LncRNA LOXL1-AS1促进成神经管细胞瘤的增殖和转移通过激活PI3K / AKT通路

文摘

成神经管细胞瘤是最常见的恶性脑瘤的童年,转移的巨大潜力。然而,成神经管细胞瘤如何起源和发展的机制还有待阐明。本研究评估的角色长非编码RNA LOXL1-AS1 (lncRNA LOXL1-AS1)在人类成神经管细胞瘤细胞增殖和转移。最初发现LOXL1-AS1明显在临床成神经管细胞瘤组织与邻近的非癌变组织。LOXL1-AS1也是高度表达成神经管细胞瘤晚期和一系列成神经管细胞瘤细胞系中差异表达。击倒LOXL1-AS1使用成分显著地抑制细胞的生存能力和D283和D341细胞集落形成能力。此外,在S期细胞比例显著增加,而在G2 / M期细胞比例降低D283 LOXL1-AS1击倒后细胞和D341细胞。细胞周期阻滞LOXL1-AS1击倒最终导致细胞凋亡。此外,在异种移植模型中人类成神经管细胞瘤,击倒LOXL1-AS1显著抑制肿瘤的生长和促进肿瘤细胞凋亡。此外,击倒LOXL1-AS1抑制细胞迁移和逆转epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)。 Western blot analysis further revealed that knockdown of LOXL1-AS1 decreased the phosphorylated levels of PI3K and AKT without affecting their total protein levels. These results suggest that LncRNA LOXL1-AS1 promoted the proliferation and metastasis of medulloblastoma by activating the PI3K-AKT pathway, providing evidence that knockdown of LncRNA LOXL1-AS1 might be a potential therapeutic strategy against medulloblastoma.

1。介绍

成神经管细胞瘤是最常见的恶性脑瘤儿童具有频繁外神经系的转移(1]。主要介绍了当前治疗成神经管细胞瘤在1980年代和主要包括细胞毒性,不属预定目标的方法。然而,死亡率成神经管细胞瘤仍是重要的(2]。此外,许多幸存者遭受严重的治疗相关的辐射的影响和细胞毒性化疗等内分泌系统功能障碍和智力损伤(3,4]。因此,新治疗策略瞄准关键监管途径的开发和发展成神经管细胞瘤是必要的。

目前,癌症的起源是一个逐步积累改变细胞功能和分子表达,广泛报道联系与涉及转录调控机制(5],转录后的调控[6),和表观遗传修饰7]。转录后的调控机械中,长非编码rna (lncRNAs)最近被认定为主要监管机构各种生物过程,包括细胞增殖、分化、凋亡、迁移和入侵8- - - - - -10]。lncRNAs类的RNA在200个核苷酸长度。lncRNAs在实体肿瘤的作用已经受到了越来越多的注意力从世界范围内的研究。此外,lncRNAs SNHG1等都与癌症有关恶性肿瘤在pan-cancer包括成神经管细胞瘤(11]。然而,我们的知识lncRNAs仍然有限,它已成为一个主要的研究挑战发现小说在癌症等疾病lncRNAs成神经管细胞瘤(11]。

新兴数据显示lncRNAs的关键作用的开发和发展成神经管细胞瘤。肿瘤的生长和转移成神经管细胞瘤的报道被lncRNAs如CCAT1(严格控制10],linc-NeD125 [12],CRNDE [9]。然而,其他重要lncRNAs明显与成神经管细胞瘤仍有待阐明。

lncRNA LOXL1-antisense RNA (LOXL1-AS1)编码串LOXL1相反。这个小说lncRNA最近被确定使用测序和基因分析13]。LOXL1-AS1表达显著改变以应对人类晶状体上皮细胞氧化应激和应对循环机械应力在人类巩膜静脉窦内皮细胞(13),支持的功能作用lncRNA LOXL1-AS1细胞应激反应。

LOXL1-AS1在人类肿瘤发生的作用仍然是未知的,因此,本研究旨在探讨LOXL1-AS1成神经管细胞瘤的表达谱和功能作用。为此,最初LOXL1-AS1水平评估在临床成神经管细胞瘤组织和一系列成神经管细胞瘤细胞系。特定的shrna针对LOXL1-AS1被合成调节LOXL1-AS1的表达。细胞生存能力、集落形成和细胞迁移能力检测在活的有机体内和在体外。我们的研究结果表明,LOXL1-AS1成神经管细胞瘤组织中高度表达。击倒的LOXL1-AS1显著抑制细胞增殖和转移成神经管细胞瘤。此外,PI3K / AKT通路被LOXL1-AS1监管,这可能表明一个监管机制导致LOXL1-AS1-mediated成神经管细胞瘤进展。

2。材料和方法

2.1。人体组织和伦理语句

共50例,临床诊断为成神经管细胞瘤在济宁第一人民医院和人民医院泗水乡被纳入本研究。对于每个案例,其癌变组织和匹配相邻非癌变组织。所有患者充分显示其同意参与我们的研究,并从每个病人获得书面同意书。协议使用人体组织伦理委员会批准董事会在济宁市第一人民医院和人民医院泗水乡大学。

2.2。细胞和试剂

人类成神经管细胞瘤细胞株Daoy D283、D425 D341, D458购自中国科学院细胞银行(上海,中国)。细胞系都保持在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)(美国Gibco,洛杉矶,CA)提供10%胎牛血清的边后卫(Gibco)。培养基是刷新每两天,除非另有说明。主要抗体是商业购买的圣克鲁斯生物技术(美国圣克鲁斯,CA)除了磷酸化检测抗体的获得细胞信号技术(美国波士顿)。击倒的lncRNA LOXL1-AS1,两个特定成分被GenePharma化学合成(上海,中国)。一个争夺成分也是合成作为控制成分。

2.2.1。定量实时聚合酶链反应

人体组织和培养细胞总rna孤立使用试剂盒试剂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)根据制造商的指示。的质量和浓度提取rna收集吸光度测定与Nanodrop 2000 260海里。立即rna的转录成互补使用PrimeScript RT大师完美的混合实时(豆类、志贺、日本)。所有实时pcr进行SYBR预混料交货Taq工具包(豆类、日本)在7500年ABI棱镜实时系统。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内部控制。每个实验重复了三次,每一个执行一式三份。

2.3。免疫印迹分析

总蛋白提取使用里帕裂解缓冲(pH = 7.5, Beyotime生物、南通、中国)生成整个蛋白质溶解产物。等量的40岁μg蛋白被加载到每个车道12% sds - page凝胶。蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜电泳后。与5%的脱脂牛奶,非特异性抗原的封锁后膜与初级孵化抗体在一夜之间在4°C。二次抗体识别的主要抗体随后补充道,和增强的免疫反应性决意chemoluminescent放射自显影法(美国宾夕法尼亚州热科学)。GAPDH是同步开发的加载控制。

2.4。Immunofluorescent化验

D283 D341细胞显示治疗被播种在无菌盖玻片在DMEM 24-well板10%的边后卫。24小时后,与PBS和固定细胞被冲洗30分钟在4%多聚甲醛。随后,细胞渗透与2% Triton x - 100 20分钟,然后封锁在5%的边后卫1 h。之后,细胞被孵化主要抗体在4°C过夜。PBS洗后,细胞被孵化与相应的二次抗体在黑暗中1 h和复染色与4 30分钟 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。样品终于安装和观察/拍照的奥林巴斯IX71倒置显微镜(日本东京奥林巴斯光学有限公司)。

2.5。细胞生存能力检测

D283 D341细胞生存能力评估使用细胞计数kit-8 (CCK-8)试验(Beyotime、南通、中国)根据制造商的协议。简单,细胞被播种到6厘米菜肴和转染与特定的shRNA LOXL1-AS1 (shRNA1或shRNA2集团)或争夺成分(对照组)。24小时后,每组的细胞是使胰蛋白酶化和resuspended。细胞被播种到96孔板的初始浓度8000细胞。细胞增殖率监控下列5天。在每个监控的时间点,10的整除μl CCK-8的解决方案是添加到每个。经过进一步孵化的细胞与CCK-8解决方案4 h,每个好由ELISA测定的吸光度读者的波长450 nm。数据分析,细胞生存能力1被设置为1天。

2.6。集落形成实验

人类成神经管细胞瘤细胞系D283和D341 pretransfected与特定成分对LOXL1-AS1和扩散到12-well盘子。然后,所有的盘子都允许集落形成的培养2周。之后,殖民地与结晶紫染色(0.1%)为30分钟。殖民地被定义为与50多个细胞细胞积累。菌落总数是手动计算,平均每组。

2.7。愈合试验和Transwell迁移试验

愈合试验,细胞被镀6-well板块形成汇合的单层。伤口是用无菌吸管技巧。每6小时观察伤口的恢复。伤口恢复率之后计算每个监测时间点。迁移进行了分析使用Boyden钱伯斯(组织culture-treated,直径6.5毫米,8μm毛孔,Transwell合演,剑桥,美国马)包含聚碳酸酯膜。简单地说,100年μ1×10 l⁶细胞在无血清培养基添加到参议院,和600年μl 10%的边后卫的DMEM添加到众议院。细胞被孵化12 h。迁移细胞细胞膜的底面固定并与结晶紫染色在室温下10分钟。5个随机地区的照片,和细胞的数量统计计算每板迁移细胞的平均数量。

2.8。细胞周期分析

流式细胞术分析细胞周期进程进行了分析。简单地说,控制或LOXL1-AS1-depleted D283细胞和D341细胞与70%乙醇洗两次与PBS和固定30分钟在冰上。核糖核酸酶的降解rna, 20毫克/毫升(美国纽约Sigma-Aldrich)添加1 h在37°C。RNA降解后,样品被沾染了20毫克/毫升propidium碘(π,Sigma-Aldrich)和细胞比例在每个阶段评估FACSCalibur流式细胞仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)配备了ModiFit LT v2.0软件。

2.9。细胞凋亡分析

细胞凋亡分析使用的膜联蛋白V /π凋亡工具包(英杰公司、上海、中国)根据制造商的指示。简而言之,D283 D341细胞被播种6-well板(2×10⁶细胞/)和转染争夺成分(对照组)或特定成分对LOXL1-AS1 (shRNA组)。两个细胞系被完全培养基培养48 h。之后,细胞被洗冰PBS和resuspended 100μl绑定缓冲。然后,5μl的膜联蛋白V-FITC和5μl(π工作方案(100μg /毫升)被添加到100年μl整除的细胞悬液。细胞悬浊液进一步孵化在黑暗中在室温下15分钟。随后,另一个400μl(绑定缓冲被加入到细胞悬液。样品通过流式细胞仪进行分析。每个样品测试三次一式三份。

2.10。异种移植模型成神经管细胞瘤在活的有机体内

男性无胸腺的BALB / c裸小鼠5周大是保存在一个特殊的无菌(SPF)条件。共有10个老鼠和随机分为控制或shRNA组( 每组)。D283细胞pretransfected争夺成分(控制)或特定shRNA1 LOXL1-AS1接种到小鼠前(shRNA1组)。总共5×10⁶D283细胞显示治疗然后皮下注入右翼在每一个鼠标。肿瘤尺寸(长度,l和宽度,W)然后每周测量一次总共4周。肿瘤体积(电视)计算电视=l×W²/ 2。喂养4周后,小鼠牺牲和肿瘤组织被切割为后续分析。所有的努力都是尽量减少痛苦。

2.11。组织学和免疫组织化学(包含IHC)分析

小鼠模型的肿瘤组织石蜡包埋,切成4μm幻灯片。幻灯片被苏木精和伊红染色病理确认())。)染色后,幻灯片受到抗原检索在微波在0.1 M柠檬酸溶液pH值(6.0)10分钟。孵化后主要抗体在4°C一夜之间,幻灯片与相应的二次孵化抗体室温1 h。反应性开发利用0.05% diaminobenzidine (DAB)含0.01% H₂O₂。代表每个幻灯片的图片拍摄。

2.12。统计分析

数据表示为意味着±标准差(SD)。对比使用学生的组织进行了分析t以及。差异有两面值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。lncRNA LOXL1-AS1成神经管细胞瘤中

最初,LOXL1-AS1检查在临床的表达成神经管细胞瘤组织。在50例,平均水平LOXL1-AS1成神经管细胞瘤组织中大约是1.5倍,在相邻的非癌变组织(图1(一))。配对组织的分析后,发现50例显示更高水平的36 LOXL1-AS1成神经管细胞瘤组织中与配对相比邻近组织(图1 (b))。此外,相对LOXL1-AS1水平明显高于肿瘤的大小分为T3和T4(图1 (c))。在一系列的成神经管细胞瘤细胞系,LOXL1-AS1差异表达,显示最高水平D283 D341细胞(图1 (d))。综上所述,这些数据表明,LOXL1-AS1成神经管细胞瘤组织中。

3.2。击倒LOXL1-AS1抑制细胞的生存能力,在D283和D341细胞集落形成能力

的最高表达LOXL1-AS1 D283和D341细胞,这两种细胞系被选为最佳调查的功能角色LOXL1-AS1成神经管细胞瘤。具体成分对LOXL1-AS1合成。结果表明,特定的shrna耗尽LOXL1-AS1 D283细胞(图的表达2(一个)(图)和D341细胞2 (b))。接下来,细胞生存能力是决定在两个细胞系有或没有LOXL1-AS1损耗。在D283细胞,观察到损耗从第三天LOXL1-AS1受损细胞的增殖能力。5天,LOXL1-AS1-depleted细胞的增殖率只有一半的控制细胞(图2 (c))。LOXL1-AS1使用成分的损耗也抑制细胞增殖达70% D341细胞(图2 (d))。同样,在集落形成试验,直观地观察到枯竭的LOXL1-AS1要么细胞系下降的殖民地与结晶紫染色(图2 (e))。量化的殖民地显示,只有约40 - 50殖民地形成LOXL1-AS1-depleted D283细胞,与平均120年殖民地控制D283细胞(图2 (f))。减少形成的殖民地也发现LOXL1-AS1-depleted D341细胞(图2 (g))。所有这些数据暗示击倒LOXL1-AS1抑制细胞的生存能力,单独成神经管细胞瘤细胞的潜能。

3.3。击倒的LOXL1-AS1逮捕了在S期细胞周期,导致最终成神经管细胞瘤细胞凋亡

LOXL1-AS1击倒的影响被评估细胞生存(图3(一个))。在细胞周期的分析,发现击倒LOXL1-AS1逮捕了细胞周期进程(图3(一个))。特别是在S期细胞比例显著增加大约30%的控制D283细胞近45% LOXL1-AS1-depleted D283细胞。因此,在G2 / M期细胞比例下降了大约50%击倒后LOXL1-AS1 D283细胞(图所示3 (b))。与细胞周期阻滞在S期也是D341细胞(图中观察到3 (c))。

随后,分析了细胞凋亡(图4(一))。虽然只有大约4%控制D283细胞凋亡,细胞凋亡率为14%在shRNA1-transfected D283细胞和15.2% shRNA2-transfected D283细胞(图4 (b))。击倒D341 LOXL1-AS1也促进了细胞的凋亡率,增加shRNA1 200%和250%增加shRNA2(图4 (c))。这些数据表明,击倒的LOXL1-AS1逮捕了细胞周期,导致最终成神经管细胞瘤细胞凋亡。

3.4。损耗成神经管细胞瘤LOXL1-AS1抑制肿瘤的生长在活的有机体内

人类成神经管细胞瘤的异种移植模型建立了给D283细胞裸鼠接种疫苗。D283细胞被使用之前炒成分或shRNA1接种。存在分析确认shRNA1击倒LOXL1-AS1(图的效率5(一个))。使用shRNA1是由于观察到功效耗尽LOXL1-AS1 shRNA1表现出相对高于shRNA2如图2(一个)和2 (b)。接种后4周,每组小鼠切除肿瘤,shRNA1-treated小鼠表现出明显较小的肿瘤相比,控制老鼠。肿瘤的重量从shRNA1组也显著低于对照组(图5 (b))。事实上,监控4周期间,shRNA1-treated老鼠从第二周开始表现出较小的肿瘤大小,和LOXL1-AS1-depleted老鼠肿瘤增长放缓率在接下来的几周(图5 (c))。免疫组织化学分析显示,shRNA1-treated老鼠的肿瘤显示相对较少的积极性的ki - 67标记肿瘤细胞增殖(数字5 (d)和5 (e))。相反,从LOXL1-AS1-depleted老鼠显示更多TUNEL-positive细胞瘤(数字5 (d)和5 (f)),这表示组织内的细胞凋亡增加,支持在体外观察和建议LOXL1-AS1损耗成神经管细胞瘤的抑制肿瘤的生长。

3.5。成神经管细胞瘤击倒LOXL1-AS1抑制细胞迁移

细胞迁移能力然后使用愈合试验评估。341年发现D283和细胞恢复人工伤口,不管他们得到治疗。然而,shRNA-treated细胞表现出缓慢复苏能力在18 h相比,控制细胞(图6(一))。事实上,伤口在D283细胞复苏率下降了近46.7%和55.6% D341细胞(图6 (b))。Transwell迁移试验还证实,LOXL1-AS1-depleted细胞不太能够永恒轮回的下表面(图6 (c))。迁移细胞shRNA-treated组不到一半的对照组(图6 (d))。

此外,上皮标记、上皮和间叶细胞标记,波形蛋白,钙粘蛋白免疫荧光检测,增加和减少波形蛋白免疫荧光观察LOXL1-AS1击倒后(图6 (e))。持续、免疫印迹分析还表明,波形蛋白的蛋白质含量减少,而钙粘蛋白增加以应对LOXL1-AS1损耗D283细胞和D341细胞(图6 (f)),这表明击倒LOXL1-AS1抑制细胞迁移和逆转EMT过程。

3.6。LOXL1-AS1积极管制成神经管细胞瘤细胞系的PI3K / AKT通路

促成了LOXL1-AS1-mediated表型的分子机制进行了探讨。发现,PI3K (p-PI3K)和AKT的磷酸化水平(p-AKT)在LOXL1-AS1-depleted细胞明显减少,而PI3K和AKT的总蛋白质含量仍不受LOXL1-AS1击倒,表明LOXL1-AS1 PI3K / AKT通路激活在成神经管细胞瘤(图7)。

4所示。讨论

成神经管细胞瘤仍然是一个主要的健康问题威胁全世界孩子们的生活。百分之四十的病人患有成神经管细胞瘤在诊断发现远处转移(14),使之成为一个真正的挑战来治疗恶性肿瘤。此外,传统治疗成神经管细胞瘤与明显的副作用(3]。因此,调查期间新颖的分子变化的发生和发展成神经管细胞瘤必须确定新的治疗目标和个性化治疗成神经管细胞瘤患者。

目前的研究提供了在体外和在活的有机体内LOXL1-AS1显示证据有力prooncogenic函数成神经管细胞瘤和赞扬本身作为一个可能的治疗目标电流成神经管细胞瘤治疗。LOXL1-AS1是最近确定lncRNA非常相关的细胞应激反应(13),但缺乏LOXL1-AS1表达数据,特别是在肿瘤组织。这是第一个报告,LOXL1-AS1明显在临床成神经管细胞瘤组织。成神经管细胞瘤与先进的肿瘤中表达更高的大小,表明关键参与肿瘤的生长调节。事实上,细胞生存能力和单独使用潜在的显著抑制LOXL1-AS1击倒后成神经管细胞瘤细胞系。肿瘤生长也被抑制的在活的有机体内人类与LOXL1-AS1损耗成神经管细胞瘤的异种移植模型。此外,在体外和在活的有机体内肿瘤生长抑制效果LOXL1-AS1损耗与肿瘤细胞周期阻滞在S期。放松管制的细胞周期进展是肿瘤生长的标志(15)与细胞凋亡密切相关16,17]。细胞周期阻滞,LOXL1-AS1损耗支持LOXL1-AS1促进肿瘤生长的影响,以及最终的细胞凋亡在D283和D341细胞,成神经管细胞瘤的异种移植模型。综上所述,这些观察结果表明LOXL1-AS1促进细胞生长成神经管细胞瘤。

此外,它也被发现,击倒LOXL1-AS1受损细胞迁移能力的愈合和Transwell迁移化验就证明了这一点。细胞迁移是由大约50%抑制LOXL1-AS1-depleted D283细胞和D341细胞。EMT是一种常见的肿瘤转移的表现,反映了上皮细胞的可塑性,涉及多个调控分子,包括·泽和蜗牛的家庭(18]。EMT过程引起的各种细胞过程,包括增加的间叶细胞标记(N-cadherin和波形蛋白)的表达,减少上皮标记的蛋白质含量(钙),和过表达ECM的化合物(纤连蛋白)19]。EMT与多种人类肿瘤发生;激活的EMT卵巢癌已被证明是与药物抗性有关,可导致癌症的复发和转移后传统治疗卵巢癌(2,20.,21]。本研究观察到LOXL1-AS1耗尽后,表达间充质标记,波形蛋白,表达下调,而上皮标记,钙是调节,这表明EMT过程被LOXL1-AS1击倒逆转。因此,LOXL1-AS1-depleted成神经管细胞瘤细胞上皮和迁徙。EMT评估支持愈合和Transwell迁移化验。结合肿瘤生长的观察,可以得出结论,LOXL1-AS1调节成神经管细胞瘤肿瘤生长和迁移。

磷酸化的PI3K和AKT激活至关重要。磷酸化,PI3K激活和磷酸化下游AKT引发级联反应(22]。有趣的是,人们发现PI3K (p-PI3K)和AKT的磷酸化水平(p-AKT)减少LOXL1-AS1耗竭后,当总蛋白质含量保持不变,表明LOXL1-AS1积极调节PI3K / AKT通路。PI3K / AKT信号已被确定为一个关键驱动因素的细胞增殖、迁移,在人类肿瘤发生和血管生成,包括成神经管细胞瘤、激活的PI3K / AKT信号增强了肿瘤的生长,转移和药物抗性23- - - - - -25]。PI3K / AKT信号也作为一个集成网络中节点的肿瘤促进信号通路。环球数码创意- 0941抑制剂抑制PI3K活动使用显示有前途在体外和在活的有机体内功效定位成神经管细胞瘤治疗(26]。针对抑制PI3K p110alpha对碘氧基苯甲醚成神经管细胞瘤增殖,药物抗性,和迁移25]。成神经管细胞瘤LOXL1-AS1促进细胞增殖和迁移通过调节PI3K / AKT通路,任何化合物或试剂针对LOXL1-AS1因此抑制PI3K / AKT通路可能作为一种有前途的治疗策略成神经管细胞瘤的治疗。

总之,目前的研究还发现了一个新lncRNA, LOXL1-AS1,成神经管细胞瘤细胞增殖和迁移的关键中介。LOXL1-AS1明显在临床成神经管细胞瘤组织,而击倒LOXL1-AS1表达影响肿瘤细胞生长和迁移,以及PI3K / AKT的失活。这是第一次报告的表达谱和功能性LOXL1-AS1在人类肿瘤发生的作用,提供了强有力的证据表明,合成化合物或试剂瞄准LOXL1-AS1 PI3K / AKT通路可能作为承诺对成神经管细胞瘤临床疗法。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

张跑高,鲁伊·本研究同样起到了推波助澜的作用。

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