspase-3水平下降50%。通过回归分析，双滴定法观察到良好的剂量反应，兔抗血清产生NT₅₀值范围从157至1384;有血清抗RV ELISA滴度和NT之间没有相关性₅₀值((48]，数据未显示）。RF1V接种疫苗小鼠，猕猴和人志愿者血清巨噬细胞测定的初步评价结果非常暗示动物或被动小鼠转移模型的保护。

6.6。RBV A / B和RF1V开发工作的挑战

在关键的非临床研究，并且将是继一致性大量的制造中进行的3期临床试验必须由动物规则来满足执照FDA的要求等显著风险。最显著技术挑战有待克服之前这些关键性的研究是成功的制造在商业规模上，过程和测定法的验证，以及识别合适的装置用于预测临床益处为rF1V。除了执照的要求，在先进的开发项目产生的数据需要满足美国国防部的性能要求。

7.摘要

在国家的战士和平民的保护是美国的防御至关重要。其中所面临的作战人员和平民的威胁是攻击使用旨在要么杀死或重伤的生物制剂。针对肉毒杆菌神经毒素和肺鼠疫疫苗先进的开发力度以及朝向申请FDA执照之前实现需要提前举足轻重的测试性能和效能目标的方式。

致谢

在RBV A / B和rF1V这些先进的开发工作是由化学生物医疗系统，联合疫苗采办项目（CBMS-JVAP）资助，美国国防部（DoD）的合同DAMD 17-98-C-8024。（ - S. Welkos USAMRIID）和由巨噬细胞的细胞毒性研究的初步发展是由医用生物防御研究计划，美国陆军医学研究和装备司令部，项目5.10047-05-RDB和1.1A0008-08_RDB部分支持间协议没有。A151工作计划A.18 USAMRIID和CBMS-JVAP之间。该anthors感谢RBV A / B和rF1V团队成员为编写本文援助。DVC承认并感谢参与开发制造，试验，非临床众多的分包商和临床研究。

意见，解释，结论和建议是那些作者的，并不反映官方政策或军队，国防部或美国政府部门的位置。

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