文摘
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,其特征是生产各种自体抗原抗体包括核酸。这些抗体的细胞毒性,催化(水解DNA、RNA和蛋白质)和nephritogenic。当前方法研究天然抗体酶催化活动由个人患有自身免疫主要是不连续的,经常使用危险试剂。我们演示dual-labeled的效用,fluorogenic水解DNA探针在非常具体的,敏感的,连续的,荧光技术测量DNA水解活性anti-ssDNA抗体酶纯化血清的病人患有系统性红斑狼疮。存在的试验,抗体水平表现出水解活动可以促进疾病诊断、预测耀斑,监测疾病的状态,和对治疗的反应。分析可能允许间接识别额外的目标anti-DNA抗体分子的发现抑制他们的活动。相结合,这些方法可能会提供新的见解狼疮发病的分子机制。
1。介绍
系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性、多因子的,抗原驱动,系统性自身免疫性疾病,通常提供了一个广泛的临床实体。系统性红斑狼疮的特点是生产一批inflammation-inducing自身抗体的免疫球蛋白和IgM同形像针对核抗原,包括单链(ss)和双链DNA (ds)。高滴度的抗体类都参与了疾病的发展和与耀斑(1- - - - - -4]。效价的物种可以区分狼疮患者和健康的捐赠者和监测患者在耀斑和不活跃的疾病(5- - - - - -9]。因此,anti-DNA病人血清抗体水平是用于监控疾病活动和发展10- - - - - -12]。然而,根据Shoenfeld et al。(1988),尽管浓度变化很大,anti-DNA抗体总是在所有健康的哺乳动物的血清检测(13]。另外,量化抗体效价的方法可以产生极大的不同结果相同的血清样本(5)和简单的测量anti-DNA抗体的效价不提供详细信息抗体功能或潜在的致病性。分析抗体水解活动,除了监控效价,可能让医生更好地预测疾病的变化周期以及研究人员阐明疾病的潜在角色抗体酶的延续。
尽管复杂的biosensor-based技术(14)已经开发了简单的检测存在的混合物anti-ssDNA和anti-dsDNA直接从系统性红斑狼疮患者的血液抗体水平,分析系统检测水解活性anti-DNA自身抗体仍主要在电泳级别。大多数发表的方法分析anti-DNA抗体是不连续的水解活性,费力,和危险,经常使用放射性物质和/或致癌染料。在大多数情况下,这些化验不适合自动化和反应动力学的研究(15- - - - - -20.]。Gololobov et al。21)在连续取得了迄今为止唯一的尝试,动力学分析anti-dsDNA抗体水解活动使用的流线性dichromism技术(盛名)。
相反,研究酶水解DNA(各种DNAases)提供了自动化的DNA定量测定水解。现代方法分析DNAse活动范围从荧光技术置入(染料和荧光标记分子beacon-based技术)电喷雾电离质谱(22- - - - - -25]。方法分析自身抗体activity-abzymes在狼疮患者应该比赛水平的敏感性和缓解DNAse我,典型的控制标准,进行了分析。为了设计出一个更新的方法测量抗体酶的活动,我们调查的效用dual-labeled, fluorogenic水解探针作为连续测量的底物的催化活性和抗体酶活动DNAse相比我控制。
Anti-dsDNA抗体被发现在70 - 90%的系统性红斑狼疮患者和被认为是红斑狼疮疾病的标志。然而,我们选择调查anti-ssDNA抗体,在30 - 70%的患者,根据数据表明它们水解,nephritogenic,可以作为强大的预测耀斑(3,4,26- - - - - -28]。anti-ssDNA抗体在系统性红斑狼疮的重要性进一步支持的数据表明他们仍然出现治疗后免疫抑制治疗,消除anti-dsDNA抗体,调查在nephritogenic狼疮小鼠模型中只有anti-ssDNA抗体被发现,并发现一些anti-dsDNA抗体不致病6,7,19,27,29日,30.]。
总之,我们的基本前提是(1)anti-ssDNA抗体产生的正常血清捐赠者和那些由狼疮患者可以分化基础上是否说明水解活动;(2)这些抗体可能的临床意义和可能是有用的在促进狼疮疾病的诊断;(3)可以使用水解探针是否纯化抗体可以分裂DNA。一个试验,利用水解探针提供一个减少危险和艰苦的方法比目前使用的。此外,它提供了一个更敏感的平台符合当前可用的技术分析DNA水解酶。
2。材料和方法
2.1。样品收集
血清分离从新鲜全血,静脉注射来自健康、正常的捐助者(ND)和狼疮患者(LP)知情同意和协议的指导下佛罗里达大西洋大学的机构审查委员会批准(ref ho5 - 278)。血清被差速离心收获,能整除的为1毫升核糖核酸酶/ DNAse-free管,储存在−抗体纯化前20°C。
2.2。净化Anti-ssDNA抗体的结合特异性保利- (dT)低聚物
自然,多克隆anti-ssDNA和约束力的特异性抗体的免疫球蛋白g同形像购买益生元- (dT) 20-mer目标孤立使用两步净化方法,之前开发的房子(7),它允许有效隔离的完整的目标分子。简单,该方法是基于抗体亲和的胸腺嘧啶(T5)和隔离的能力总免疫球蛋白G蛋白涂层的使用磁dynabeads (Dynal生物技术,现在表达载体的一部分,卡尔斯巴德,CA,美国)。费力大大低于之前的协议,这方法产生抗体的无与伦比的纯洁如证实在毫微克级灵敏度通过sds - page和银染色。也温柔足以允许进一步功能分析这些蛋白质,容易变性在恶劣条件下。纯化抗体储存在−20°C存储缓冲区组成的25毫米Tris-HCl和50%的甘油,pH值7。
2.3。确认抗体纯度
抗体纯度确认所述Pavlovic et al。7]nonreducing sds - page和银染色使用淀粉微球与PhastGel PhastSystem梯度凝胶4-15分离,全程彩虹PhastGel缓冲条,分子量标记(通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西;用户手册没有分离技术文件。130)。
2.4。抗体量化
浓度的纯样品测定中描述Pavlovic et al。7)由皮尔斯微BCA试验(热费希尔科学/皮尔斯化工有限公司,罗克福德,,美国),修改后的酶联免疫试剂盒开发的房子。ELISA使用ssDNA衬底低聚糖的形式——(dT) 20-mer(欧陆坊MWG操纵子,亨茨维尔,美国)绑定到链霉亲和素微型板块(美国罗氏诊断,印第安纳波利斯)与4-parameter曲线拟合模型量化,这是纳入SpectraMax 190标使用的软件(分子器件、LLC桑尼维尔,美国)。连续稀释净化人类anti-DNA与人类免疫球蛋白抗体比较标准。
2.5。抗体的分类
免疫球蛋白同形像确认所述Pavlovic et al。7)通过免疫印迹,也使用PhastGel系统,HRP-labeled山羊反二次抗体和三甲衬底(PhastSystem开发技术文件。220)。
免疫球蛋白的1,免疫球蛋白2,免疫球蛋白3,免疫球蛋白4子类使用商业酶被确认,人类免疫球蛋白子类概要酶联免疫试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) [31日]。
2.6。探针设计
探测器获得的设计是基于序列偏好数据Gololobov et al。15)和x射线晶体数据发布的坦纳et al。32]。根据Gololobov水解研究anti-ssDNA鼠单克隆抗体BV 04-01, anti-ssDNA抗体更喜欢碳碳地区ssDNA [15,27]。坦纳et al。32]表明,序列识别,绑定到目标DNA,和协调的活性部位发生在胸腺嘧啶重复序列的研究小鼠单克隆anti-ssDNA抗体。探针设计还占在丰富的序列偏好DNAse我15,27,32]。以下dual-labeled fluorogenic寡核苷酸(18-mer)探针(欧陆坊MWG操纵子,亨茨维尔,美国)是专为连续的,荧光技术分析DNA水解活性的纯化anti-ssDNA抗体与结合特异性低聚糖- (dT) 20-mer: 5′6-fam-atatagcgc5T5-DQ1-3′。
2.7。抗体水解活动的确认
连续之前,荧光技术分析、水解能力anti-ssDNA抗体纯化的系统性红斑狼疮患者血清经安捷伦2100实验室芯片数字分析DNA7500微芯片(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。水解的党卫军鲱鱼精DNA(通过快速加热和冷却)anti-ssDNA系统性红斑狼疮抗体相比,由商业DNAse我积极控制水解(美国应用生物系统公司、奥斯汀、TX)。平行DNAse我和anti-ssDNA抗体反应分析了37°C在单独的反应缓冲区组成的25毫米Tris-HCl MgCl 50 mM氯化钠,10毫米2pH值7.5和22毫米Tris-HCl 5毫米MgCl2,0.5毫米CaCl2分别,pH值7.5,为了满足需求的每个实体Odintsova发布的数据等。33]。酶底物比例是1:2 (1μg蛋白质= 1单位DNAse我)和样本加载量的10μl
2.8。确认DNAse我和抗体酶水解能力设计探针序列
乳沟的低聚糖18-mer水解探测器首次分析了紫外分光光度法(A260)证实的能力和DNAse我控制系统性红斑狼疮抗体与刚愎自用探针序列。系统性红斑狼疮抗体与抗体纯化相比也从正常健康的捐赠者在这个实验中。红斑狼疮抗体或DNAse我结合探测器优化酶底物比率1:0.45和1:2,分别在同一部分中指定的缓冲区截然不同的反应2。7。反应总额是200年μL与最后一个探针浓度为1μ克/毫升。DNAse试验进行了37°C。紫外光谱法进行抗体样品在4°C的环境中,一个温度DNAse我是不活跃的。总共四个狼疮病人血清样本和四个正常健康的捐赠者血清样本分析了水解能力的初步确认。
2.9。实时、连续,荧光技术水解试验
五试验anti-ssDNA狼疮抗体,抗体正常健康的捐赠者和控制DNAse我反应是运行样品装入一式三份在同一节中指定的缓冲区截然不同的反应2。7。黑色的平底,聚苯乙烯96微量滴定板(MTX实验室系统,维也纳,弗吉尼亚州,美国)被用来防止交叉污染。购买冻干水解探针在1 x重组反应缓冲区。水解探针结合DNAse我,LP anti-ssDNA抗体,抗体和ND anti-ssDNA生产最终酶底物的比率1:2、1:0.45,和1:0.85,分别在样本反应混合物总量为200μL最后探针浓度的1μ克/毫升。探针水解测定使用Finstruments Fluoroskan II板读者(MTX实验室系统,维也纳,弗吉尼亚州,美国)的灵敏度范围pmol -μ摩尔和DeltaSoft3软件。样本阅读从上到下一个8小时化验在37°C在485纳米荧光激发和发射检测在538 nm (FAM是读FITC由Finstruments技术支持)。动态测量进行每2分钟30分钟DNAse我和抗体每5分钟超过8小时。结果报道在绝对荧光单位。
2.10。统计分析
一式三份绝对荧光数据平均在每个时间步。单向方差分析(方差分析)应用到每个数据集,DNAse我和anti-ssDNA抗体,对控制(益生元)来测试是否有显著性差异(α= 0.05)发生或荧光强度,水解的代理。时间步长(5分钟和1小时,职责。)被视为重复措施。除了都是低聚糖控制相比,红斑狼疮的荧光抗体也比正常的供体荧光抗体与方差分析。
3所示。结果
孤立anti-DNA抗体的纯度是由nonreducing sds - page和银染色。银染色与毫微克水平的敏感性检测显示一个明显的单一乐队与分子量匹配在狼疮患者免疫球蛋白和两个乐队150 kDa兆瓦的健康或正常控制血清(图1)。免疫印迹分析证实,乐队出现在免疫球蛋白的蛋白质同形像(图2),子类通过ELISA分析证实存在的四个人类免疫球蛋白子类净化材料(7,31日]。
安捷伦2100实验室芯片技术的分析证实了水解活性的系统性红斑狼疮anti-ssDNA抗体。结果显示水解的党卫军鲱鱼精DNA(500个基点核苷酸)核苷酸较小MW (25-35-50 bp)通过单独添加DNAse我和系统性红斑狼疮anti-ssDNA抗体反应混合物中描述的部分2。7(数据3(一个)和3 (b))。
(一)DNAse我
(b)狼疮anti-ssDNA抗体
紫外分光光度法证实DNAse我和水解的能力从狼疮患者抗体结合,打通设计探针序列。紫外分光光度法也证明anti-poly——(dT)具体ssDNA抗体纯化从正常血清没有水解探针(数字4(一)和4 (b))。初步分析这四个狼疮病人血清样本(LP) 1 - 4)和四个正常捐赠1 - 4 (ND)和血清样本产生的结果符合安捷伦的分析结果和先前的研究已经表明,狼疮anti-DNA抗体水解DNA正常anti-DNA抗体不(6,15,17,20.]。
(一)DNAse我和狼疮anti-ssDNA抗体
(b)红斑狼疮和正常anti-ssDNA抗体
水解活性DNAse我和纯化anti-DNA抗体被连续下测量,荧光技术水解试验(数字5和6)。DNAse我反应最大值达到15分钟,反应在30分钟,完成(图5),而慢的抗体反应在8小时内完成(图6)。
水解活性保持抗体存储缓冲区使用,25毫米三,50%的甘油,pH值7−20°C,在分析通过紫外分光光度法,DNAse我和狼疮抗体水解探针序列。活动明显区别anti-ssDNA抗体纯化的红斑狼疮患者血清和正常血清也被不同程度的荧光输出连续,荧光技术水解(图的分析6)。
空白的缓冲控制,它不包含探测器,不发出荧光。在数据可视化5和6,基线水平的背景荧光观察由于不完全淬火控制样本包含探测器没有酶。此外,增加荧光产生的背景之上uncleaved探针在样品含有抗体纯化从正常捐赠血清。然而,随着这些正常样本的荧光水平随时间保持不变,我们假设自然荧光蛋白质的增加导致了这个整体荧光输出。尽管如此,样品含有探针水解DNAse我和系统性红斑狼疮抗体显示大幅增加总荧光输出(意思=)高于基线水平由探针(意思=)或样品含有探针和抗体纯化从正常健康的捐赠者(平均= 1.07)。
这半定量的测量表明,DNAse我,在它的最优比例,比抗体显示更快的活动(在30分钟达到的峰值3.721个单位。在180分钟和2.277单位。抗体)(图7)。动力学参数没有测量这个时候因为这个最初工作的主要目标是建立方法;然而,这明显不同的反应时间和峰值表明它们是两个不同的实体。DNAse之间的区别我和狼疮anti-ssDNA反应资料结合的差异反应混合物(协调人要求),反应时间(30分钟。对8小时。)和温度(4°C和37°C)(表1)。
4所示。讨论
使用dual-labeled, fluorogenic作为测量anti-DNA抗体水解底物水解调查活动的灵感来自于荧光共振能量转移(FRET)原理及其应用在实时PCR (34]。有许多参数影响分析。分子标记底物的漂白可能发生的反应抗体和DNA之间的时期,这是一个缺点的方法31日]。尽管如此,水解探测器的使用被认为是比使用致癌,可能产生负面影响的插层染料的亲和力和水解DNA抗体。
坦纳et al。32)展示了特定的绑定anti-DNA抗体胸腺嘧啶聚合物通过精氨酸组使用x射线分析。精氨酸组负责序列识别和胸腺嘧啶的抗体结合DNA重复序列(5-mer)通过酪氨酸侧链疏水口袋内由酪氨酸和色氨酸在抗体结合位点(15,27,30.]。而亲和力的抗体探针序列可能是增强由于家人的存在和DQ1标签,我们最初的目标是确定是否存在与否的水解能力可以使用这种方法。如果增强亲和力,标签应该影响狼疮和正常的样品;然而,我们仍然看到这些实体的水解能力的差异对标记探针相比他们的活动。另外,因为我们的调查18岁基地长度(淬火)为了满足要求,它只会绑定到单个抗体活性部位(19),从而允许个人水解的监控事件的特定序列的和有针对性的分析。盛名的方法,这是唯一的其他连续方法分析DNA水解抗体目前活动发布,需要使用更长的聚合物(21]。
我们实验室以前发表的一本小说,两步方法净化自然,多克隆,anti-ssDNA抗体免疫球蛋白g同形像具体的购买益生元- (dT) 20-mer目标(7]。该方法是基于anti-ssDNA抗体亲和力的胸腺嘧啶(T5Tanner)证明了et al。32)和隔离的能力总免疫球蛋白与G蛋白涂层磁性dynabeads的使用。Streptavidin-coated dynabeads,孵化与biotynilated益生元- (dT) 20-mer洗,然后孵化期间与血清净化的第一步。的珠子是洗前多次洗脱绑定材料。在第二次净化步骤,然后孵化洗出液蛋白G珠子之前洗和洗脱。
这种方法产生了高度纯抗体证实纳克级别的敏感性通过sds - page和银染色和被证明是免疫球蛋白同形像展示在我们之前出版。我们认为这可能nonantibody蛋白质绑定特异性保利- (dT) 20-mer也一直受到蛋白G和显示水解活动对另一个序列之前显示的水解目标anti-ssDNA抗体(15]。由于这些原因,我们认为没有必要再并入净化过程进一步治疗摧毁潜在污染酶(例如,“酸休克”(21]),还可以改变抗体结构,因此功能。我们的方法是温柔,很快速,容易执行相比以前的方法。虽然相比收益率低净化方法所使用的类似Gololobov et al。21),可以增加产量增加珠子的数量;但是,水解试验,我们已经开发出了可以执行与大幅less-purified抗体比盛名的使用的分析方法(21]。潜在的DNA衬底的水平在我们的分析范围从0到1000 ng / mL。这个范围包括从健康的病人的血液中发现DNA和寡核苷酸含量很低(在10-40 ng / mL)的范围,范围在狼疮患者显示水平接近400 ng / mL [33]。
高纯度的水解活动anti-ssDNA从狼疮患者抗体,检测催化免疫球蛋白在其他自身免疫性疾病,如桥本甲状腺炎和多发性硬化症,暗示这些抗体在自身免疫性疾病发病机理31日,33,35]。狼疮anti-DNA抗体演示能力渗透活细胞通过受体如肌凝蛋白,我进入细胞核,触发细胞死亡在体外。水解anti-DNA抗体可能维持和延续疾病在渗透的细胞核DNA水解(36- - - - - -42]。未来的分析应包括细胞毒性研究和fluorescence-aided跟踪纯化,自然水解获得的抗体和调查所描述的方法。
开发的方法在我们的实验室提供一个平台,调查潜在的预后的作用水解anti-ssDNA抗体在耀斑。此外,分析抗体水解活动可以帮助在疾病诊断和促进疾病状态的监控/周期和对治疗的反应。水解的试验还允许间接鉴定致病性的目标anti-DNA anti-DNA抗体的抗体和抑制剂的活动。修改两步纯化过程和水解探针序列,这些分析可以用于调查dsDNA抗体(显示偏好c g地区(27]),抗体活性对短病毒序列的潜在兴趣红斑狼疮(例如,细小病毒B19, HSV, EBV基因序列(6,43),或任何用户定义的序列,以及抗体同形像的比较和子类与狼疮疾病有关。相结合,这些方法不太苛刻,更少的危险,更快速,同样或更具体的比现有的方法进行纯化和分析DNA水解抗体。
这里我们已经表明,水解探针可用于无毒害,连续测量DNA水解活动内在净化anti-ssDNA人口由系统性红斑狼疮患者的抗体。我们还表明,当这种方法,分析了这些系统性红斑狼疮抗体与DNAse我基于反应需求区分开来,速度和持续时间,不能区分anti-ssDNA抗体产生的正常捐助者基于存在与缺乏水解活动。进一步的工作将包括动力学分析使用动力学参数的探测方法和量化为anti-dsDNA红斑狼疮患者抗体已经完成Gololobov et al。21]。
缩写
| 阿瑟: | 抗体 |
| 6-FAM: | 6-carboxyfluorescein |
| DQ: | 黑暗的冷却器 |
| ds: | 双链 |
| EBV: | 巴尔病毒 |
| ELISA: | 酶联免疫吸附试验 |
| 烦恼: | 荧光共振能量转移 |
| HSV: | 单纯疱疹病毒 |
| LP: | 红斑狼疮病人 |
| ND: | 正常的捐赠 |
| ss: | 单链 |
| 系统性红斑狼疮: | 系统性红斑狼疮。 |
信息披露
本文的作者没有直接金融与本文中提到的任何商业身份的关系。佛罗里达大西洋大学申请美国临时专利申请60/659,882(实时荧光测定anti-DNA水解活动)3/10/2005这项工作。3/10/2006暂行过期并被纳入一个新的美国临时专利申请,61/445,160(成分、方法和工具分析水解抗体检测,预测,和治疗水解antibody-related疾病),提交2/22/2011也因为过期。大学和工作小组已不再追求这些方法专利。
确认
这项研究是由私人捐助者提供的资金支持。病人样本提供的博士Ira Pardo风湿病Associates的南佛罗里达州波卡拉顿,FL,美国。作者想表达自己的真诚感谢谢莉尔·r·范德Heiden援助与统计分析和编辑。