高度同源dna结合和dna水解自身抗体体细胞突变导致的基于结构的变化的作用，以VH结构域A23P取代为例

摘要

抗dna自身抗体是导致狼疮组织损伤的原因。一种具有DNA分裂能力的DNA特异性抗体子集，在通过破坏核DNA进入活细胞后，其危害性甚至更大。抗dna自身抗体的起源尚不完全清楚，诱导dna裂解活性的机制仍是推测。来自狼疮易感小鼠的自身抗体BV04-01是目前已知的唯一具有三维结构的dna水解免疫球蛋白。鉴定和分析与BV04-01同源的抗体有助于了解自身抗体的分子基础和dna切割活性的来源。BLAST搜索发现小鼠抗dna自身抗体MRL-4，其可变区基因序列与自身抗体BV04-01高度同源。尽管与BV04-01具有显著的同源性，但MRL-4不仅没有DNA切割活性，而且其异常的P23突变对生殖系丙氨酸的逆转导致了对DNA的显著亲和力丧失。与此相反，将P23突变转移到BV04-01导致DNA结合显著下降，几乎完全丧失催化活性。在本文中，我们分析了两种同源自身抗体及其突变体的特性，并讨论了异常体细胞突变对发展具有dna结合和dna水解活性的自身抗体的意义。

1.介绍

抗dna自身抗体被认为是自身免疫性疾病(如SLE)组织损伤的重要因素[1］．含有抗dna抗体的免疫复合物主要在肾脏形成组织沉积，导致凋亡细胞死亡和严重的组织损伤[2，3.］．

核酸裂解抗体是自身抗体的一个子集，能水解单链和双链DNA和RNA [4，5］．抗dna自身抗体穿透细胞膜并定位于活细胞的细胞核[6］．此外，某些DNA切割抗体也可能以caspase依赖的方式穿透活细胞导致细胞凋亡，可能是通过在细胞核DNA中引入缺口[7］．在自身免疫性疾病中观察到，由于dna水解抗体的进入而导致的细胞死亡可导致组织损伤。

尽管已有几十年的研究，但关于自身抗体的dna结合和dna水解活性的发展的完整图景仍然缺乏。自身抗体对DNA亲和力和特异性的获得被认为是在审查机制受损的背景下通过抗原驱动的选择进行的，审查机制通常是在健康状态下删除或沉默自反应b细胞克隆[1- - - - - -3.］．长期以来，认为核小体代表主要(自动)抗原诱导抗dna抗体的范式受到了质疑，因为观察到外源dna -蛋白质复合物也可以作为诱导抗dna抗体的有效抗原，从而导致伴有蛋白尿和肾小球IgG沉积的狼疮样肾炎[8，9］．其他机制如分子拟态也可能参与抗dna自身抗体的诱导[10］．目前，尚不清楚是否免疫系统检查功能的损伤通常需要删除自反应克隆来成熟高亲和力的抗dna抗体。针对外来DNA-蛋白复合物的抗体以及由其他迄今未知机制诱导的具有DNA特异性的抗体可促进自身免疫病理的发展。

在研究小鼠dna切割自身抗体BV04-01时[11，12]，我们鉴定出其相近同源抗dna抗体MRL-4 [13］．MRL-4重链包含一个不寻常的体细胞突变和胚系Ala-23被脯氨酸替换。在这项研究中，我们证明了不参与与抗原直接相互作用的单个突变可以对dna特异性自身抗体的结合和催化特性产生深远的影响。

2.材料和方法

2.1。采购产品化学品，材料，细菌菌株，和载体DNA

除非另有说明，化学品均购自西格玛。细菌生长培养基和培养基补充物来自VWR Scientific (BD Difco)。pET-22b(+)载体和大肠杆菌菌株BL21和BL21（DE3)从Novagen获得。DH12S大肠杆菌以及pBluescript SK(−)质粒DNA。用合成醇和Evrogen制备寡核苷酸。本研究中使用的所有溶液都是用来自微孔合成站的18 MΩ超纯水制成的，并通过高压灭菌。

2．2．单链抗体片段的克隆、表达和纯化

通过pcr诱变，pET22b(+)载体被同义GCC取代GCG(编码Ala-20的pelB信号肽)，同时破坏原Nco I引用。这允许克隆带有5 ' -附加Nco I位点和3 '端pelB密码子的单链抗体结构，以便通过胞浆周围分泌系统处理pelB，释放抗体轻链的原生成熟端。此外，5 ' -Xho II和3 ' -Sal I识别位点两侧的c-myc多肽序列编码(EQKLISEEDL)，在下游His6标签插入Xho I位点的框架内。

单链抗体SCA04-01较早制备，含有BV04-01重链和轻链基因可变区[12］．采用正向VKF(5’-CATT)进行pcr扩增CCATGGCCGATGTTGTGATGACCCAA)和反向VHR (5 ' -TTACTCGAGtgcagagacagtgaccagt)引物引入上游Nco I和下游Xho I克隆位点(引物序列下划线部分)。得到的PCR产物经Nco I和Xho I酶切，并与修饰的Nco I-Xho I酶切的pET22b(+)连接。用TriZol试剂从杂多瘤细胞(Dr. A. Theofilopoulos提供)中分离的相应RNA中扩增出编码dna结合抗体MRL-4 VH和VL的cdna。VH扩增引物为MRL1F (5 ' -AAGAGCTCTGAGGGTAAAGGCGAGGTGCAGCTTGTTGAGACT)为正向引物，VHR为反向引物。

利用正向VKF和反向KLR (5 ' -AAC)分别将上游Nco I和下游Spe I位点与scFv的部分连接子序列进行修饰ACTAGTACCAGATTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCGA)引物。利用MRLF(5’-TCA)扩增VH cDNAACTAGTagcggctctggtaagagcttgagggtaaaggcgaggtgcagcttgttgagact)正向引物和VHR反向引物，将下游Xho I位点和上游Spe I位点与其余连接序列(GSTSGSGKSSEGKG)一起追加[14］．将BV04-01和MRL-4对应VH和VL链的扩增DNA经相应的酶切酶切后，用Roche快速连接DNA试剂盒(Rapid ligigation DNA kit)将其克隆到Nco I和Xho I酶切的修饰pET22b(+)中。

通过Vκ用VKF和KRR (5 ' -ATACTCGAGTTATTC)进行PCR扩增AAGCTTGGTCCCCGAATACGGAACA)引物κ，用CκF (5 ' -TCGGGGACCAAGCTTGAAATAAAA)和CκR (5 ' tctCTCGAGACACTCATTCCTGTTGAAGCT)引物。Vκ片段克隆到修饰的pET22b(+)载体中，在Nco I和Xho I位点之间，与Cκ下一个被克隆到Vκ利用pcr引入的Hind III位点和Xho I位点。

将编码单链抗体的结构体电穿孔转化DH12S细胞，通过菌落PCR和DNA测序鉴定正确克隆。分离到编码BV04-01和MRL-4 scFvs的质粒并转化BL21(DE3)细胞。转化子，在足够的密度，以形成草坪的2xYT培养基，包含1%琼脂，1%葡萄糖，和100μg/mL氨苄青霉素，培养过夜，用2xYT培养基/0.5%葡萄糖洗出培养皿，接种4升含0.1%葡萄糖和100毫升葡萄糖的2xYT培养基μ克/毫升氨苄青霉素。37℃培养至OD600为0.9，冷冻至20℃，加入IPTG至终浓度0.2 mM。蛋白质生产继续在20°C与剧烈震动10小时。按照前面所述的方案进行周质scFvs的分离[15］．生长完成后，将培养物冷冻20 min, 3000离心15 min成球g在4°C。用含有200 mM Tris-HCl、20%山梨糖醇和1 mM EDTA (pH 8.0)的缓冲液清洗颗粒，在50 mL相同的缓冲液中重悬，在冰上孵育1小时，偶尔搅拌。30000离心清除细胞碎片G煎40分钟。用螯合缓冲液(100mm NaCl, 50mm Tris-HCl, pH 8.0)对上清进行广泛透析。使用FPLC AKTA系统(GE Healthcare)进行蛋白和DNA纯化，并配备相应的软件和附件。将澄清后的周质馏分装入柱中，用10 mL Talon螯合树脂(Clontech)预填充，并用相同的缓冲液进行平衡。洗脱柱后，scFvs用250 mM咪唑(pH 8.0)洗脱，用离子交换缓冲液(10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, pH 8.0)稀释10倍，并上载于MonoQ柱(GE Healthcare)。采用0 ~ 0.5 M NaCl梯度洗脱。纯化的重组ScFv样本通过Laemmli SDS-PAGE进行分析，并用抗c-myc肽的单克隆抗体(Novus Biologicals)进行Western blotting验证。

2.2.1。定点诱变

根据制造商的协议，使用QuikChange闪电定点突变试剂盒(Agilent)进行。

2．3.DNA裂解试验

如前所述，制备了pBluescript DNA的纯超盘绕形式[4］．将不同浓度纯化的重组scFvs与1μg质粒DNA，在1mm MgCl存在下₂在37°C下放置12小时。反应产物在1%琼脂糖凝胶中溶解，溴化乙锭染色可见。根据密度测定的结果，计算质粒从超螺旋转化为圆形和线形的百分率。使用GelDoc 2000凝胶文件系统(Bio-Rad)采集琼脂糖凝胶图像和随后的密度测量。

２.４.DNA酶联免疫吸附试验

采用聚合酶链反应(pcr)扩增出254个核苷酸的双链DNA片段镰刀菌素avenaceum利用Syntol合成的5 ' -生物素化引物(5 ' bio - cgaaccatcgagaagttc和5 ' bio - ccagtggttagtgactgc)。PCR产物经苯酚-氯仿混合物处理，3体积乙醇成球，离心10分钟(10000 g)，溶解于含有20米M Tris-HCl pH 7.5和100 mM NaCl。采用Superdex G75凝胶过滤柱纯化DNA片段(流速0.5 mL/min，进样量0.2 mL)。

纯化的PCR片段在缓冲液A中稀释，并固定在HBC NeutrAvidin条(Thermo Scientific)上，量为1μg DNA每孔。用添加0.02% Tween-20的缓冲液A洗涤3次，去除未结合的DNA。使用Superblock Blocking buffer (Thermo Scientific)堵塞井壁。在0.005 ~ 5的浓度范围内，将重组scFvs应用于井中μ将结合的单链抗体与抗c-myc单克隆抗体(Novus Biologicals)杂交，随后进行上述洗涤程序，采用抗小鼠fc片段过氧化物酶结合物和可溶性TMB底物检测(Thermo Scientific)。加入10% H，反应停止₂所以₄在405 nm处测定吸光度。分光光度测量采用Varioskan闪光多模态板分光光度计(Thermo)。

2．5．SPR测量

采用ProteOn XPR 36分析仪(Bio-Rad)进行表面等离子体共振分析。测量是在含有20 mM钠的缓冲液中进行的₂HPO₄/不₂阿宝₄、137 mM NaCl、0.01%吐温20、100 mg/L牛血清白蛋白。生物素化的DNA片段，如上节所述，被固定在NLS ProteOn传感器芯片的表面。在75流速下测定单链抗体与DNA的相互作用μL / min。利用ProteOn Manager软件对实验数据进行处理，并基于Langmuir蛋白质吸附模型计算动力学参数。

3.结果

为了探索在已经鉴定的dna特异性自身抗体中dna水解抗体的发生率，我们使用编码BV04-01 VL和VH结构域的序列进行BLAST搜索。

对抗体BV04-01的催化轻链同源物进行BLAST搜索，发现在已测序的抗体中，相同或高度同源的轻链相对丰富。同时，含有这种l -链的抗体对抗原的特异性很大，而不是核酸。从ELISA数据判断，BV04-01的重组l -链未显示任何dna水解活性。

只有少数与BV04-01高度同源的l -链抗体对DNA具有特异性，属于自身抗体。令人惊讶的是，其中一种抗dna自身抗体mrl -4 [13的VH结构域与BV04-01的VH仅相差少量残基。

因此，我们试图对MRL-4和BV04-01进行dna结合和dna切割活性的比较分析，以获得自身免疫性抗dna抗体催化活性潜在来源的新信息。

从相应杂交瘤细胞株中克隆MRL-4 VH和VL基因，构建单链抗体，与BV04-01相同[14］．重组MRL-4单链抗体产生于大肠杆菌以超螺旋质粒DNA为底物，无DNA水解活性。MRL-4单链抗体与各种寡核苷酸的孵育没有检测到dna水解活性。同时，用MRL-4 VL替换单链抗体BV04-01，产生的抗体与BV04-01 scFv的dna水解活性无明显差异(分别为87%和83%)。根据密度数据)。

根据BV04-01 Fab片段与(dT3)配合物的三维结构推断[11]，随后由预测抗体活性位点和金属结合囊的分子模拟支持[12，抗体-DNA复合物的形成使DNA弯曲，可能激活了其中一个磷酸二酯键。催化转化所需的后续水解和产物释放需要配体-抗体复合物的构象变化。根据以往的研究，并符合抗dna自身抗体的抗原驱动性质假说[1- - - - - -3.]，已知重链的一些元素，包括CDRH3，直接接触抗体结合位点的DNA [11］．与此同时，对dna水解抗体构象动力学的结构决定因素所知甚少。催化意味着酶有能力翻转，换句话说，伴随着底物结合、过渡态形成和产物释放的重复构象变化。因此，我们试图识别那些可以影响抗体-抗原复合物构象重排的抗体元件。为此，我们在MRL-4和BV04-01抗体链选择位点进行定点突变，这可能会影响这些抗体的构象变化，并通过DNA ELISA筛选突变体的DNA结合能力。单链抗体BV04-01、MRL-4及其突变体一级结构比对如图所示1．

一个不寻常的体细胞突变，L4P (Kabat编号)存在于BV04-01重链中。该突变对种系基因序列的逆转，以及脯氨酸被丙氨酸取代，并不影响BV04-01 ScFv与DNA的结合和水解。在MRL4中发现的另一个不寻常的突变是Pro替代胚系Ala-23。与BV04-01中的L4P逆转不同，MRL-4 scFv中的P23逆转到种系序列导致抗体对DNA的结合能力显著丧失。然后我们询问BV04-01 VH片段获取P23是否会引起其DNA反应性的变化，并分析了BV04-01 ScFv A23P突变体的DNA结合和DNA水解活性。出乎意料的是，BV04-01 VH由于A23P突变，不仅DNA切割活性被破坏，而且DNA结合也大幅下降，从ELISA数据判断。ELISA结果见图2．突变体对超螺旋DNA底物的水解如图所示3.．

考虑到在MRL-4的VH23位点Pro对Ala的突变作用导致DNA结合的显著丢失，我们接下来分析了在MRL-4 VH位点Pro对胚系Ala的逆转。在VH结构域含有P23A的MRL-4 scFv的DNA结合水平下降到与SCA04-01 VH A23P相当的水平。为了提供MRL-4 scFv和SCA04-01突变型和野生型的dna结合能力变化的准确定量数据，我们使用表面等离子体共振(SPR)技术对这些抗体进行分析。SPR数据显示，SCA04-01 VH A23P突变体的DNA结合效率下降最大。用丙氨酸替代脯氨酸后，血清中丙氨酸含量下降了约2.5个数量级以及DNA水解活性的损失到超螺旋DNA裂解检测无法检测的水平。在MRL-4 VH中，P23逆转到胚系Ala的作用不太明显，导致20倍的损失(表1)．

4.讨论

脯氨酸是一种独特的氨基酸，它可以影响蛋白质结构域甚至整个蛋白质的构象。脯氨酸开关在某些合成或调节途径的酶活性调节中发挥重要作用[16］．脯氨酸顺-反式异构酶催化的构象开关激活了在脯氨酸构象中失活的蛋白质。直到Feige等人发现CH1- cl组装诱导的CH1结构域折叠的脯氨酸开关依赖控制之前，还没有关于抗体中脯氨酸开关的数据[17］．脯氨酸依赖的CDR环构象在抗原结合位点的形成中起着重要作用。

L95位置的Kappa-chain顺式脯氨酸构象有助于维持CDRL3环的规范结构，尽管该环中的其他氨基酸残基具有高度的可变性，但CDRL3环的规范结构相当稳定。抗体中的其他典型CDR环也可能含有Pro残基[18］．此外，在没有脯氨酸的情况下，CDR序列可以采用稳定抗体结合位点所需的非x -脯氨酸顺式肽构象[19］．

已经注意到，在亲和成熟过程中，小鼠脯氨酸残基的百分比增加了42%，人类抗体增加了50% [20.］．已知的脯氨酸用量变化主要局限于转弯和扭结区域，增加了整体结构的稳定性，同时降低了转弯稳定所需的能量[19］．在抗dna自身抗体中，可以发现这种类型的脯氨酸突变(T45P)，例如，在重链33中。C9单克隆抗体[21，它发生在CDRH1和CDRH2之间的转折区域。

我们的数据表明，通过体细胞突变过程发生的脯氨酸残基可能在获得和调节抗dna抗体结合和催化活性中发挥重要作用。在MRL-4中，P23是通过体细胞突变获得的，导致自身抗体对DNA的亲和力比包含逆转生殖系的抗体变体增加20倍。BV04-01重链中A23P突变导致DNA结合减少60倍，完全消除催化活性。重链上的第23位紧邻形成链内二硫键的不变的Cys残基。在重链折叠过程中，肽键旋转在该位置的灵活性变化可能会影响CDRH1的最终构象，并可能导致Fv结构的其他长距离效应。

这种自然发生的突变可以通过影响FV结构而不是特异性抗体-抗原接触来改变抗dna自身抗体的结合或催化特性，这一发现提出了有关导致抗dna自身抗体发展的成熟过程的重要问题。现有数据表明，抗体通过体细胞高突变和抗原驱动选择逐渐获得dna结合活性[1- - - - - -3.，21］．被取代的氨基酸，如带正电的精氨酸，通过与DNA形成直接接触而增加抗体亲和力[22］．抗原是否代表DNA-蛋白质复合物、DNA模拟物或与核酸无关的分子仍有待确定[2，10］．同时，在许多情况下，观察到抗原驱动的选择和DNA结合之间没有相关性，例如，当抗DNA自身抗体还原到其生殖系时，DNA结合没有发生变化[23］．

目前，由于现有资料有限，尚不能确定P23突变在形成致病性抗dna自身抗体中的生理意义。例如，对文献的分析显示，小鼠交叉反应性抗肺炎球菌/抗dsdna自身抗体重链中存在体细胞突变T24P [24］．尽管对该抗体的体细胞突变在DNA结合亲和性和致病性方面的作用进行了广泛的分析，但尚未研究T24P突变的作用。早些时候，有假说认为，狼疮自身抗体(包括FRs)中发现的异常体细胞突变不是由于抗原特异性激活而出现的，而是由于B细胞通过体细胞突变获得自身反应性缺乏负选择。这可以提高b细胞的存活率，因为抗体基因突变与热点靶向分离[25］．通过受损的克隆缺失机制允许的突变，由于MRL-4 P23A种系逆转物与DNA的结合水平很低，因此产生高亲和力抗DNA自身抗体的途径可能非常短。

为什么P23突变/逆转在其他结构相似的抗体中有如此相反的效果?根据P23异构化的不同，MRL-4的CDRH1与BV04-01的结构可能存在显著差异，从而可能影响MRL-4抗原结合位点的整体构象。由于P23的存在所施加的限制，与BV04-01相比，后者的刚性要明显得多。在MRL-4的CDRH3中有大量的W105残基，而在BV04-01中没有，这可能是抗体-DNA复合物硬度增加的原因，要么是通过堆积机制与DNA相互作用，要么是与轻链形成疏水接触。在MRL-4中，用丙氨酸替换P23可以在整个抗原-抗体复合物中引入灵活性，增加某些氨基酸残基的运动，包括，例如，W105，从而削弱抗体- dna，或VH-VL相互作用，或两者兼有。

相反，BV04-01的催化活性需要抗体- dna复合物保持相当大程度的灵活性，因为催化反应意味着底物与酶的初始结合，需要进行构象重排以降低反应能垒，并随后释放反应产物。人们可以推测，在CDR1的基础上引入脯氨酸，可以通过将其“冻结”在特定的构象中，从而降低其灵活性，从而不仅破坏了His31与DNA的接触[11，但也阻碍了成功催化磷酸二酯键裂解所需的整体构象变化。有趣的是，其他已知序列的dna水解抗体[26，27在此位置或邻近位置包含Pro或其他潜在的构象限制突变。比较分析其MRL-4、BV04-01和VH23突变体的三维结构，有助于了解P23突变对dna结合和dna水解活性的影响机制。

对含有这种或类似突变类型的抗dna自身抗体的广泛搜索和分析将有助于回答这个问题，而观察到的现象是一个孤立的案例，或者是dna结合和dna水解自身抗体成熟的重要途径，导致系统性自身免疫疾病的发病机制。

5.结论

已知在自身抗体中获得高亲和力的DNA是通过体细胞高突变进行的，并被认为是抗原驱动的。相应的突变残基经常与DNA直接接触。在本文中，我们描述了同源自身抗体的DNA结合能力的构像依赖调节，通过突变改变DNA结合(MRL-4)抗体Fv或其部分的刚性，导致抗体与DNA的亲和力显著增加。在dna水解抗体(BV04-01)中，人为引入相同的突变，降低了结合亲和力，并消除了催化活性。

突变效应的差异提示了催化抗体抗原结合位点构象灵活性的重要性。因此，在结构相似的抗体中，获得DNA结合的途径可能不同，这种差异可能反映了抗体成为催化的特定条件。了解这些情况有助于开发针对所选抗原的特定表位量身定制的催化抗体。需要进一步的结构和统计数据来估计这种现象在抗dna自身抗体成熟中的作用。

承认

作者对A. Theofilopoulos教授提供杂交瘤菌株MRL-4表示感谢。

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