系统性红斑狼疮的生殖免疫学筛选试验

摘要

在生殖年龄的女性患者系统性红斑狼疮和生育并发症一起被风湿病学家，妇科医生，和生殖免疫学家观察。这篇论文指出了对透明带、磷脂(磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、膜联蛋白V、β -2糖蛋白I和心磷脂)的自身抗体和对精子细胞的同种抗体的存在。对精子细胞的同种抗体没有显著优势，但对磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、心磷脂和β -2糖蛋白I的IgG阳性以及抗透明带抗体在IgG同型中表达良好。根据自身抗体的水平，我们必须选择预防性治疗来保护母亲和胎儿。

1.介绍

虽然自身免疫性疾病(艾滋病)一般不被认为是生殖能力受损的主要原因，但一些艾滋病与不孕症或妊娠损耗有关。自身免疫性疾病可能影响生育的各个阶段，从卵巢到着床失败和妊娠失败。系统性红斑狼疮(SLE)是影响育龄妇女最常见的自身免疫性疾病之一。SLE在欧洲的患病率与美国相似，为3.3 - 4.8 / 100.000人年[1］．

SLE的典型临床症状包括疲劳、发热、关节炎、光敏性皮疹浆膜炎、雷诺现象、肾小球肾炎、血管炎和血液学异常。尽管SLE患者的生育能力与一般人群中的女性一样，但她们的怀孕可能与并发症有关[2］．活动性疾病或慢性肾衰竭发作期间，使用非甾体抗炎药(NSAIDs)、大剂量皮质类固醇或环磷酰胺时，月经不规律和无排卵周期可能影响生育。

一些研究已经描述了SLE妇女高达45%的胎儿丢失率[2］．另一个并发症可能是体内受精和胚胎移植后植入失败或胎儿发育受损。

与SLE相关的自身抗体种类繁多。有些抗体有助于诊断疾病，而另一些抗体则更有助于检测和监测疾病活动或潜在并发症。针对天然双链DNA (dsDNA)的抗体对于SLE的诊断是相对特异的。血清抗核抗体(ANAs)在几乎所有活动性SLE患者中都能发现。评估谱可提取核抗体(Sm, La, Ro)、核糖核蛋白抗体(RNP)、补体和n -甲基- d -天冬氨酸受体(ENA)对SLE诊断有重要意义。

抗磷脂抗体(apl)形成了一个大的抗体组，在SLE以及其他自身免疫性疾病患者中检测到。这些抗体与怀孕期间广泛的潜在并发症有关，包括流产、胎儿死亡、宫内生长受限、早产和子痫前期——特别是在原发性抗磷脂综合征(APS)中。

对于SLE妇女，最好在疾病稳定和肾炎缓解期(至少6个月)怀孕。风湿病学家、产科医生和新生儿学家的密切合作是成功怀孕和分娩的必要条件。在满足这些先决条件的情况下，仍有大约5%的SLE女性有生育或怀孕问题[3.］．

生殖方面的并发症常常是进行彻底免疫学检查的原因之一。我们在此从生殖免疫学的角度介绍我们对SLE患者的经验。

2.目标

本文的一般目的是评估育龄期SLE妇女生殖免疫学筛选试验的结果。主要目的是调查系统性红斑狼疮患者在缓解期计划怀孕期间对透明带和八种不同磷脂的自身抗体和对精子细胞的同种抗体的发生情况。

3.主题

研究组包括52名女性SLE患者(平均诊断时间)年;平均年龄18-42岁)，转到捷克共和国皮尔森查尔斯大学和学院医院妇产科不孕不育和生殖免疫特别科进行怀孕计划。所有患者均符合修订后的SLE诊断标准[4］．所有患者在研究检查期间和尝试受精期间均处于缓解状态，无急性肾炎或严重肾功能损害。所有患者均未接受每日剂量超过10 mg的皮质类固醇(免疫抑制药物)治疗，只有3例患者在服用硫酸羟氯喹(血小板)药物。所有患者在我科检查治疗前均经内分泌科、妇科检查，并进行遗传会诊。以下已知影响生育能力的激素检测未发现实质性病理:卵泡刺激素、黄体生成素、孕酮、雌二醇、催乳素。在我们的测试之前，研究组有38名女性发生了妊娠丢失。

对照组包括25名年龄匹配的健康育龄妇女(平均年龄24-43岁)）.所有的对照受试者都成功怀孕并自然生育了两个健康的孩子，他们在我们检查之前有规律的性交和月经周期，并且没有使用激素避孕药。该研究由皮尔森查尔斯大学医学院医院的当地研究伦理委员会批准，并获得了所有参与者的书面知情同意。

4.方法

检测透明带自身抗体、八种磷脂(磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、dl -甘油、磷脂酸、膜联蛋白V、β -2糖蛋白I和心磷脂)和精子细胞的同抗体如下所示。

两组都用-方差相等检验。在研究组和对照组中，每项免疫试验的百分比均独立计算，在适用的情况下，使用标准比值比公式分析抗体发生情况。

4．1.血清精子抗体(ASA)

我们进行了托盘凝集试验(TAT) [2]和间接混合凝集试验(i-MAR)，根据以前公布的血清ASA检查指南[3.］．TAT测试作为初步筛选检查。研究对象的血液通过静脉穿刺收集到真空管中并离心。分离的血清通过加热(56°C 30分钟)灭活，并在−20°C保存直到分析。我们通过添加5来进行TAT测试μL，几何稀释血清和1μL(40·10)⁶/mL)，用“游泳技术”分离到石蜡覆盖的微室。37℃孵育2 h后，在200倍放大的倒置显微镜下评估免疫反应。精子细胞在稀释至少1:64时凝集被认为是阳性结果。

采用i-MAR试验分析IgG和IgA组的抗精子反应。一微升天然精子悬液，1μL和1μ将戊二醛固定绵羊红细胞经人IgG和IgA预包被后混合。然后,1μ加入相应的抗血清抗igg和抗iga(德国汉诺威Behringer)的L。最后用盖玻片覆盖，在潮湿的培养皿中孵育5-10分钟。在200倍放大的倒置显微镜下观察精子凝集反应结果。如果超过49%的活动精子参与混合凝集物(精子和绵羊红细胞被相应的免疫球蛋白包裹)，则i-MAR试验被认为是阳性。

4.2。宫颈排卵黏液中的精子抗体

我们使用排卵后5天用特殊注射器注射的宫颈粘液来保护排卵期间的性交。精子毛细血管渗透试验作为筛选试验，i-MAR试验检测精子局部的IgG和/或IgA抗体[4］．

4．3．透明带抗体

采用经典ELISA法(Laboserv)检测同型IgG和IgM的透明带抗体。

4．4.抗磷脂抗体(aPL)

ELISA检测抗磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、dl -甘油和磷脂酸的aPL。酶联免疫吸附试验(ELISA):聚苯乙烯微量滴定板涂50μL磷脂(50μL/mL甲醇)，置于4°C干燥过夜。然后用含10%胎牛血清(FCS)的溶液在1 M TRIS缓冲液(tbs - 250mm TRIS, 1.5 M NaCl)中室温封闭30分钟。随后，用结合缓冲液(Na₂有限公司_3.,NaHCO_3.,南_3., pH值9.6)。

将患者和对照组的血清，在含10% FCS的TBS中按1:50稀释后加入到洗井中。室温孵育2小时，然后用含0.05% Tween 20的TBS洗涤5次。加入过氧化物酶偶联的抗人免疫球蛋白(IgG, IgA, IgM) 50微升，室温孵育1小时。然后这些盘子在TBS Tween中被洗了五次。每孔加底物溶液50微升，室温黑暗孵育30分钟。加50就停止了反应μL的2米硫酸。使用Titertek MultisKan MCC/340 (Flow Laboratories, London, UK)在492 nm处测定每个孔的光密度。所有患者的血清在相同的微滴度板上以1:50稀释，涂布甲醇，但不含磷脂。用于包被酶联免疫吸附测定板的磷脂为:磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、dl -甘油和磷脂酸(Sigma, St.Louis, MO, USA)。

血清的检测和量化antiannexin V (Szabo-Scandic韩德尔GMBH & Co KG,维也纳,奥地利)商业用ELISA试剂盒,以及检测的免疫球蛋白和IgA抗体beta2-glycoprotein我(beta2GPI) (Immunotech、布拉格,捷克共和国),心磷脂水平免疫球蛋白和IgM(米莱尼亚、伦敦、英国)(表1）.使用Statgraphics软件进行统计分析，以获得超过3个标准偏差(SDs)的apl Ig同型的临界值。

5.结果

由于方差相等检验证明两组在年龄上相似(作为一个独立的基线特征)，我们能够评估个体抗体流行百分比如下:除抗磷脂酰肌醇IgM和抗磷脂酰丝氨酸IgM外，试验组中所检测抗体的非零患病率均高于对照组(分别为3.8%对4.0%和3.8%对8.0%)。研究组和对照组抗精子抗体(ASAs)优势仅在血清ASA (9.6% vs . 4.0%，比值比2.55,95%可信区间0.28-23.10)和宫颈排卵黏液ASA (11.5% vs . 4.0%， OR 3.13, 95% CI 0.36-27.52)中具有象征性和无统计学意义。抗透明带(aZP)和抗磷脂(aPL)抗体的IgM亚型在所有试验中均无显著差异。然而，在aZP IgG亚类中，研究组的差异显著(52名受试者中有12名，占23.0%，而25名受试者中为零)。除抗磷脂酸IgG和抗磷脂酰甘油IgG外，几乎所有IgG同型的aPL抗体都是如此(详细结果见表)1用粗体脚本标记重要值)。尽管我们在对照组的两名患者中检测到抗心磷脂IgG阳性(不像本研究中的任何其他IgG)，但两组之间的患病率差异(研究组为30.8%，对照组为8.0%)仍然具有统计学意义(优势比5.11,95% CI 1.07-24.33)。

6.讨论

怀孕是免疫规则的最重要的例外，母亲的身体不仅容忍，而且广泛支持半异体胚泡，胚胎和胎儿。母亲和胎儿滋养层之间复杂的免疫调节机制提供了显著的耐受。这种耐受性的失败是胎儿丢失的最常见原因之一。正如在许多论文中提到的，生殖失败，包括复发性妊娠损失(RPL)和不孕都与各种自身抗体的存在有关[5］．

在SLE以及其他自身免疫性疾病中，自身抗体的过量产生被描述，特别是针对器官非特异性抗原。这一特征是基于b细胞对抗原、核酸及其结合蛋白的耐受性丧失。在环境因素(感染、药物、毒素、吸烟和激素因素)的影响下，抗核抗体可以触发基因易感个体的自身反应性淋巴细胞的增殖，导致它们对更多的核抗原或其他结构(血液元素，血浆成分、凝血因子和补体级联)[5］．在多种促炎细胞因子和趋化因子的作用下，炎症细胞迁移到靶器官，激活其效应机制，在慢性体液成分的帮助下引起慢性炎症。

我们研究的目的是评估SLE患者中可能导致免疫生殖失败的各种抗体的发生情况，并将这些结果与健康对照组的结果进行比较。

许多回顾性和前瞻性研究已经证实了抗精子抗体在各种体液(血清、精液、宫颈排卵黏液、卵泡或腹膜液)中对男女生育能力的影响[6］．ASA由于降低精子活力而影响精子在女性生殖道内的运输机制，可能改变精子获能或顶体反应，可能干扰卵子受精，或对受精卵和着床前早期胚胎有受精后作用[6］．

很明显，重复的精子暴露不足以使大多数女性开始产生抗精子抗体。其他因素，如机械、化学或女性生殖系统粘膜炎症病变也起着重要作用[7］．特别是SLE妇女，免疫抑制治疗可能影响生殖道感染的可能性。CMV, EBV病毒和沙眼衣原体SLE患者感染可能导致不孕[8，9］．

我们确定两组的抗精子抗体(ASAs)来评估差异。与上述事实对比，我们发现研究组和对照组的抗精子抗体患病率没有显著差异。我们从对照组获得的流行率数据与生殖能力未受干扰的健康女性中存在这些抗体的证据一致(几位作者报告说，这些抗体大约存在于1 - 2.5%的育龄男性和4%的育龄女性中)[6］．尽管我们的数据可能受到样本量偏倚的影响，但血清和宫颈排卵黏液抗体检测的效益在我们的患者和对照组中似乎是最低的。

透明带(ZP)是卵母细胞发育过程中形成的一种10微米的“强”卵母细胞发生糖蛋白基质，其厚度随卵母细胞的生长而增加。它基本上是卵母细胞成熟时的保护层，由三种主要糖蛋白ZP1、ZP2和ZP3组成。这些糖蛋白似乎是重要的卵巢抗原，参与了一些不孕症的病因学，包括自身免疫性卵巢早衰(POF)。POF在大约1-2%的健康女性中可见，30%与自身免疫原因有关，常出现在SLE患者中[10］．自身免疫性POF已在动物研究中得到证实，其中具有抗zp2和抗zp抗体的小鼠前卵泡经培养后显示直径比对照组小[11］．此外，针对ZP糖蛋白的抗带状抗体能够抑制精子附着和渗透入卵母细胞，可能是自然或人工受精失败的原因。正如我们之前报道的那样，在多次失败的体外受精后，经常检测到血清AZA水平的升高[12］．一些研究证实，与病因明确的不孕症患者相比，高比例的不孕症患者存在一种反配子抗体(AGAs) [13］．

在目前的研究中，我们发现与对照组相比，研究组中aZP IgG抗体的流行率边缘性显著。

抗磷脂抗体(aPL)形成的一组抗体可能不仅与SLE妇女的生育能力下降有关。尽管一些回顾性研究报告抗磷脂抗体与SLE患者妊娠损失之间无显著相关性，但其他研究证实它们之间有统计学意义的相关性[14］．在明显健康的对照组和SLE患者中，APL可达5%，SLE患者中可达37%。较少的情况下还伴有其他自身免疫性疾病[15，16］．在动物模型中，妊娠期间给予aPL会导致胎盘损伤，随后流产。子宫胎盘血管系统血栓形成是内皮细胞活化、蛋白C/S系统和纤维蛋白溶解抑制以及膜联蛋白v移位的结果。非血栓性胎儿损伤的另一个重要机制是aPL对阴离子磷脂的直接影响β滋养层2-糖蛋白I，很可能在妊娠早期损害胎盘绒毛膜促性腺激素的产生[17］．尽管目前对抗磷脂综合征的分类是基于三种标准化实验室检测方法中的一种或多种的阳性鉴定:抗心磷脂抗体(aCL)、狼疮抗凝剂(LA)和抗磷脂抗体β(2)我(anti -糖蛋白β(2)GPI)根据2010年4月在德克萨斯州加尔维斯顿举行的第13届国际抗磷脂抗体大会的一个工作组和会前研讨会的报告，已经提出了其他几种与APS相关的抗体。在我们的实验室中，我们采用扩大规模的aPL检测抗膜联蛋白V、抗磷脂酰丝氨酸、抗磷脂酰乙醇胺、抗磷脂酰肌醇、抗磷脂酰甘油和抗磷脂酸。我们的结果表明，在患有SLE的女性中，aPL IgM筛查是不令人满意的。另一方面，IgG筛查显示出明显的差异，这很可能与生殖失败有关。观察到的完整性(7个aPL IgG抗体中有5个在研究组和对照组之间存在显著差异)可能是由于某些IgG抗体的假设关联导致了假设的固定抗体谱，只有在合作时才有足够的可能导致不孕或妊娠损耗。

一项对554名SLE女性的10项研究的综述发现，胎儿死亡在aPL (38% - 59% vs . 16% - 20%无此类抗体)、LAs (36% vs . 13%)或aCL (39% vs . 18%)患者中更为常见。胎儿丢失通常发生在妊娠10周后[5，18］．

自体免疫与生殖的关系早已为人所认识。尽管在一篇关于异常自身免疫对女性生育能力影响的批判性综述中，对SLE中aPL对POF的影响表示怀疑，但SLE仍然是一种主要由体液改变所致的自身免疫性疾病。似乎可能涉及另一种未解释的机制(例如，存在其他抗体，如IgG抗laminin- i抗体、抗黄体糖蛋白和抗淋巴细胞毒性自身抗体，或抗线粒体M5型抗体)[5］．这些抗体被发现干扰胎盘和卵黄囊分化、侵袭、内吞、信号传导和其他促进血栓形成过程的标志物[19，20.］．

7.结论

基于我们的研究结果和长期经验，我们认为，对于SLE复发和其他原因不明的胎儿丢失，建议由生殖免疫学专家进行详细的评估是合适的。在自身抗体阳性的情况下，应考虑预防性治疗(如皮质类固醇、低分子量肝素、低剂量阿司匹林、静脉注射免疫球蛋白治疗)。由于支持各种个体抗体与生殖失败相关的证据尚不确定，因此一项针对高危妇女抗体谱的新的荟萃分析可能是有益的。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者要感谢所有西波西米亚风湿病学家的密切合作。这项研究是由Grant GA UK no资助的。来自布拉格查尔斯大学资助机构和查尔斯大学研究基金(项目编号P36)的696212。

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