DNMT3A突变在巴西南部的急性骨髓性白血病患者

文摘

急性髓系白血病(AML)是一个复杂和异构造血组织肿瘤。描述了几种分子标记,帮助对AML患者分为风险组进行分类。DNA甲基转移酶3 (DNMT3A)基因突变最近发现约22%的AML患者和作为一个独立的危险因素与不良预后有关。我们的目标是确定体细胞突变基因的频率DNMT3A和主要的染色体易位的AML患者样本。我们在82年调查样本的骨髓AML患者体细胞突变DNMT3A基因测序和寻求主要融合通过rt - pcr成绩单。我们发现突变DNMT3A基因6例(8%);3 R882H类型。我们发现融合转录19例,即AML1 /环氧乙烷(;6.1%),PML / RARα(;14.6%),MLL / AF9 (0;0%),CBFβ/ MYH11 (;2.4%)。复发性突变的识别DNMT3A基因及其可能的预后影响治疗决策可以是一个有价值的工具。这是第一个研究的体细胞突变的存在DNMT3A基因在AML患者在巴西。这些突变的频率可能表明ethnogeographic变异。

1。介绍

急性髓系白血病(AML)是一个复杂和异构造血组织肿瘤引起的基因突变,染色体重组,基因表达的放松管制,表观遗传修饰。这些变化导致不受监管的扩散和骨髓造血细胞的分化能力的损失。近年来,一些重要的预后分子标记描述了AML,不仅改善疾病特征,但也允许分层分为风险组的患者,可以指导治疗决策1]。然而,这些分子标记通常不能提供准确的预后和治疗信息,由于病程变化显著之间患者属于同一个类别风险(2- - - - - -4]。

传统认为癌症是一种疾病引起的一些基因突变已经取代了复杂的基因网络的概念放松管制和表观遗传变化。此外,虽然非常重要,这些突变已报告中发现只有少数的AML患者(5- - - - - -7]。表观遗传的不同组件机械如DNA甲基化、组蛋白的共价修饰,和非编码rna被描述为cocontrollers癌症基因表达和在一个上下文可能导致白血病生成(8]。甲基转移酶等DNMT1,DNMT3A,DNMT3B都是关键的组件的基因的表观遗传调控催化添加甲基胞嘧啶残基的CpG二核苷酸。

最近,在一项研究中使用全基因组测序,复发性描述了体细胞突变的DNA甲基转移酶基因(3DNMT3A)在22%的AML患者(9]。在这项研究中,DNMT3A突变是独立与不良预后相关,患者更频繁的正常细胞遗传学和因此,最大的临床相关性。十八个不同的突变被发现,其中大部分为错义突变。初步数据显示,这些突变的发生率在AML范围从4.1%在日本的一项研究中10),9%的研究与中国患者(11),大约15 - 25%在两个西方研究[9,12- - - - - -14]。鉴于所有研究协会与CN-AML观察,这不是令人惊讶的,患病率最高2系列报道关注CN-AML (29 - 36%) (15,16]。这些可能ethnogeographic发生率的差异DNMT3A突变及其预后的作用需要,然而,是更好的特点。的确切机制DNMT3AAML的突变行为仍不清楚,因为全球的基因组中甲基化模式的AML患者似乎没有显著改变(9]。

本研究的目的是描述频率突变和临床的影响DNMT3A相关基因,它与临床数据和已经定义良好的易位在一群AML患者在医院das丹尼,在阿雷格里港,南里奥格兰德,巴西。

2。材料和方法

2.1。病人

我们学习了87个样本来自AML患者的骨髓,在诊断和任何化疗之前,冻存的细胞培养实验室的造血细胞和分子分析属于实验研究中心医院丹尼的阿雷格里港(CPE-HCPA)自2001年以来到现在的日期。从AML获得病人的临床信息数据库服务的血液学和HCPA骨髓移植。患者分为风险groups-favorable,中间,和说的那些标准17]。良好的小组是由周期性相互易位t (15、17), t(8; 21),和发票(16);中间包括患者正常核型,+ 8和t (9。11);和unfavorablesubgroupincludescomplex分析(≥3异常)5和7−−异常,异常染色体3、平衡结构重组:t (6, 9)、t(6; 11)和t (11; 19)。核型特征的样本如表所示1。

程序是由人体试验伦理委员会批准在巴西,并依照1975年的赫尔辛基宣言。

2.2。DNA和RNA的提取

低温贮藏骨髓样本解冻,洗与PBS1x 5%白蛋白,然后用试剂盒的DNA和RNA提取试剂(表达载体),根据制造商的建议。

2.3。融合的识别记录

RNA提取后我们继续逆转录使用上标三世工具包(表达载体)。互补脱氧核糖核酸合成的RNA提取的有效性是监控的放大组成型基因glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)和负样本丢弃。

感兴趣的序列被放大的聚合酶链反应(PCR)根据BIOMED-1 [18)(表2)。PCR产品可视化在1.5%琼脂糖凝胶电泳和乐队被认为是积极的在以下尺寸:AML-A / ETO-B:395个基点,PML-A1 / RARα- b:381个基点,PML-A2 / RARα- b:376个基点,CBFβ——/ MYH11-B2:418,MLL6S / AF9AS3:651个基点(18,19]。

2.4。识别突变DNMT3A基因

提取的DNA聚合酶链反应的放大DNMT3A外显子19、20、21、22和23日与引物被托尔et al。14)(表2)。1.5琼脂糖凝胶电泳后,PCR产品受到净化使用核酸外切酶和虾碱性磷酸酶(EXO-SAP,通用电气医疗集团),然后排序。

2.5。测序

样本的测序Unidade de注意分子e de Proteinas (Centro de尽管实验,HCPA)使用ABI 3500基因分析仪50厘米的毛细血管和POP7聚合物(应用生物系统公司)。PCR产品贴上3.2 pmol正向引物和1μL (BigDye终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司)在最后一卷10μl .标记样本纯化使用BigDye XTerminator净化设备(应用生物系统公司)和electroinjected自动测序仪。重复比较的参考序列(NM_022552)。改变测序结果证实了反向链测序。

2.6。统计分析

使用SPSS V18执行统计分析。总体存活率和无病生存曲线计算使用kaplan meier生存函数和比较的长排测试。分类数据费雪的精确测试使用。小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。描述的示例

87年的AML细胞样本银行的实验室细胞培养造血细胞和分子分析,82年可能是分析。研究的患者人群,58.5%(48)是男性的平均年龄42年。根据工厂分类,6.8% (5)AML M0, 21.9% (16) AML M1, 30.1% (22) AML平方米,19.2% (14)AML M3, 17.8% (13) AML M4, 1.4% (1) AML M5, 2.7%(2)不属于AML, M3。中位数白细胞(WBC)计数在诊断为6.6×10⁹/ L从0.16到374.5×10⁹/ L。有23名(41.8%)例核型改变。至于危险分层,18例(29%)患者分配给良好的组,中间组38例(61.3%),6例(9.7%)属于不利的风险组,20例(16.4%)核型分析并没有执行,因此不能被分类(表3)。

如表所示3,我们能够分层为风险类别只有20 62名患者因为我们没有足够的信息。18(29.0%)是有利的,在中间38(61.3%),6例(9.7%)在不利的风险。除了群AML患者M3治疗根据APL协议(20.),其他所有患者缓解使用协议7 + 3归纳和整合,并与高剂量的AraC强化。其中,8随后提交给自体和22到同种异体骨髓移植(BMT)。整个集团的14个(19.2%)耐火材料治疗。其中,1例(7.1%)属于优惠,中间8例(57.1%),2(14.2%)的不利,3(21.4%)属于非保密。62年的总生存期(OS)分类患者,120个月的跟踪,为54.9%,39.0%,和16.7%优惠,中间,和不利的风险类别,分别(图1)。操作系统和无病生存期(DFS)的整个组患者,120个月的跟踪,分别是41.7%和23.4%(图2)。

3.2。融合转录本

19例(23.1%)有融合转录rt - pcr法鉴定。5(6.1%)呈现AML1 /环氧乙烷12 (14.6%)PML / RARα,2例(2.4%)CBFβ/ MYH11融合基因。的存在MLL / AF9t(9。11)不存在在我们的一系列的AML患者。成绩单PML / RARα被发现在78.5%(11)的情况下分为APL。的12PML / RARα积极的病人,只有4有一个兼容的核型,阳性t(15、17),其余正常(3)或没有核型(5)。

当比较积极和消极的整体存活率PML / RARα患者,120个月的跟踪,我们发现操作系统,积极的为37.6%,负(72.7%)(图1)。预后价值趋势也显示AML1 /环氧乙烷与一个操作系统存在的正面和负面的22.7%和60.2%,分别为()。最后,其中一个inv16病人死于缓解感应和其他还活着在连续完整的缓解。

3.3。DNMT3A

体细胞突变被发现在8%(6)的样本,被5 missensemutations沉默突变,包括p。R882H突变被雷et al。9在3例)。变异序列都是杂合的,没有病人不止一个突变。新突变的发现是:p。R973Q, p。D748N,和p.H896. The mutations location domains are shown in Figure3。6例DNMT3A突变,绝大多数(5 83.3%)是位于外显子23。四个(80.0%)患者突变属于中间风险组与正常核型,1良好的组,1非保密。的患者DNMT3A突变,只有1融合成绩单是积极的PML / RARα诱导过程中死于凝血障碍;三染色体4和8是活着的病人持续缓解(表4)。

患者有或没有的特点DNMT3A基因突变没有显著差异,他们在表表示5。尽管样本量不允许生存的比较分析,后续的120个月,患者的操作系统DNMT3A基因突变的患者和41.4%DNMT3A为44.4% ();第二道防线是分别为22.7%和0%,()。

4所示。讨论

研究的82名患者中,我们能够根据工厂73年分类进行分类。FAB亚型的频率M0、M1和M2是类似文献报道除了亚型M4, M5, M6, M7的频率较低(表3)。M3亚型在我们组更频繁(19.2%)相比,国际研究;这证实了报告结果·卡普拉et al。21]在南里奥格兰德州的一项研究中,巴西和其他类似报道的拉丁美洲人口(22,23]。FAB亚型分类的频率分布,我们发现在我们的样例532例AML我们报道中描述的相同21患者)在同一地区相同的种族背景。基于这一发现我们可以说,虽然现在报道一个小样本的病人从一个单一的机构,它是一个代表我们的人口。我们的机构是一个大学公立医院有一个最活跃的骨髓移植中心在全国AML病人的状态接受治疗。关于风险的分类中样本的29.0%,61.3%,和9.7%的优惠,中间,和不利的风险类别,分别,尽管有大量的情况下没有分类,一般来说它同意在文献中描述的分布和几乎是相同的,在病人在同一地区(21]。

融合的频率记录,特别是AML1 /环氧乙烷发现在我们的样本中,6.1%是在文献中所描述的相似(6 12%)(24,25),而相对的频率PML / RARα(14.6%)高(5 - 8%)26),可能反映出人口AML M3的发生率越高。的成绩单CBFβ/ MYH11我们有一个相对频率为2.4%,略低于他人(5 - 8%)报道(27),没有积极的成绩单MLL / AF9,这与文献,表明大约1%的频率(19]。然而,总的来说,重组的发现22%的患者是一致的频率在英国1065年发现20%患者(28]。最后,分析染色体易位的rt - pcr被证明是有利的在我们的中心因为只有7 19融合患者记录检测到的核型分析、解释的频率只有41.8%的核型异常组患者发现,不到65%的报道看(29日]。

寻找复发体细胞突变基因DNA甲基转移酶3 (DNMT3A)是在我们所有的82名患者。我们选择的最后五个外显子基因序列DNMT3A证明自雷et al。9),大约80%的突变位于这些外显子,其中58%在过去的一个(外显子23),在我们的研究中,事实上,大多数突变被发现(图3)。体的频率DNMT3A突变中发现8%的82例低于281年报告病人的22%雷et al。9托尔),低于17.8%发现et al。14),还在西方患者,其中包括约500名患者。有趣的是,尽管第一个研究整个基因测序,后者仅在过去9个外显子进行了研究。的最低频率突变出现在我们的样例病人报告类似的其他民族。在日本的一项研究[10),包括74名患者和整个基因测序,突变被发现的频率仅为4.1%,所有位于外显子23日,而在中国研究[11)还包括355名患者和测序整个基因,突变的频率,主要影响外显子23日大约是9%。

的序列DNMT3A依照研究基因变异,Stegelmann et al。30.),我们的箱子都是杂合的,没有病人有多个突变;此外,3 6突变p。R882H,already described by Ley et al. [9)发现的突变频率的59%。

5、窝藏或80%,我们的病人DNMT3A突变属于中间风险类别,据报道被别人(9]。我们还发现一个趋势()增加白细胞数量在诊断患者的突变(20.7×10⁹/ L)比较的不突变(6.4×10⁹/ L)在协议与其他的许多研究报告(9- - - - - -11,31日- - - - - -33]。有趣的是,值得一提,在我们组的病人有一个案例DNMT3A突变,也存在PML / RARα。

最后,系统根据我们组的62名患者的风险类别显示预后趋势类似文献报道(图1)。的预后评估DNMT3A体细胞突变或其并发与融合成绩单不能确定在我们的研究中由于样本容量。

5。结论

总之,据我们所知,这是第一个研究体细胞突变的基因的存在DNMT3A在巴西AML患者。尽管在少数患者,我们发现这些突变的频率要低于西方病人报告。这可能表明一个ethnogeographical变化已经为东欧和高加索患者建议在文献[34]。复发性突变基因的发现DNMT3A及其可能的预后的影响可以提供有价值的信息对AML患者的危险分层和代表一个有价值的工具,用于治疗决策。然而,使用突变DNMT3A基因作为危险分层的工具需要考虑他们的应用程序在不同的ethnicgeographic讨论组。

确认

研究了金融支持研究和事件激励Fundof医院丹尼·德·阿雷格里港(FIPE-HCPA)和国家科学技术发展委员会(CNPq)和由CNPq研究奖学金。309091/2007-10。本文没有利益冲突。

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