斑马鱼von Willebrand因子的特性揭示了域结构、多化和细胞内存储的守恒

抽象的

血管性血友病(VWD)是人类最常见的遗传性出血疾病，由血管性血友病因子(VWF)的定量或定性缺陷引起。VWF是一种分泌的糖蛋白，以大的多聚体形式循环。虽然VWF降低与出血有关，但总体水平或多定时器大小的升高与血栓形成有关。斑马鱼是一个强大的遗传模型，它的止血系统在哺乳动物中保存得很好。这种生物产生成千上万后代的能力和它的光学透明度使其独特和补充哺乳动物的止血模型。之前是斑马鱼的部分克隆vwf已经被确认，并且一些功能已经被证明。本文克隆了完整的斑马鱼vwf并显示出结构域的保守性。重组斑马鱼Vwf在细胞培养中形成大的多聚体和伪weibel - palade小体(WPBs)。幼虫表达见于咽弓、卵黄囊和肠上皮。这些结果为斑马鱼Vwf的进一步研究奠定了基础，可能进一步加深我们对VWD机制的理解。

1.介绍

脊椎动物有一个复杂的封闭循环系统，它需要各种因素的平衡协调，以维持血液流动，并在系统破坏时防止放血。这就是所谓的止血，它由一组复杂的细胞成分组成，以及一个被称为凝血级联的蛋白质网络。后者在包括哺乳动物、鸟类、爬行动物和鱼类在内的脊椎动物进化过程中，在基因组水平上高度保守[1- - - - - -3.]．

凝血的中枢成分之一是von Willebrand因子（VWF），其缺乏是出血障碍von Willebrand疾病（VWD）的基础。哺乳动物VWF基因由52个外显子组成，其中最大的第28个外显子包含VWD中经常突变的几个功能域[4]．VWF是一种260 kDa(千dalton)分泌的糖蛋白，组装成超过10,000 kDa的多聚体[5]．在损伤部位，高分​​子量VWF多数量与血管下皮细胞和系环血小板中的受体结合，以形成初级止血塞[6]．我们对VWF功能的大部分知识来自人类和各种哺乳动物模型生物(包括老鼠、狗、马、猫、猪和兔子)的突变特征[7，8]．然而，在其他脊椎动物模型中，如硬骨鱼，可获得的信息相对较少鲐鱼类(斑马鱼)。硬骨鱼具有几乎所有凝血因子高度保守的同源性[1，3.]，并已被证明会对激光引起的损伤产生血栓[9]．斑马鱼胚胎发育是外部的、快速的、透明的，大大简化了表型筛选。受精后约24小时开始循环，血管的发育已被很好地描述[10]．化学诱变的正向遗传筛选已经用于研究心脏发生、血管发生和血管生成[11- - - - - -14]．

最近，从斑马鱼中克隆出了28号外显子，并证明了VWF的一些功能是守恒的[15),而在网上全长斑马鱼的集合vwf亦有描述[16]．我们现在报告全长斑马鱼的克隆和表征vwf互补脱氧核糖核酸。斑马鱼Vwf具有人类Vwf原结构域的保守性，并能在细胞培养中形成伪weibel - palade体(WPBs)和大的多聚体。不同于哺乳动物物种，在研究的阶段，它似乎没有广泛表达在发展的内皮细胞。

2.材料和方法

2．1．全长斑马鱼的克隆vwf互补脱氧核糖核酸

使用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，California）从单身成年斑马鱼制备总mRNA。用随机六烷烃（Invitrogen）引发后，用上标III逆转录酶合成总cDNA。这vwf使用从ZV6的基因组序列以ZV6作为模板组装在四个重叠的PCR扩增片段中，以设计引物（表1）.利用重叠序列中所含的独特限制性内切位点，将4个PCR产物依次组装到载体pCR4-TOPO (Invitrogen)中。用RACE (cDNA末端快速扩增技术，Ambion)扩增5 '和3 ' uts(未翻译区域)，其末端与组装的克隆的唯一限制性内切位点重叠。设计外部RACE引物，分别针对5 '和3 '载体的特异位点NotI和SpeI进行酶切。

2．2．Multispecies比对

非斑马鱼VWF氨基酸序列从UCSC基因组浏览器下载，http://genome.ucsc.edu/［17]，使用ClustalW2对齐，http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/［18，19]，通过BOXSHADE 3.21输出显示，http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html．使用两个序列蛋白爆炸（基本局部对准搜索工具）进行域比较，通过国家生物技术信息中心，默认设置http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/．

2．3.质粒的克隆vwf互补脱氧核糖核酸

聚集在一起vwfcDNA克隆到含有8个氨基酸连接子的pcDNA3.1/V5-HISA (Invitrogen)中，生成pzVwf/V5-HISA。由于已证明带有18-20个氨基酸连接子的人标记的VWF表达更健壮(R. Montgomery和S. Haberichter，未发表的观察结果)，我们从一个人VWF/Myc-HIS结构中扩增了这个连接子(pVWF/Myc-HIS，连接子序列见表)1)，克隆到pzVwf/V5-HISA的3 ' XhoI-PmeI位点(来源于pcDNA3.1/V5-HISA)，生成pzVwf/Myc-HIS。人pVWF-EGFP质粒含有相同的连接子序列。pfli-ZVWF-EGFP通过插入来构造vwfcDNA进入tol2-fli -EGFP [20.在框架内egfp．

２.４.免疫荧光分析

HEK293T细胞维持在DMEM（SIGMA; St LOUIS，MO）中，补充有10％胎牛血清，100u / ml青霉素和100 μ.g / mL链霉素(σ)。细胞在盖片上生长，直到它们达到50-80%的融合，然后按照制造商的说明使用FuGENE (Roche, Penzberg, Germany)进行转染。转染后的盖片用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，在10%福尔马林中室温固定25分钟，然后在4℃100%冰甲醇中固定/渗透10分钟。PBS复水5分钟后，用小鼠抗myc (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)和兔子抗calnexin (Novus Biologicals, Littleton, Colorado)抗体在4°C下分别稀释为1:100和1:500孵育细胞。然后在PBS中洗涤3次(每5分钟)，并与与Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠抗体和Alexa Fluor 594偶联的山羊抗兔抗体在室温下1:200稀释60分钟孵育。在PBS中再洗三次后，盖片用延长抗褪色金(Invitrogen公司)安装，并在倒置奥林巴斯(Melville, New York)共聚焦显微镜上观察。处理使用奥林巴斯FluoView 5.0版本完成。

2．5．Vwf多聚体分析

培养HEK293T（人胚胎肾脏）细胞与PZVWF / V5-HIRAA或未标记的全长人VWF表达质粒（PCINEOVWF）进行培养并转染，如前所述[21]．从PZVWF / V5-HISA转染细胞的条件培养基在每个制造商的指示（GE Healthcare Life Sciences，Uppsala，Sweden）上纯化过镍柱。通过电泳通过电泳通过0.8％（w / v）hgt（p）琼脂糖（FMC Bioproducts，Rockland，Maine）堆叠凝胶和含有0.1％十二烷基钠的1.5％（w / v）hgt（p）琼脂糖的凝胶的凝胶分析上清液使用Laemmli缓冲系统和如前所述的蛋白质印迹，硫酸盐为40伏特，如下所述21]．一抗为抗v5抗体(Invitrogen)和抗his抗体(AbD Serotec, Oxford, United Kingdom)的1:5混合物或抗人VWF单克隆抗体Avw1, 5，和15的混合物[22]．

2.6。斑马鱼系的维护和胚胎的生产

按照标准方法饲养成年斑马鱼(AB、TL、EK) [23]．受精后立即收集的胚胎保持在28.5℃，并在6-8 hpf(受精后数小时)下用1-苯基-2-硫脲(PTU)处理直到固定，以防止色素形成。在特定的时间点，胚胎用三卡因去毛或安乐死，用4%多聚甲醛在PBS中4°C固定过夜，并在- 20°C甲醇中保存一个月[24]．

2.7。胚胎和幼虫RT-PCR的RNA分离和cDNA合成

根据制造商的说明，使用Trizol RNA分离试剂（Invitrogen）从至少三种生物重复中提取总RNA。RNA（1 μ.g)采用随机六聚体和SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)进行逆转录。从每个样品的第一链cDNA aliquot作为模板在PCR反应使用引物vwf。

2.8。原位杂交

原位杂交基本上是通过一些修饰进行的[24]．全长vwfPCR4-Topo中的cDNA用Noti和Spei线性化（分别是反义和感测转录物）并转录体外分别使用T3和T7 (Ambion, Austin, Texas)，根据制造商的说明书，地高辛标记核苷酸然后碱性水解(罗氏)。另外，用SP6和T7引物从全长cDNA中扩增出424和441 bp的片段(见表)1)和转录体外用地高辛标记的核苷酸。杂交前，将核糖探针加热到80°C 3-5分钟，立即冷藏至少5分钟。用Leica MXFLIII立体荧光显微镜和Olympus DP-70数码相机对染色胚胎进行拍照。包埋在JB-4树脂中，如所述[25]，然后在4-6处切片μ.i’我使用的是徕卡RM2265超微切片机。切片成像采用奥林巴斯BX-51立式光学显微镜和奥林巴斯DP-70高分辨率数码相机。

3.结果

3.1。斑马鱼的克隆与表征vwf互补脱氧核糖核酸

根据基因组序列，斑马鱼vwf位点位于18号染色体的下游cd9，维持与哺乳动物物种同生[15]．完整的长度vwf从斑马鱼全长cDNA中提取4个重叠片段，通过RT-PCR组装cDNA，然后RACE，完成5 '和3 ' uts (Section2）.全长序列是比人VWF短的一个氨基酸，总体上的46％（表2）.使用BLAST对斑马鱼Vwf与人类Vwf进行比对，可以清楚地描绘出所有已知的域(图)1(一)）具有不同程度的保护（表2）.保守性最低的是A1和A2域，它们包含了整个28号外显子(表2)2）.如哺乳动物，vwf基因座由52个外显子组成，但仅跨越81 kb(千碱基)，而人类基因组和小鼠基因组分别为176 kb和134 kb。斑马鱼基因组之前的迭代(在Zv7之前)预测，外显子28分裂为两个外显子[17]．来自此报告的序列数据和以前的工作[15，16证明了介入序列实际上是外显子的。

人类VWF的其他关键特征可以通过不同程度的保护来识别。除青鳉外，所有物种的前肽切割位点Arg-Ser都高度保守，是RX(R/K)R motif扩展的一部分(图)1 (b)) [26]．根据哺乳动物的侧翼残基同源性，A2结构域假定的ADAMTS13切割位点phel - leu是可识别的，并且在所有鱼类中都是保守的(图)1 (c)）.然而，假定的phe-leu裂解遗址与高度保守的哺乳动物和禽Tyr-met裂解序列有点类似（图1 (c)）.更重要的是，有一种与人类亮氨酸同源的亮氨酸¹⁶⁰³(图1 (c)）已被证明对Adamts13介导的VWF的蛋白水解至关重要[27]．

人类VWF的二聚和多聚需要许多二硫键[6]．这些都是由位于1099、1142位的半胱氨酸和位于c端胱氨酸结(CK) 2771、2773和2811位的半胱氨酸介导的，这些都是斑马鱼Vwf中保守的。事实上，除了半胱氨酸外，几乎所有的半胱氨酸残基都是完全保守的¹⁶⁶⁹和半胱氨酸^1670.，位于A2结构域的c端[16在所有被检测的鱼类中都没有。其中1个半胱氨酸仅在青鳉鱼中存在，4个残基在n端前肽切割位点，但在其他物种中缺失，使其意义不明确。斑马鱼Vwf的4位存在半胱氨酸，在哺乳动物物种中不保守，但其他硬骨鱼类的基因组序列信息在该区域缺失。

3．2．Vwf在哺乳动物细胞培养中的表达

为了确定斑马鱼Vwf是否可以多化，我们表达了V5/HIS标记vwfHEK293T细胞的cDNA。使用anti-V5和anti-HIS抗体的混合物检测到一个高分子量多聚体的阶梯(图)2）.这包括与人类VWF大小相似的高分子量多聚体(图2）.

的斑马鱼vwf将cDNA克隆到带有Myc-HIS标签的表达载体中VWFcDNA构建。将后者转染到HEK293T细胞中，已知形成伪WPBS [28，29]．在GWOR在GOLGI装置中的高分子量多聚体中加工成后，这些结构是制备的。使用抗Myc抗体，我们能够识别斑马鱼中与伪WPBS一致的细长结构vwf转染细胞(数据3（d）和3 (g)）.它们在形态上与在人类身上发现的相似VWF转染细胞(图3(一个)）.用抗炭蛋白抗体染色以定位内质网（ER，数字）3（b），3 (e),3 (h))显示结构之间没有重叠(图3（c），3 (f),3(我))，正如WPBs和伪WPBs的预期[28，29]．

3．3.发展的模式vwf表达式

对96 hpf以下的全胚进行RT-PCR检测，结果显示全胚中hpf含量呈上升趋势vwf表达，96 HPF中最强烈的表达（图4(f))。包埋原位杂交用于定位原肠形成中期(8 hpf)到120 hpf的表达。的表达vwf在8 HPF的胚胎整个胚胎中是弱敏感的（图4(a))。在12小时的胚胎中观察到更强的表达，在整个胚胎中更扩散(图)4(b))。48小时时颅内弥漫性表达，并延伸至尾侧(图)4（C））。在96-120小时，咽部曲线，肠上皮和卵黄囊内层存在强烈的表达（图4(e),4(g)4（H））。

4。讨论

VWD是由于VWF的定量或定性不足，已在几种哺乳动物中被描述，包括人、马、猫、猪、兔和狗[7，8]．人类的识别和特征VWF互补脱氧核糖核酸(30.- - - - - -33]使许多致病突变以及许多哺乳动物物种的部分或全长序列信息得以最终识别[34]．斑马鱼基因组项目[35帮助鉴定了许多vwf互补脱氧核糖核酸(15，16]，但不包括完整的5 '和3 ' uts。我们现在已经完成了全长斑马鱼的克隆和特性描述vwf互补脱氧核糖核酸。

我们发现了vwf在早期胚胎发育中显示出广泛的表达，然后在幼虫阶段变得更受限制。哺乳动物VWF在成年小鼠血管内皮细胞床中广泛表达[36]， VWF蛋白是一种已建立的人类脉管系统的临床病理标志物[37]．然而，尚未在发育中的脊椎动物中进行研究。我们假设斑马鱼会有广泛的表达vwf在开发脉管系统中，而是发现早期的宽度，然后是后来的限制模式。Zebrafish的先前研究确定了幼虫阶段的脉管系统内的VWF蛋白表达，尽管源未确定[15]．因此，与我们的结果差异的一个可能的解释是，幼虫血管内VWF未在内皮细胞中产生，而是来自蛋黄囊或咽​​部拱门。或者，内皮vwfmRNA的表达可能要到发育后期才会出现。

在早期胚胎发育中看到的表达可能反映了母系来源的转录本[38]，而后期的表达明显来自胚胎/幼虫。虽然VWF在咽弓中的表达很有趣，但目前还没有证据表明VWF在原肠形成中的作用。这些结构发展成鳃[39鱼类体内负责氧气交换的器官。这是最高级别的哺乳动物Vwf在肺中已经发现了mRNA的表达[36，提示VWF在这些结构中可能具有进化保守作用。

为了产生功能性的VWF活性，高分子量的多聚体被组装在反式高尔基体中，包装成WPBs并分泌。接着是血液循环和血小板栓系在血管损伤部位，形成初级血小板塞[6]．此前已有研究表明，斑马鱼的血小板将以vwf依赖的方式聚集，而吗啡酚介导的敲除导致出血次数增加和出血[15]．在这篇论文中，我们证明了斑马鱼Vwf在哺乳动物细胞培养中具有多聚和形成伪wpbs的能力。综上所述，这些数据表明斑马鱼Vwf功能的基本机制似乎是保守的。

先前的研究已经证明了Vwf受体GpIb在斑马鱼和鸡的血小板细胞上的存在[40，41]．如果血小板像哺乳动物的血小板一样结合Vwf，人们可能会认为Vwf A1域高度保守，该域编码gpib结合位点。A2结构域编码Adamts13裂解位点，是生产合适大小的Vwf多定时器所必需的。当卵裂减少时，可发生血管阻塞，而当增强时，则导致出血[42]．然而，哺乳动物和非哺乳动物脊椎动物系统之间存在显著差异。尽管Vwf整体氨基酸相似性和同源性守恒，但与人类相比，A1和A2结构域的差异最大。人们很容易推测A1区结合血小板的能力已经进化到相对增强或减弱，以补偿后者在原发性止血起始过程中更大或更小的作用。斑马鱼与哺乳动物相比，暴露A1和A2结构域所需的剪切力可能是不同的。尽管它们的功能相似，但有核血小板与无核血小板明显不同，这表明两者的功能可能完全不同。对鸟类血小板(也有核)的研究导致了一种假设，即人类心血管疾病可能与血小板的存在有关，而不是与血小板启动的原发性止血有关[41]．进一步了解血栓细胞和VWF在斑马鱼和禽血止血中的作用可能对治疗出血和血栓形成病症可能具有潜在的影响。

致谢

作者感谢密歇根大学测序和基因分型核心，以及Dave Siemieniak、Susan Spaulding、Kristen Lessl和Toby Hurd提供的技术援助，以及Evan Sadler提供的有用建议。作者特别要感谢David Ginsburg对论文的支持和批判性阅读。这项工作得到了美国心脏协会的支持。0675025N，拜耳血友病奖计划，黛安和拉里约翰逊家庭学者奖(J.A.S.)，以及国家卫生研究院P01-HL081588和R01-HL033721 (R.R.M.)。

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