新风胶囊治疗佐剂性关节炎的尿代谢谱分析

摘要

本研究采用气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF/MS)方法，探讨心风胶囊(XFC)对佐剂性关节炎(AA)大鼠尿代谢谱的潜在影响。将GC-TOF/MS技术与主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、隐结构正交投影判别分析(OPLS-DA)等多元统计方法相结合。这些方法用于区分健康组、未治疗组和XFC治疗组，并阐明潜在的生物标志物。发现马尿酸、腺嘌呤、左旋多巴等9种潜在生物标志物，表明AA大鼠的嘌呤代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢和能量代谢受到干扰。本研究证明了XFC对类风湿性关节炎有效，并解释了其潜在的代谢组学机制。

1.导言

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的慢性系统性自身免疫性疾病，以滑膜组织炎症为特征。它经常复发和延长，疼痛，并导致僵硬和损坏的骨头和软骨。RA的发病率和致残率高，严重影响患者的生活质量[1，2］．

在新安医学理论指导下，新风胶囊（XFC，安徽医药系统Z20050062）是一种历史悠久的中医药处方，临床用于治疗类风湿关节炎[3.- - - - - -5]，已在中国注册，并取得专利证书(ZL 201310011369.8和ZL201410101266.5)。XFC由薏苡仁(宜人),，蜈蚣(武功),，黄芪(黄芪),雷公藤(雷公藤)。我们之前的实验研究了XFC配方的提取和制备方法；结果表明，该提取方法适宜、简便、可行；质量控制数据可用。一种合适的HPTLC化学图谱，用于评估薏苡仁，蜈蚣，黄芪和雷公藤我们已经研究过了[6].在我们之前的研究中，XFC在缓解RA患者的关节疼痛程度、缓解晨僵和增强握力方面具有良好的效果，没有明显的不良反应[7，8]然而，新风胶囊治疗RA的代谢组学机制尚不清楚。

代谢组学是一种通过高通量检测和数据处理分析所有内源性代谢产物以获得潜在生物标志物的技术[9]。这项技术可以阐明生物体在特定时间和特定环境下的状态[10]代谢组学具有综合分析能力和动态操作能力，有利于研究代谢产物和化合物复杂混合物的中药[11］．因此，代谢组学可用于探索生物系统的生理状态变化与潜在生物标志物之间的关系[12］．

在本研究中，我们使用基于气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF/MS）技术的代谢组学方法来寻找尿液中潜在的内源性生物标记物，旨在探讨XFC在RA模型中的治疗效果和代谢机制。

2.材料和方法

2.1. 实验动物

该方案经安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准(许可证号:2012AH-038-01)。所有手术均在戊巴比妥钠麻醉下进行，尽量减少痛苦。SPF级SPF级成年雄性SD大鼠180 ~ 200 g，购自安徽医科大学实验动物中心。所有动物都被放置在标准的笼子中，在控制温度(约22°C)和相对湿度(40%-60%)的条件下，每天定时提供等量的食物和水。

2．2．药品和试剂

内标：L-2-氯苯基胺（CAS：103616-89-3）购自中国上海恒博生物科技有限公司。N，与1％三甲基氯硅烷（TMC）的O-BIS-三甲基甲硅烷基 - 三氟乙酰胺（BSTFA）购自美国雷丽斯科技公司。来自CanaviaLia Ensiformis（杰豆），III型，粉末的脲酶购自Sigma公司。比甲甲醛溶液购自Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. XFC由安徽中医药大学第一家附属医院提供（批号：2012100407，中国合肥市）。

2．3.仪器、设备

仪器设备如下:气相色谱仪:Agilent 7890A，美国Agilent;质谱仪:美国LECO Chroma TOF PEGASUS 4D;GL-20A全自动高速冷冻离心机(湖南仪器厂离心机厂);−80°C超低温冷冻机(三洋公司);37°C培养箱(湖北黄石医疗器械厂)。

２.４.佐剂性关节炎(AA)的诱导、治疗和测量

SD大鼠自适应地喂养一周。将所有大鼠随机分为三组：健康组，未经处理的组和XFC处理组，每组8只大鼠。确定未处理的组和XFC处理组，用单一的皮内注射0.1ml完整的弗氏佐剂（CFA）进入右后脑跖骨脚垫[13]健康组同时给予液体石蜡作对照。从注射CFA后第19天起，XFC（3 XFC治疗组每天灌胃一次，共30天。健康组和未治疗组大鼠给予0.9%生理盐水。收集12例尿标本 最后一次给药后h，保持在−80°C。使用两个不同的临床参数，足肿胀和关节炎指数（AI），评估XFC对AA大鼠的治疗效果。在免疫前（正常值，第0天）和最后一次给药后（第30天），用PV-200体积计（中国成都泰盟科技有限公司）测量左后爪的体积。继发性足肿胀()是用公式计算的， 在哪里和分别为建模前和建模后爪子的体积[14].对于AA的评估，关节炎的严重程度以四分制记录，其中0分表示无肿胀；1分表示精神肿胀；2分表示腕关节或踝关节轻度肿胀；3分表示整个关节和爪子严重肿胀；4分表示爪子强直或变形[15］．

2.5。组织学检查

在最后一次给药后12小时内处死所有大鼠。膝部取出并放入4％多聚甲醛溶液中。在使用常规光学显微镜染色的病理学后观察组织学变化。两种盲目的观察者通过细胞浸润，滑膜增殖，培训组和软骨侵蚀评估了软骨和骨破坏，使用以下评分系统：细胞浸润：0级，没有变化;1级，很少的焦点渗透;2年级，广泛的焦点渗透;和3级，大量渗透侵入胶囊，骨料形成;滑膜增殖：0级，不存在增殖;1级，具有两到四层反应性滑膜细胞的增殖温和;2级，增殖适度，有四层反应性滑膜，增加的有丝分裂活性，以及​​相邻的骨和结缔组织的温和或不存在的滑膜细胞侵袭; and Grade 3, proliferation was severe and characterized by invasion and effacement of joint space and adjacent cartilage, bone, and connective tissue; pannus formation: Grade 0, no changes; Grade 1, pannus formation at up to two sites; Grade 2, pannus formation at up to four sites, with infiltration or flat overgrowth of joint surface; and Grade 3, pannus formation at more than four sites or extensive pannus formation at two sites; cartilage erosion: Grade 0, no changes; Grade 1, superficial, localized cartilage degradation in more than one region; Grade 2, localized deep cartilage degradation; and Grade 3, extensive deep cartilage degradation at several locations [16］．

2.6。样品制备

尿液标本在室温下解冻并漩涡15 s，之后100μ将1.5%的尿液转移到1.5%的尿液中 mL Eppendorf管，随后为10 μ加入L的脲酶悬浮液(160 mg/mL水中)漩涡10 s。900μL甲醇和氯仿的混合物（3/1，vol/vol）和50 μ将L-2-氯苯基丙氨酸（0.2mg / ml）作为内标加入每个样品中，并涡旋10分钟，随后在4℃下以12,000rpm以12,000rpm离心10分钟。将上清液（约0.35mL）转移到新的2mL GC-TOF / MS玻璃小瓶中。浓缩收集的上清液，在真空浓缩器中完全干燥而不加热。80 μ加入L甲氧甲基胺盐，使代谢物混合密封后，37℃烘箱干燥2 h。然后加入100对干燥样品进行衍生化μL双 - （三甲基甲硅烷基） - 三氟乙酰胺与1％三甲基氯硅烷进入每个小瓶中。将混合物在70℃下在烘箱中搅拌1小时。孵育后，将样品再次涡旋1分钟，以制备GC-TOF / MS分析。

2.7。GC-TOF / MS分析

采用Agilent 7890气相色谱仪和Pegasus HT飞行时间质谱联用仪进行GC-TOF/MS分析。该体系采用DB-5MScapillary柱，包被5%的二苯基交联95%的二甲基聚硅氧烷(30 m × 250)μM内径，0.25μM膜厚度;J＆W科学，Folsom，CA，USA）。一个1 μL在不分裂模式下注射分析物的等分试样。用作载气的氦气，前入口吹扫流量为3ml / min，通过柱子的气体流速为20ml / min。将初始温度保持在50℃的1分钟，然后以10℃/ min的速率升至330℃，然后在330℃下保持5分钟。注射，转移线和离子源温度分别为280,280和220°C。电子冲击模式中的能量为-70eV。以全扫描模式获取质谱数据溶剂延迟366秒后，以每秒20个光谱的速率，范围为85–600 s

2.8。数据分析

LECO CORPORATION和LECO-FIEHN RTX5数据库的色度TOF4.3x软件用于原始峰值峰值，数据基线过滤和校准基线，峰值对齐，折折叠分析，峰值识别和峰值区域的集成[17]通过PCA、PLS-DA和OPLS使用DEMO（Umetrics AB，Umea，瑞典）分析得到的标准化峰值强度。数据由Spss 17.0版（Spss，Inc.，伊利诺伊州芝加哥）处理，统计分析采用Student's软件进行-测试。

3.结果

３．１．XFC对继发性足肿胀及关节炎指数(AI)的影响

灌胃给药前，与健康组相比，未处理组大鼠继发性足肿胀明显增多，关节炎指数().XFC治疗组的继发性足肿胀和关节炎指数与未治疗组相似。灌胃给予XFC 30天后，与未治疗组相比，XFC治疗组AA大鼠的继发性足肿胀较小，关节炎指数较低()该结果表明XFC可抑制AA大鼠的继发性炎症（表1）1）．

3.2.XFC对组织病理学的影响

HE染色，健康组滑膜细胞排列正常，滑膜无增生，无炎症细胞浸润，软骨无糜烂。未治疗组滑膜周围组织局部增厚，炎性细胞浸润伴松膜形成，关节间隙狭窄，部分软骨糜烂。XFC治疗组病理组织损伤程度不同程度低于未治疗组(图)1和2）．

3.3.尿液样本的总离子色谱图

健康组、未处理组、XFC处理组尿液样品的GC-TOF/MS TIC图谱如图所示3.以LeCo Fien RTX5数据库为基础，鉴定出约1166种代谢产物，用色度ToO 4.3X软件校正空白值，消除噪声，校正内标，鉴定出914种代谢物，横轴代表代谢物发生的时间；每个峰代表代谢物的相对峰。为了说明代谢谱的差异，进一步预处理GC-TOF/MS光谱并进行模式识别分析。

3.4。尿液样本的主要成分分析（PCA）

PCA是代谢组学研究中最常用的算法，使用SIMCA-P（Umetrics，Umea，Sweden）开发的软件处理GC-TOF/MS数据。大量复杂变量的同时比较通过三维映射程序进行降维，并通过分数图显示输出，分数图表示样本在多变量空间中的分布[18］．在PCA评分图(图4），来自每组的尿液样本没有完全分开，这需要进一步分析。

3．5．尿液样本偏最小二乘判别分析(PLS-DA)

由于PCA不能完全分离，所以采用PLS-DA分析来实现组间更大的分离，并加强代谢物的鉴定。PLS-DA使用Ctr(均值中心缩放)处理数据缩放转换模式，其中-及-轴表示第一和第二主分量。采用遗漏一交叉验证方法评估所建立模型的实际性能[19］．是模型解释的平方和（SS）的分数，表示模型适合度；是的分数预测的变化该组件的模型，其代表预测能力。使用交叉验证以评估模型的有效性后获得这些。在PLS-DA分析后，健康，未处理和XFC处理的组完全分开。和表明该模型拟合良好，具有可靠的预测能力(）， 我们获得了和，表明这两种PLS-RA模型均表现出良好的性能[20.]。结果如图所示5．

3.6.尿样的正交偏最小二乘鉴别分析（OPLS-DA）

OPLS-DA是一种正交校正模型，其中正交信号校正可以用不相关的正交变量信息滤除。该方法只保留了相关的正交变量信息，提高了识别精度。采用SIMCA-P软件进行OPLS-DA，最大限度地提高了不同组间模型的内部差异[21］．OPLS-DA使用Ctr (mean-centered scaling)处理数据规模转换模式-及-ax分别代表第一和第二原理组分。在OPLS-DA分析后，将每组中的尿代谢物聚集在一起。该结果表明AA大鼠的代谢模式显着改变，XFC干预会影响AA大鼠的代谢。结果如图所示6(一)和6 (b)．

我们从OPLS-DA获得了一个负荷图。每个点代表一个代谢物。靠近中心的点代表模型分类的微小差异，远离中心的点被认为对模型分类贡献更大。红色点代表我们测试中的九个潜在生物标记物。结果如图所示6 (c)．

3.7. 尿液样本的潜在生物标记物

OPLS-DA过滤出不相关的正交信号，因此获得了更可靠的潜在生物标志物。VIP是一个参数，总结了重要性-变量，两者都为和模型，称为变量对投影的影响，它估计OPLS-DA模型中使用的投影中每个变量的重要性。在给定的模型中，一个变量的VIP值接近或大于1可以被认为是重要的。VIP价值和学生价值-测试值用来反映代谢物的重要性。变量有VIP > 1和作为潜在的生物标记物，使用SPSS 17.0 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行进一步的统计分析。与健康组比较，观察到9种潜在的生物标志物()XFC治疗后，2,2-二甲基琥珀酸、非那黄酸、左旋多巴和1,4-二羟基-2-萘甲酸的水平显著改变(）．脱氢莽草酸、酒石酸、腺嘌呤、马尿酸和糖醛酸水平均有向健康组倾斜的趋势，但无显著性差异。结果如表所示2．

为了更好地可视化潜在生物标志物的变化，使用直观的统计图形创建了方框图，以描述几组定量数据的分布并比较它们的差异。方框的高度表示四分位范围，水平线表示中值，向上延伸一段距离螺纹末端向下的d表示最大值和最小值，如图所示7．

3.8。潜在生物标志物的相关网络分析

为了阐明潜在生物标记物代谢途径中的联系，我们使用病理生理学、生物化学、生理学和人类代谢组学数据库提供有关生物体代谢产物的定量和代谢信息。我们还参考了相关文献。九种潜在生物标记物涉及嘌呤代谢、脂肪代谢和代谢代谢、氨基酸代谢和能量代谢。因此，我们构建了一个潜在生物标记物代谢途径网络，如图所示8．

4.讨论

AA，T细胞介导的慢性炎症应激是在多种研究中使用的体内模型的良好确定，以研究RA的发病机制和鉴定潜在的治疗目标[22]灌胃给予XFC 30天后，AA大鼠的关节肿胀明显减轻()与模型大鼠相比，XFC对AA大鼠有中度的治疗作用。

代谢组学侧重于生物流体的变化，以表明生物系统的变化[23］．近年来，代谢组学已被用于分析代谢谱中的生物差异，以识别潜在的生物标志物。这些差异可以说明有机体在特定时间和特定环境中的整体功能。GC-TOF/MS、液相色谱-质谱和核磁共振是代谢组学常用的方法[24- - - - - -26]GC-TOF/MS具有多种功能，包括简单性、再现性、高分离效率、高灵敏度、标准光谱库和代谢组学中可量化的代谢物[27］．我们使用GC-TOF / MS，并发现了九个潜在的生物标志物。生物标志物主要涉及葡萄糖，脂肪，氨基酸和能量代谢途径。在XFC肠道施用后，在XFC处理组中显着改变2,2-二甲基琥珀酸，苯酰基琥珀酸，苯缩乳酸，L-DOPA和1,4-二羟基-2-萘甲酸的水平（）．脱氢莽草酸、马尿酸和糖醛酸水平有向健康组倾斜的趋势，但无显著差异。

研究表明自由基氧化损伤在类风湿性关节炎发病机制中起重要作用[28]内源性或外源性刺激可导致代谢异常，从而产生过量的活性氧。当氨基酸供应不足时，抗氧化酶的减少会导致促氧化剂/抗氧化剂之间的平衡紊乱[29］．这种不平衡最终在氧化应激状态下留下身体。反应性氧物种可损害DNA，脂质，蛋白质和其他生物分子，这可能导致能量代谢紊乱。然而，能量消耗也会产生酸性物质和过量的活性氧自由基，这进一步加剧了组织损伤并引起炎症。因此，氧化应激和炎症在RA中发挥着关键作用[30.］．

对AA大鼠尿液变化的代谢组学分析提高了我们对RA期间显著代谢变化的理解。马尿酸和非那黄酸是脂肪酸的次级代谢产物。在RA期间，线粒体中产生过多的氧自由基，从而加速脂肪动员，最终显著增加脂肪含量增加脂肪酸次级代谢物的水平。我们发现AA大鼠尿液中马尿酸和苯乙酰胆酸的水平较高，这意味着RA与脂质代谢功能障碍有关[31，32］．XFC治疗组的脂肪酸水平明显低于未处理的基团。母猪酸含量在XFC处理组中没有显着差异，但具有对健康组的趋势。该结果意味着XFC可以调节脂肪代谢并减少线粒体中的氧自由基产生。

左旋多巴是酪氨酸羟化酶产生的酪氨酸氧化产物。酪氨酸是苯丙氨酸的主要代谢产物，苯丙氨酸都是氨基酸。在RA期间，过度的氧化应激和炎症抑制氨基酸摄入或减缓其合成，从而影响关节软骨蛋白质的生成[31- - - - - -33］．未处理组左旋多巴水平低于健康组，表明氨基酸代谢中断。XFC治疗组左旋多巴水平高于未治疗组，提示XFC可调节氨基酸代谢，改善关节损伤。

未治疗组中观察到较低水平的酒石酸和较高水平的2,2-二甲基琥珀酸，这表明三羧酸循环（TCA）功能障碍可能是由于软骨细胞和软骨中代谢紊乱所致。2,2-二甲基琥珀酸是琥珀酸甲基化产物，琥珀酸是TCA中重要的代谢中间体。TCA是三种主要营养素（碳水化合物、脂质和氨基酸）的最终代谢途径。与未治疗组相比，XFC治疗组的2,2-二甲基琥珀酸水平显著降低。这些变化表明XFC在TCA中起着调节作用。

1,4-二羟基-2-萘酸是一种芳香氨基酸，是多种酶的产物，参与泛素酮等萜类和醌类生物合成。1,4-二羟基-2-萘酸在未处理组中较低，可能是由于氧自由基过多，导致泛素酮生成增加，氧化磷酸化增强。这些变化导致更多的ATP [34].与未治疗组相比，XFC治疗组的1,4-二羟基-2-萘甲酸水平较高，表明能量代谢得到改善。

糖醛酸二糖由半乳糖和葡萄糖组成。水苏糖不仅可以分解为糖醛酸二糖，还可以产生甘露糖增强免疫物质[35]，这改善了与预防研究一致的抗争性的免疫力[36］．在类风湿性关节炎期间，半乳糖代谢异常导致糖醛酸二糖和甘露糖水平降低。XFC组糖醛酸水平较高，提示XFC可调节紊乱的半乳糖代谢和免疫系统，减少炎症。我们发现AA大鼠尿液中脱氢莽草酸的浓度低于正常对照组。尿脱氢莽草酸异常通常被认为与糖酵解途径和戊糖磷酸途径的障碍有关。莽草酸具有抗炎、镇痛和抗病毒作用，与文献一致[37]XFC治疗组的蜜二糖和脱氢莽草酸水平无显著差异，但有向健康组倾斜的趋势，提示XFC可能对调节糖代谢紊乱、增强抗炎能力有一定作用。

酒石酸被转化成β-丙氨酸是辅酶a的一种成分，在TCA中起重要作用。腺嘌呤可在RA期间生成尿酸；腺嘌呤水平升高导致尿酸水平升高，从而加重软骨损伤。此外，腺嘌呤参与的辅助因子包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。这些化合物被呼吸链逐渐氧化生成ATP。我们假设氧化应激导致线粒体功能能力降低，从而导致能量代谢紊乱[34].我们的结果表明，XFC治疗组的酒石酸和腺嘌呤水平没有显著差异，这意味着XFC没有调节它们进行治疗。

5.结论

采用GC-TOF/MS代谢组学方法，全面、有效地阐明AA大鼠代谢物的变化。使用多种多元统计方法，如PCA、PLS-DA和OPLS-DA，确定了9种潜在的生物标志物。这些生物标志物主要与嘌呤代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢和能量代谢有关。

服用XFC后，小鼠体内2,2-二甲基琥珀酸、非乙酰酸、左旋多巴和1,4-二羟基-2-萘酸水平均发生显著变化(）．脱氢莽草酸、马尿酸和糖醛酸水平无显著差异，但有向健康组倾斜的趋势。这些结果表明，基于GC-TOF/ ms的尿液代谢谱可以提供可靠的结果，可用于现代中医药研究。该技术在鉴别治疗类风湿性关节炎的有效化合物方面具有潜在的应用价值。

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

致谢

该研究得到了国家科技支持计划（2012Bai26B03）的财务支持。作者感谢Junliang Deng博士（中国上海Biotree Bio-Technology Co.，Ltd.）提供有助于数据分析。

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