肉毒杆菌主义是由细菌产生的神经毒素引起的 肉毒梭状芽胞杆菌（ 肉毒梭菌)，疾病以不同形式出现，包括婴儿、伤口、成人定植和食源性肉毒杆菌中毒[ 1］．临床表现为胆碱能抑制，特征性征象包括下降肌无力、口干、吞咽困难、言语模糊、视力重影或模糊、眼睑下垂。肉毒杆菌神经毒素(BoNT)最终导致呼吸肌肉瘫痪，从而阻止无辅助呼吸，并在短时间内导致死亡。暴露于雾化BoNT会导致另一种形式的疾病，称为吸入型肉毒中毒，其症状类似[ 2］．目前，吸入中毒后人类死亡率的唯一参考点是基于DoD建模和非人类灵长类动物(NHP)研究的推断(均基于BoNT质量/70公斤体重)和食源性肉毒中毒病例中BoNT的血液水平。肌肉内(IM)接触BoNT血清型A对人的致死率估计在0.09至0.15之间 μG / 70公斤体重和0.7至0.9  μg/ 70 kg bodyweight by inhalation based on extrapolation from NHP studies [ 2那 3.］．目前还没有关于BoNT血清B型对人类致死率的已发表的估计。肉毒中毒患者血清中BoNT水平通常低于10只小鼠腹腔内致死剂量的50% (MIPLD)_50.）/ mL的[ 2］．

美国肉毒杆菌病例的治疗通常包括施用马抗毒素抗血清和支持性护理。马抗毒素包括持牌二价和一价抗毒素，其含有针对逆型A / B和E的中和抗体，以及研究的七丙酮（ABCDEFG）抗毒素。通过CDC-Suponsored IND协议获得七卤化肉杆菌抗毒素（HBAT，Cangene Corporation）。在2010年3月的二价和单价产品到期后，HBAT成为美国唯一可用的肉毒杆菌抗毒素，用于天然存在的非敏感性肉毒杆菌。婴儿肉毒中毒的病例都与这是从与5价（ABCDE）类毒素疫苗免疫人供体的血液的最近许可BabyBIG处理。在暴露于致命挑战的NHPS中，治疗仅在曝光18至36小时内施用时才有效。

鼠疫是一种人畜共患病 Y鼠疫当人类被感染的跳蚤咬伤时，通常从啮齿动物传播给人类。该疾病有三种表现，跳蚤咬伤通常引起发泡形式，其中发生排水淋巴结的痛苦肿胀（腹部）[ 4.那 5.］．如果不及时治疗，感染将导致大约一半的病例败血症和死亡。Bubo的形成并不存在于直接导致败血症的第二种疾病中，约有三分之一的病例会出现这种情况。腺鼠疫和败血症感染偶尔进展为继发性肺炎感染。感染 Y鼠疫也很少通过吸入微生物发生，在1至6天后，该病表现为肺炎，除非患者在症状出现20小时内接受抗生素治疗，否则几乎都是致命的[ 6.]，并通过在咳嗽期间形成的呼吸液滴来分布于人的人[ 7.- 11.］．临床迹象包括咳嗽和呼吸困难发烧，可能有血腥的水性痰液。也可能存在恶心，呕吐，腹痛和腹泻。

除了用抗生素对鼠疫进行早期诊断和治疗(这对生存至关重要)外，美国没有获得许可的鼠疫疫苗。杀鼠疫全细胞疫苗(福尔马林灭活)的生产 Y鼠疫），以前许可的 鼠疫疫苗美国药典，被中断了在1999年而且，疫苗不能有效防止对主肺鼠疫。

rBV A/B和rF1V疫苗最初是在美国医学和免疫研究所开发的，并在图中灰色箭头所示的阶段转入高级开发阶段 2。黑色箭头指示的制造发展为每个产品的阶段。该产品成功克服了给提前以下挑战该制造阶段：（1）技术转让合同生产组织和流程的重新设计，由于设备的变化，（2）的支持生产临床试验材料和罐的制造方法开发进行验证，以（4）显影所需的试剂和用于产品定量，纯度分析方法或者增加所需要的部队等效剂量或不可伸缩的工艺步骤的数量，和过程杂质，和（5相关联的（3）按比例放大问题）确定条件在整个制造过程的支持产品的稳定性。

这 Pichia Pastoris.用于产生RBV A / B疫苗的抗原A和抗原B表达菌株的母细胞和工作细胞库是通过扩大为每种抗原制备的加入细胞库来产生，并根据FDA和国际会议表征纯度，身份和适用性论协调（ICH）指导。抗原A和抗原B分别制造并吸附到Alhydrogel上，然后组合形成最终配制的散装疫苗。制造过程处于商业规模（抗原A和600L用于抗原B的100L）。目前的良好制造实践（CGMP）填充/结束活动在5,000个小瓶中进行，以支持1B期和第2期临床试验。目前，配制的FDP制造过程正在扩大到全部商业规模（约300,000瓶/批次）。

融合rF1V蛋白由F1荚膜蛋白和V毒力蛋白组成 Y鼠疫是生产的 大肠杆菌并用佐剂Alhydrogel配制。编码RF1V抗原的序列衍生自USAMRIID中产生的质粒PPW731 [ 13.]，最初由pT5.F1V表达。1cell banks but later transitioned to expression from pPW731 cell banks due to intellectual property constraints. Both expression systems use the same regulatory elements for gene expression and the same antibiotic resistance gene for plasmid maintenance. The cell banks were characterized for purity, identity, and suitability according to the FDA and ICH guidance. The manufacturing process was scaled to a final commercial process, which is 1,500 L (working volume for fermentation) and 500 L purification scale.

每种疫苗的临床批次被制造并释放用于完成的阶段1和正在进行的第2阶段试验，如下所述。稳定性计划正在进行中，旨在建立，维护和执行符合FDA和ICH指导的测试策略。

动物模型对于FDA的动物规则许可至关重要，因为它们用于评估疫苗的有效性，并将疫苗诱导的动物免疫反应与人类免疫反应进行比较，以预测临床效益。遵循2009年发布的“行业动物模型指导草案-根据动物规则处理功效的基本要素”，指导非临床研究的设计和执行。每一种疫苗的非临床计划都与临床开发计划相结合，以支持跨物种免疫反应的比较，并使选择适当的人体剂量成为可能。

以下所述的动物研究在指定的研究主管和主治兽医的监督下，在经认可的机构进行，并根据研究所和国防部批准的动物方案进行。使用经批准的麻醉剂（1-6），尽一切努力将暴露于激发剂或接受程序的动物的痛苦和痛苦降至最低 泰拉唑mg/kg用于猕猴，异氟醚用于小鼠）。在研究设计阶段咨询了生物统计学家，以确保研究使用了获得可解释数据所需的适当数量的动物。在生命期内，每天多次观察动物的临床疾病迹象。当猕猴达到预先批准的安乐死标准时，如体温降至<93.0°F，体重因激发前体重下降>20%，呼吸窘迫/衰竭，活动显著减少（例如。，无法自行康复、完全缺乏活动、持续性虚脱或完全瘫痪）或肺炎症状。用一氧化碳对小鼠实施安乐死₂在麻醉动物后，通过腹膜内或直接注入腹膜内或直接进入心脏的巴比妥酸盐过量而使毒性和豚鼠安乐死。

USAMRIID利用研究材料和试点批次进行的概念验证研究表明，rBV A/B和rF1V疫苗在各种动物模型(包括啮齿动物和NHPs)中具有免疫原性和有效性。rBV A/B和rF1V的非临床开发计划将继续分阶段进行测试:(1)进行初步毒性研究以支持临床开发，(2)开发和表征气溶胶激发模型，(3)确定疫苗接种方案，诱导免疫反应类似于临床志愿者的反应，(4)在动物模型中证明有效性，(5)进行最后的关键疫苗接种/气溶胶挑战和生殖毒性研究。

开展了符合良好实验室规范（GLP）的非临床安全性研究，以支持rBV A/B和rF1V疫苗的临床试验。这些研究评估了小鼠重复剂量给药后的一般毒性，以及在兔子体内给药全人类剂量疫苗的局部反应性。对rBV A/B疫苗进行了另一项神经行为毒性评估研究。这些疫苗没有明显的全身毒性，注射部位只有轻微的炎症。rBV A/B疫苗未产生明显的神经行为毒性。这些非临床研究共同支持了1期临床试验的启动。

开发动物模型的一个重要方面是良好的特点攻击剂的要求。在非临床疗效研究中使用的挑战剂是由疾病预防控制中心划分为A类选择代理，和所有美国的设施，拥有或转移攻击剂必须与CDC和/或美国农业部门登记。所述的BoNT / A1和BoNT / B1进行了充分表征以确认他们的身份，纯度和强度（生物活性或效力）。蛋白浓度和生物活性（在MIPLD方面_50.单位)的两个bont分别通过微bradford蛋白测定和小鼠(毒素)效价测定得到验证。建立了检测方案来监测瓶装bont的实时和加速稳定性。稳定性计划包括年度测试，以确定维持强度和纯度，使用微量bradford蛋白测定，小鼠(毒素)效价测定，SDS-PAGE和大小排除色谱。

RF1V挑战研究使用CO92或C12菌株 Y鼠疫。为了确保这些菌株的质量和完整性，挑战材料的生长，特征，并存储在三层银行系统中。群体的特征在于选择性培养基（1）纯度，（2）滴度，（3）表型，（4）革氏染色，（5）聚合酶链反应（PCR），用于质粒和染色体标记物（致病性岛），（6）硝酸盐还原，（7）抗生素敏感性，（8）生长曲线，和（9）甘油发酵。

动物规则的第一个要求涉及了解毒性的病理生理机制，并证明病理学与人类中的病理学相似。这是一项重大挑战，特别是当人类疾病的信息很少（例如，吸入肉毒杆菌中）。通常需要在两种动物物种中进行研究，除非该疾病在一种动物物种中具有很好的表征，并且是人类疾病的接受模型。对于RBV A / B和RF1V疫苗开发计划，开发了啮齿动物和NHP模型，以评估扰动扰动后的疾病病理生理学 Y鼠疫. 表中列出了动物疾病特征与人类已知疾病特征的比较 2和 3.。

在CD-1小鼠和豚鼠（未发表的）中测定Bont / A1和Bont / B1的致死性，最近在恒河猴中进行测定[ 14.］．阶段明智的方法用于估计吸入中位数致死剂量（LD_50.）和曝光浓度（LCT_50.）.气溶胶曝光的病理生理反应进行了评价每一个物种，以确定疗效研究相关的端点。在小鼠和猕猴最相关的病理生理反应是死亡率和肉毒杆菌的临床症状的发展。在所有物种中的临床观察与肉毒杆菌中毒疾病进展的人类已识别模式是一致的（表 2）.用关于杀伤力和发作和临床体征的持续时间在每个物种观察到显著剂量反应。在小鼠和恒河猴观察到临床血液学和化学和肉眼和显微镜病理学无显著变化。在生理参数遥测猕猴测量的变化也没有与死亡率相关。

由 Y鼠疫通过临床化学、血液学、遥测食蟹猕猴(CMs)以及瑞士韦伯斯特小鼠和CMs的详细组织病理学对动物CO92进行评估。暴露的动物表现为多叶性肺炎，巨噬细胞和淋巴组织的细菌浸润，发烧，败血症和死亡。从小鼠模型发展研究中收集的数据估计了LD_50.CO92为约2,000个菌落形成单位（CFU）。

在CMS中，使用单层描绘测量的总累积潮气量计算吸入剂量[ 15.］．LD._50.经Probit分析估计为24 cfu。遥测技术提供了临床观察无法捕捉到的有关疾病临床过程的有用信息。温度的升高通常与昼夜节律的丧失相一致，而心脏和呼吸频率的增加与缺乏活动密切相关。所有的CMs Y鼠疫血液培养阳性的人死于肺鼠疫。所有CMs的肺病理与在人肺鼠疫中观察到的病理一致。表中对不同物种的重要发现进行了比较 3.。

动物法则的第二个要求涉及到证明，认为该措施的反应是在动物和人类相似。第三个要求是要证明在动物同一端点中的预期给予疫苗人类。对于RBV A / B和rF1V疫苗，该端点是存活。

在临床试验中，rBV A/B计划使用与健康成人相同的材料为NHPs接种疫苗，并遵循用于人类的疫苗接种计划。对小鼠使用了一个简短的时间表。通过不同的疫苗剂量评估CD-1小鼠和恒河猴对BoNT/A1和BoNT/B1的中和抗体反应，并与临床试验志愿者观察到的中和抗体反应进行比较。两种动物模型中诱导相似抗体水平的剂量已确定，并将在关键的动物研究中使用3期临床材料。

在猕猴初步疗效研究使用所确定的接种方案论证从气溶胶攻击保护。在人类引起的抗体水平的保护效力使用被动转移研究评估。豚鼠被动转移模型的开发和用于从人类RBV A / B疫苗接种证明纯化的免疫球蛋白的保护效力[ 17.］．

rF1V项目使用了类似的方法。在CMs和小鼠中的疫苗剂量滴定研究正在进行中，使用2b期临床试验中使用的材料来评估免疫反应和疗效。第一个目标是评估五种疫苗剂量的生存情况，以选择后续研究中使用的疫苗剂量。第二个目标是收集所有组动物的血清，用于被动转移研究的评估，并在桥酶联免疫吸附试验(Bridge ELISA)中确定抗体滴度(下文详细描述)。后续研究的目的是确定疫苗的最小保护剂量，并估计在接种rf1v的动物中与气溶胶暴露有关的最低抗体水平 Y鼠疫CO92。

建立了小鼠被动转移模型，以评估免疫血清在气溶胶挑战中提供保护的能力。在模型中测试了CMs或接种rF1V的人类志愿者的血清，并描述了结果[ 18.］．CMS中存活与抗体水平之间的最终相关性仍有待确定。

表中总结了为满足《动物规则》要求所采取的方法 4.用于rBV A/B和rF1V疫苗，详情如下。简言之，目前正在使用与在暴露人群中观察到的疾病特征相似的动物模型来评估疫苗接种诱导的免疫反应和疗效。具体要求迄今为止的进度状态如表所示 4.. 关键GLP非临床疗效研究的设计和统计分析计划需要准备，并与FDA讨论。这些研究的目的是生成支持动物规则要求的数据，以证明疗效，并推断可能对人类产生临床益处的剂量。这些研究将使用第3阶段临床试验材料，同时评估生殖毒性。

RBV A / B和RF1V疫苗候选物（或正在是）在第1阶段和第2期临床试验中进行测试。所有临床试验都由由独立专家组成的科学优点审查委员会评估，并由独立调查审查委员会和美国陆军人类研究保护办公室批准。研究由合同的临床研究组织管理。安全由独立的医生持续监测，并由数据安全监测委员会（DSMB）监督。所有研究均按照当前的良好临床实践进行，根据适用的美国联邦法规（21 CFR部分50,56和312）和ICH指南。

男性和女性志愿者被招募并签署了知情同意书后评估的资格。受试者必须是健康的，如通过标准筛选评估确定，包括病史，体格检查和实验室检测（血液学，化学和尿分析）。对于RBV A / B试验中，神经系统疾病，免疫病症，或与A型肉毒毒素现有治疗史的受试者被排除在外。在两种疫苗试验中，使用免疫抑制药物，包括糖皮质激素和近期疫苗接种史的受试者被排除在研究。Study vaccine was administered as a 0.5 mL IM injection in the deltoid muscle.

安全性监测包括在接种疫苗后，通过交互式语音应答系统在志愿者日记中收集注射部位和系统反应性数据，以及在计划时间和计划时间评估治疗紧急不良事件（TEAE） 特别指定如果需要，在整个研究中访问。注射部位反应（局部反应）被定义为疼痛，柔软，瘙痒，红肿/红斑，其他皮疹和肿胀或硬结。预先发现的全身反应包括发烧，疲劳，肌痛，头痛，恶心，呕吐和腹泻。还将记录和评估任何其他系统器官表现为不良事件（AE）。AES的分级是通过研究的特定于预防性疫苗临床试验中最新的毒性分级的最新FDA准则进行的。据报告，任何异常的实验室价值，异常的生命体征或异常的物理发现被认为是临床上的临床意义或达到毒性的分级标准，均为AE。

RBV A / B疫苗在两相1（RBV A / B-01和RBV A / B-01b）中在成人（18-45岁）中评价，一期（RBV A / B-02）临床试验（未发表的）。收集血液以在研究期间以预先确定的间隔测定NAC至BONT / A1和BONT / B1，并计算血清转化率。还采集血液用于被动移植研究，以评估动物的疗效。

第一次试验RBV A / B-01是单中心，开放标签的剂量升级研究，旨在评估RBV A的双剂量方案（天0和28）的安全性，耐受性和免疫原性/ b以三种升序剂量（10  μg、 二十  μg, 40 μG与佐剂的总免疫蛋白质）和40的唯一抗原仅制剂  μG总免疫蛋白。44名志愿者参与了这项研究，4个治疗组各11人。第二项研究，rBV A/B-01B，是一项后续研究，评估两种剂量(40 μg和100  μG总免疫蛋白质）使用四种不同的三剂量调度（日0,28,56，天0,28,112或0,28,182或0,56,182）。预期在第1B期研究中添加第三疫苗剂量，从而增加免疫应答的水平和持续时间。八十名志愿者参加了这项研究（每名疫苗队队列10名志愿者，每剂量组40名志愿者）。在两项研究中的所有安全数据的DSMB审查后，会升级到较高剂量。

大多数志愿者至少经历了至少一个茶，大多数AES在第1期临床试验中的强度和自我限制。考虑约30％的茶被认为与疫苗接种有关，这些茶通常由注射部位反应组成，疼痛是最普遍的。瘙痒，红斑和肿胀均较不常见。最常见的相关系统性反应包括头痛，腹泻和不适。实验室测试结果中的散发性异常，大多数志愿者疫苗接种后，最常见的血红蛋白发生变化，但在大多数志愿者中均未被视为临床显着，并且通过每项研究结束（最后一次疫苗接种后6个月），基线没有显着的变化队列。没有严重的不良事件（Saes）。与仅在RBV A / B-01研究中接受抗原的群组相比，茶叶的总体发病率和给药部位反应的发生率较高，该队列接受RBV A / B疫苗。在任何一项研究中，跨越群组中没有看到明显的剂量关系，在任何一种研究中接受佐剂的RBV A / B。

在RBV A / B-01试验中，至少80％的志愿者用两种最高剂量接种（20  μ克和40  μ抗bont /A1和抗bont /B1抗体的定量下限持续高于NAC。只含抗原的配方不具有免疫原性。在rBV A/B-01B试验中，给予三剂40 μ克或100  μg的rBV A/B疫苗诱导所有志愿者的BoNT/A1和BoNT/B1中和抗体检测水平。较长的接种计划(第182天接种第三次疫苗)比较短的接种计划(第56天或第112天接种第三次疫苗)引发更大的NAC。根据最大NAC和抗体动力学，第0、28和182天接种计划诱导的NAC水平最高，剂量间无显著差异。

RBV A / B-02阶段2试验是一种多中心，盲，随机研究，旨在评估三剂量方案的安全性，耐受性和免疫原性（天0,28,182和0,56,182）RBV A / B以单一剂量为40  μg与盐水安慰剂相比的总免疫蛋白质。本研究中有440名志愿者分配给165个受试者的2个群组，每个群体接受任何接受盐水的55个受试者的RBV A / B和2个群组。在最后一次疫苗接种后，受试者最多需要12个月。在分析最后一次疫苗接种后4周的临时数据;最终数据分析尚未完成。

几乎所有志愿者都经历了至少一个AE，在疫苗治疗和安慰剂治疗的志愿者中具有大致相同的数量。大多数AES强度轻微或中度温和，治疗队列中茶叶的总体发病率没有差异。由于疫苗（过敏性皮炎，红斑和肿胀，所有在注射部位）的AES，已经停止了三个受试者。未发现与研究疫苗相关的SAEs。与RBV A / B治疗的更多志愿者报告的注射部位反应与安慰剂治疗的人相比，最常见的痛苦，痛苦，肿胀，红斑，瘙痒和腋窝疼痛。最常见的全身反应是头痛，肌痛，关节痛，感觉异常，发热，焦虑，不适和恶心。然而，大多数茶叶在正常范围之外的实验室值被称为每种协议的AES。这些发生在约96％的受试者中，治疗RBV A / B或安慰剂。最常见的实验室AES是血红蛋白从基线减少或从基线增加，治疗队列之间没有显着差异。大多数实验室相关的茶被认为是轻度或中等的严重程度，而不是临床上显着并解决而没有治疗。

抗bont /A1和抗bont /B1的中和抗体率均在末次疫苗接种后210 d和28 d达到最高，且两种接种计划的中和抗体率相似。最终数据将评估上次接种疫苗后一年的免疫反应。

对rF1V疫苗进行了1期(rF1V-01)和2期(rF1V-02a)临床试验。第二阶段的临床试验(rF1V-02b)正在进行中。在rF1V-01试验中年龄在18至40岁之间，在rF1V-02a试验中年龄在18至55岁之间的男性和女性志愿者在签署知情同意书后被招募并评估其资格。这些研究按照rBV A/B的描述进行、监测和回顾。在研究过程中，通过桥式ELISA法在预定的时间间隔测量rF1、rV和rF1V的抗体浓度，并计算血清转换率，来评估对疫苗的免疫反应。还采集血液用于被动移植研究，以评估动物的疗效。

第一项试验，rF1V-01，是一项单中心、开放标签、剂量递增的研究，旨在评估两剂方案(第0天和28天)的安全性、耐受性和免疫原性 μG，40  μ克,80 μ克，和160  μG总免疫蛋白)。44名受试者参与了这项研究，每组11人。在免疫原性数据分析的基础上，一项扩展研究评估了第三次剂量160的效果 μG在11个受试者中的第一次剂量后230天施用约230天，该受试者在先前接受相同的疫苗剂量。所有志愿者在最后一次疫苗接种后均为180天。

所有志愿者至少经历了一次TEAE，大多数人的TEAE强度为轻度或中度。注射部位反应是最常见的相关TEAE，通常为轻度或中度反应，在两次或三次接种后，在两个最高剂量下更为频繁。最常见的注射反应是疼痛、肿胀和红斑。与疫苗接种相关的全身反应包括头痛、疲劳、恶心和腹泻。这些反应大多为轻度或中度，不具有临床意义。没有临床意义或相关的实验室变化。考虑到两次接种之间不同的时间长度后，与第一次接种相比，第二次或第三次接种后TEAE的频率没有明显增加。所有队列在前两次给药后均记录了连续心电图，未观察到有临床意义的异常。

rF1V疫苗在两次接种20个剂量后具有免疫原性 μG，40  μ克,80 μg，或160  μ克的疫苗。在接受三剂160的志愿者中，抗体反应显著增加 μg疫苗，与两次160后的回答相比  μ摹剂量。所有三个测试抗体的峰值的GMC（抗RF1，抗RV和抗rF1V）第三次给药后14天发生。三分之一剂量给药也增加可检测抗体的速率对所有三种抗原。在此基础上，两个最高剂量（80  μ克和160  μg)被选择在三剂量方案的2a期研究中进行评估。

rF1V-02a 2期试验是一项多中心、双盲研究，旨在评估三剂量方案(第0、28、182天和第0、56、182天)的安全性、耐受性和免疫原性 μ克和160  μG总免疫蛋白)。研究中有400名受试者（每个队列100个）。在最后一次疫苗接种后12个月后遵循疫苗接种的受试者。

所有受试者至少经历过一次TEAE，组间总体发生率无统计学差异。共有6名志愿者因TEAE而停止了注射，2名因注射部位反应而停止。teae大部分为轻度或中度强度。未发现与研究疫苗相关的SAEs。大多数志愿者在接种疫苗后28天内出现teae，这些主要是注射部位反应。这些反应大多为轻微或中等强度，最常见的是疼痛、肿胀、红斑和瘙痒。最常见的相关全身反应是头痛、不适、恶心和腹泻。大多数反应也是轻微或中度的。作为AEs报告的最常见的实验室异常是血糖和尿液中的蛋白质升高和血红蛋白下降。这些teae是散发性的，与其他临床异常无关，无需治疗即可消除。 In general, no clinically meaningful trends were noted in changes to laboratory parameters in any vaccination group, dosage, or schedule. Overall, the 80  μg剂量的安全性和耐受性略好于160  μg剂量，和第0,56天和182期的时间表比0,28和182个时间表略微更好的安全性和耐受性。此外，在用随后的疫苗接种后28天内，似乎局部或一般茶叶的速率似乎没有增加。

免疫原性数据表明，抗rf1、抗rv和抗rf1v抗体的GMCs在第三次接种后明显高于第二次接种后，几乎所有受试者在最后一次接种后7 ~ 14天出现血清转化。在接种疫苗后，血清转换率在选择的剂量和接种计划之间没有区别。第0、56、182天接种组的抗rf1、抗rv、抗rf1v GMCs和血清转阴率均高于第0、28、182天接种组，第2次接种后7天至第3次接种评估时血清转阴率均高于第0、28、182天接种组。根据这项研究的结果，80 μg剂量和第0,56,182天疫苗接种计划被选择用于2b期临床试验的进一步试验。此外，在2b期临床试验中，正在评估更短的疫苗接种计划，以评估是否通过更早接种第三次疫苗而实现同等免疫原性。

在完成的人类试验中，RF1V疫苗在使用的剂量和时间表中安全且耐受，并引发对疫苗重组抗原（RF1V）的免疫响应和其各组分（RF1和RV）。

针对BoNT的特异性抗体的保护能力已在动物身上得到证实[ 19.- 23.］．20世纪50年代的Iakovlev阐明了作为保护性免疫的相关抗体的大部分基础是由Iakovlev进行的，据证明提供给小鼠和豚鼠的被动免疫力足以保护这些动物免受血清型特异性的吸入挑战[ 24.］．基于所述Cardella方法的BoNT A / B顾问委员会在血清中小鼠（毒素）被评估中和抗体测定（MNA）[ 25.］．NAC通常被认为是免受暴露于骚乱的衡量标准。

迄今为止的人类研究结果表明，rBV A/B疫苗是安全的、耐受性良好的和免疫原性的。在动物身上观察到的抗bont NACs将与在接种疫苗的人身上观察到的NACs进行比较，以预测在人身上的临床益处(桥接)。如上所述，动物疫苗剂量的选择是基于其诱导NACs的能力与临床获得的相似，这些疫苗剂量和方案将用于关键研究的疗效评估。旨在代表观察到的人类反应的被动转移研究将是证明rBV A/B疫苗为人类提供保护的能力以及连接临床和非临床信息的重要手段。

相比之下，没有接受检测与保护从相关因素 Y鼠疫。用疫苗接种后保护动物免受肺炎瘟疫 Y鼠疫F1和V抗原[ 26.那 27.］．F1是一种形成胶囊的17kda蛋白，可能干扰补体介导的调理作用[ 26.那 28.］．37kDa V毒力因子是称为“yop virulon”的3型分泌系统的组分。YOP virulon通过从细菌细胞注入效应蛋白来诱导宿主吞噬细胞的细胞凋亡。v抗原响应于环境刺激而分泌，对毒力至关重要[ 27.那 29.]独立地，由于其在促进yop效应易位方面的作用。

F1和V抗原在小鼠、NHPs和人类中诱导体液和细胞介导的免疫反应[ 7.那 13.那 30.- 38.］．体液应答有助于保护从鼠疫和肺鼠疫的能力证明与F1特异性单克隆抗体的被动转移到小鼠。同样地，V-特异性抗体从与F1 +气雾攻击保护小鼠和F1-菌株的 Y鼠疫[ 39.那 40］．最近，针对rF1、rV或rF1V的多克隆和单克隆抗体保护naïve小鼠免受皮下、鼻内和气溶胶暴露 鼠疫菌，[ 41.那 42.]为抗体提供额外的证据。

关于细胞介导的免疫反应在提供鼠疫保护中的作用，我们所知较少。T细胞分泌的细胞因子，包括IFN- γ和tnf- α，其被认为激活吞噬细胞，细胞内的限制 Y鼠疫复制和促进细胞内杆菌的杀灭正在研究中[ 37.］．此外，这些细胞因子似乎通过体液应答有助于保护，这些细胞因子在小鼠接受亚最佳剂量的F1-的或V-特异性抗体在这些小鼠显著存活率降低的中和[ 38.］．用细胞因子特异性中和抗体阻断细胞因子活性，也干扰了主动或被动接种小鼠通过呼吸途径受到攻击时的保护 Y鼠疫CO92 [ 43.］．对IL-17保护的作用 Y鼠疫也在调查[ 44.］．

因此，通过连接rF1V免疫反应来预测临床效益更具挑战性。因为体液反应被认为参与了保护 Y鼠疫在美国，一些基于抗体的检测正在考虑支持桥接。这些包括桥式酶联免疫吸附试验(图 3.)、抗体被动转移和巨噬细胞毒性试验。

桥ELISA使用RF1，RV和RF1V抗原来评估对RF1V疫苗接种的体液免疫应答，使用单一标准曲线，允许通过临床和非临床样品直接比较。测定基于免疫血清中的活性抗体捕获，使用涂有His-F1，His-V或His-F1V抗原的平板。通过加入稀释的生物素化抗原（RF1，RV或RF1V），然后用辣根过氧化物酶 - 缀合的链霉抗生物素蛋白溶液和四甲基苯胺基底物来检测结合的抗体。鸡IgY标准曲线用于定量测试血清中抗体的抗体水平，RF1，RV和RF1V。RF1V的桥ELISA的表示在图中呈现 3.， rF1和rV测定采用相同的格式。

Bridge ELISA相对于标准直接ELISA的关键优势是，相同的试剂在不同的检测中使用，具有物种中性的能力。物种中性的优点是避免了物种特异性二次试剂引入的偏置。桥酶联免疫吸附试验的一个局限性是，它不是一种评估免疫血清中保护性抗体的功能试验，而是测量任何能够结合抗原的抗体，而不管其保护能力如何。

桥酶联免疫吸附测定的滴度与小鼠和CMs的直接挑战研究的生存数据进行了统计评估。迄今为止获得的数据表明与生存相关的持续趋势，但需要来自其他研究的数据来充分评估该分析作为相关的效用。同样，2b期试验的免疫原性数据也需要根据动物效价和疗效来分析人类反应。

被动转移研究评估对F1和v抗体的联合保护能力。1941年，小鼠被动转移系统曾用于支持一项决定，即用死鼠疫杆菌对暴露于黑死病严重威胁下的军事人员进行疫苗接种。小鼠被动转移的读数以称为小鼠保护指数(MPI)的比率评估死亡率和死亡时间。基于动物数据，MPI值作为预测非临床黑死病疫苗疗效研究中生存的可靠指标，并确定何时需要在人体内接种加强疫苗[ 45.那 46.］．

被动转移系统涉及从接种疫苗的动物或人类施用免疫血清 Y鼠疫-NAïve小鼠。基于完成的药代动力学研究，当血清滴度高原时，小鼠暴露于气溶胶​​挑战。完成的CM至小鼠被动传递测定结果表明了体液免疫和肺痘痘保护之间的关联。生存分析结果显示抗体水平与生存率的关联，尽管在任何一种小鼠或供体血清中没有循环抗体（抗-RF1，抗RF1V或抗RF1V）的特异性水平被定义为提供特定的保护水平。在对照小鼠中，接受免疫血清的小鼠组中的平均存活时间大于中位存活时间。受体小鼠的存活，死亡时间和MPI正在统计上进行统计评估，以与小鼠和CMS的直接气溶胶攻击研究中的生存相关。来自临床试验的人血清也在桥梁ELISA和被动转移系统中进行统计测试和评估，以桥接到动物数据。

Y鼠疫和其他致病性物种 yersinia.是巨噬细胞的细胞毒性和培养巨噬细胞对吞噬作用的抗性，但可以通过抗V抗体来中和细胞毒性和抗性 。免疫的几种基于巨噬细胞的测定法，以感染 Y鼠疫据报道( 47.- 51.］．

Y鼠疫通过Caspase-3依赖性凋亡途径诱导巨噬细胞死亡。在活性调查下进行一次测试检查免疫血清从RF1V接种疫苗的个体中和的能力中和 Yersinia-通过测量caspase-3水平的降低来诱导巨噬细胞的细胞毒性。关键成分包括小鼠巨噬细胞样细胞系J774A.1， Y.Psudotuberculosis.（ Y. PTB. [ V. ] )，内源性V基因已被来自 Y鼠疫，免疫个体的血清样本，以及EnzChek caspase-3 II试剂盒。该试剂盒使用微量荧光测定法和capase -3特异性底物Z-DEVD-R110，该底物被活性caspase-3切割释放出高荧光R110。目前正在评估该测试作为潜在相关分析方法的可行性。

首先评估免疫血清中和巨噬细胞毒性的能力，并定量检测血清中和细胞毒性活性的差异。如前所述，在USAMRIID进行了细胞毒性试验[ 48.]，血清中和值(NT_50.） 决定。NT._50.值对应于倒数血清稀释度导致胱天蛋白酶-3的水平降低50％的。在双重滴定测定法中观察到剂量反应良好，通过回归分析确定，并且兔抗血清产生NT_50.值从157到1384;血清抗rv ELISA滴度与NT无相关性_50.价值（[ 48.]，数据未显示)。对rf1v免疫小鼠、猕猴和人类志愿者血清巨噬细胞试验的初步评估结果，高度提示了动物或被动小鼠转移模型的保护作用。

关键的非临床研究和3期临床试验将在生产合格批次后进行，这与满足FDA动物法规许可要求的能力相关，具有重大风险。在这些关键研究之前，需要克服的最重要的技术挑战是成功的商业规模生产、工艺和分析的验证，以及确定预测rF1V临床效益的合适方法。除了许可证要求外，在高级开发项目期间生成的数据还需要满足国防部的性能要求。