不同细胞因子和趋化因子在恶性和非恶性肾细胞中的表达模式

摘要

客观的．细胞因子和趋化因子广泛参与了癌细胞的进展，因此代表了新的生物标志物的候选因子。方法．4个肾细胞癌(RCC)细胞系(Caki-1, 786-O, RCC4和A498)和一个非恶性肾细胞系(RC-124)的增殖情况进行了检测。细胞因子和趋化因子的表达模式通过DNA阵列(人细胞因子和趋化因子RT)进行检测²分析器PCR数组;(Qiagen, Hilden, Germany)和表达谱的比较。结果．与非恶性的RC-124细胞相比，Caki-1和786-O细胞的增殖率显著增加，而RCC4和A498细胞的增殖则减弱。表达分析显示，52种细胞因子和趋化因子主要参与增殖和炎症反应，不仅在恶性和非恶性肾细胞中有差异表达，而且在四种RCC细胞系中也有差异表达。结论．这是第一个比较84种细胞因子和趋化因子在四种肾细胞癌细胞系和非恶性肾细胞系中的表达的研究。VEGFA、NODAL和BMP6与RCC细胞系增殖相关，因此，可能代表RCC进展、RCC诊断和预后的推定临床生物标志物。

1.介绍

肾细胞癌(RCC)是泌尿道最致命的肿瘤，因为大多数患者在非常晚期才被诊断出来[1，2]。肿瘤的进展基于多种分子机制，因此，有必要对RCC肿瘤生物学进行进一步的研究，以了解其进展，进而识别新的生物标志物，为RCC的诊断和预后提供依据[1，3.- - - - - -5]。

在其他机制中，细胞因子和趋化因子被怀疑在各种恶性肿瘤的增殖和进展中发挥着关键作用。例如，CCL11控制卵巢癌中的癌细胞生长和侵袭，而CCL21和CCR7代表膀胱癌进展的关键调节因子[6，7]。此外，IL17作为白细胞介素的代表，与肺癌和结直肠癌的进展有关，并预测乳腺癌的不良预后[8- - - - - -10]。尽管一些研究表明这对RCC有影响，但细胞因子和趋化因子在RCC进展中的作用尚不清楚[1，11，12]。从临床的角度来看，细胞因子和趋化因子的分泌进入血液使它们非常适合作为无创的临床标志物。

在本研究中，我们使用了一个由四种恶性肾细胞癌细胞系和一种非恶性肾细胞系组成的肾细胞癌模型系统。在对细胞生长速率高和低的细胞系中的RCC细胞进行分类后，一份针对84种细胞因子和趋化因子的转录谱(见表1)1)，并与相应的细胞生长性能进行了比较。该分析的目的是通过恶性和非恶性表达模式的比较，确定与细胞生长相关的细胞因子和趋化因子，特别是关于RCC进展推定的生物标志物的鉴定。


数量	象征	描述	可检测的

趋化因子
1	C5	补充组件5	+
2	CCL1	趋化因子(C-C motif)配体1	−
3.	CCL2	趋化因子配体2	+
4	CCL3	趋化因子配体3	−
5	CCL5	趋化因子配体5	+
6	CCL7	趋化因子(C-C基序)配体7	+
7	CCL8	趋化因子(C-C基序)配体	−
8	CCL11	趋化因子配体11	+
9	CCL13	趋化因子配体13	+
10	CCL17	趋化因子(C-C motif)配体17	−
11	CCL18	趋化因子(C-C基序)配体	−
12	CCL19	趋化因子(C-C基序)配体	−
13	CCL20	趋化因子配体20	+
14	CCL21	趋化因子配体21	+
15	CCL22	趋化因子配体22	−
16	CCL24	趋化因子(C-C基序)配体	−
17	处于受控	趋化因子(C-X-C motif)配体1	+
18	CXCL2	趋化因子配体2	+
19	CXCL5	趋化因子(C-X-C基序)配体	+
20.	CXCL9	趋化因子配体9	−
21	CXCL10	趋化因子(C-X-C motif)配体	+
22	CXCL11	趋化因子(C-X-C motif)配体	+
23	CXCL12	趋化因子(C-X-C基序)配体	+
24	CXCL13	趋化因子(C-X-C motif)配体	−
25	CXCL16	趋化因子配体16	+
26	CX3CL1	趋化因子(C-X3-C motif)配体1	+
27	GPI / AMF	Glucose-6-phosphate异构酶	+
28	IFNA2	干扰素α2	+
29日	MIF	巨噬细胞迁移抑制因子	+
30.	PPBP	前血小板碱性蛋白(趋化因子(C-X-C基序)配体7)	+
31日	SPP1	磷蛋白质分泌1	+
32	XCL1	趋化因子(C motif)配体1	−
生长因子
33	BMP2	骨形成蛋白2	+
34	BMP4	骨形态发生蛋白	+
35	BMP6	骨形态发生蛋白	+
36	BMP7	骨形态发生蛋白	−
37	据	睫状神经营养因子	+
38	CSF1	集落刺激因子1(巨噬细胞)	+
39	CSF2	集落刺激因子2(粒细胞-巨噬细胞)	+
40	CSF3	集落刺激因子3(巨噬细胞)	+
41	生活	白血病抑制因子(胆碱能分化因子)	+
42	MSTN	肌肉生长抑制素	+
43	节点	节点相同器官(鼠标)	+
44	OSM	制瘤素M	+
45	TGFB2	转化生长因子，beta 2	+
46	THPO	促血小板生成素	−
47	VEGFA	血管内皮生长因子A	+
肿瘤坏死因子超家族
48	CD40LG	CD40配体	−
49	FASLG	Fas配体(TNF超家族，成员6)	−
50	英国网球协会	淋巴毒素(TNF超家族，成员1)	−
51	LTB	淋巴毒素β (TNF超家族，成员3)	+
52	肿瘤坏死因子	肿瘤坏死因子	+
53	TNFRSF11B	肿瘤坏死因子受体超家族，成员11b	+
54	TNFSF10	肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10人	+
55	TNFSF11	肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员11人	−
56	TNFSF13B	肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员13b	+
白细胞介素
57	IL1A	白介素1α	+
58	IL1B	白介素1,β	+
59	IL1RN	白介素1受体拮抗剂	+
60	IL2	白介素- 2	+
61年	IL3	白细胞介素3(集落刺激因子，多重)	−
62年	IL4	白介素4	−
63年	IL5	白细胞介素5(集落刺激因子，嗜酸性粒细胞)	−
64年	白细胞介素6	白介素6(干扰素，β 2)	+
65年	IL7	白介素7	+
66年	IL8	白介素8	+
67年	IL9	白介素9	−
68年	IL10	白介素10	−
69年	IL11	白介素11	+
70年	IL12A	白细胞介素12	+
71年	IL12B	白介素12 b	−
72年	使用IL13	白介素13	−
73年	IL15	白介素15	+
74年	IL16	白介素16	−
75年	IL17A	白细胞介素17	−
76年	IL17F	白介素17 f	−
77年	IL18	白细胞介素18(干扰素-诱发因子)	+
78年	IL21	白介素21	−
79年	IL23A	白介素23,p19亚基	+
80年	IL22	白介素22	−
81年	IL24	白介素24	−
82年	IL27	白介素27	+
细胞因子
83年	ADIPOQ	含脂联素、C1Q和胶原结构域	−
84年	IFNG	干扰素γ	−

2.材料和方法

2．1．细胞培养

使用RCC细胞株Caki-1, 786-O, A498 (cell lines Service, Eppelheim, Germany)， RCC4 (Sigma-Aldrich, München, Germany)和非恶性肾细胞株RC-124 (cell lines Service)。cki -1和A498细胞在添加79.6 mg/l非必需氨基酸、2 mM l -谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、1%青霉素/链霉素(P/S)和10%胎牛血清(PAN Biotech, Aidenbach, Germany)的最低必需培养基(MEM)中培养。786-O细胞在含2 mM l -谷氨酰胺、1% P/S和10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中增殖(PAN Biotech);RCC4细胞在1 mM丙酮酸钠、1% P/S和10%胎牛血清(PAN Biotech)的Dulbecco 's Modified Eagle培养基(DMEM)中培养;在含有2 mM l -谷氨酰胺、1% P/S和10%胎牛血清的McCoy’S 5a培养基中培养rh -124细胞(PAN Biotech)。所有细胞在潮湿的环境中繁殖(37°C, 5% CO)₂）.

2．2．扩散分析

细胞计数检测细胞增殖(CASY细胞分析仪，罗氏应用科学，曼海姆，德国)。用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)处理分离贴壁细胞，将细胞悬浮在CASYton (Roche Applied Science)中，稀释倍数为1:100。使用150的毛细管进行测量μm直径和细胞系特异性门设置，以区分活细胞、死细胞和细胞碎片(Caki-1: 8.57μ15.4米/μ米,786 - o: 6.9μ14.7米/μ米,RCC4: 8.5μ15.75米/μm - 498: 7.2μ15.75米/μm和RC-124: 6.5μ12.75米/μ米)。

２．３．定量DNA阵列

RCC细胞和非恶性RC-124细胞在6孔细胞培养板上培养至80%的一致性，并制备总RNA (peqGOLD TriFast试剂，Peqlab Biotechnology, Erlangen, Germany)。84种人类细胞因子和趋化因子的分析(表1)，采用人细胞因子和趋化因子RT²Profiler PCR Array (Qiagen, Hilden, Germany)根据供应商说明书(http://www.sabiosciences.com）.简单地说,0.5μg总RNA进行逆转录，在CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Munich, Germany)上进行聚合酶链反应(PCR)，使用CFX Manager软件(Bio-Rad)进行分析。

２.４.酶联免疫吸附试验(ELISA)

白细胞介素6、IL8 IL11、IL15和VEGF浓度在细胞培养上清液的碾压混凝土细胞和良性的rc - 124细胞是由使用有针对性的DuoSet ELISA试剂盒与衬底试剂包包含稳定的过氧化氢和tetramethylbenzidine(所有研发、明尼阿波利斯,美国)根据供应商的指令。细胞沉淀(1.3 × g, 5分钟)，上清与捕获抗体孵育(过夜，4°C)，并使用带有OPTIMA软件2.10的BMG FLUOstar OPTIMA Microplate Reader (BMG Labtech, Offenbach, Germany)测定可溶性抗原。每个样品都进行了重复分析。

2．5．统计数据

数据评价使用图形统计软件GraphPad Prism V5.01 (GraphPad software, La Jolla, CA, USA)。使用Multibase 2015软件(NumericalDynamics.Com, Tokyo, Japan)进行主成分分析(PCA)。

3.结果

与Caki-1和786-O细胞的增殖率高于非恶性RC-124细胞相比，RCC4和A498细胞的细胞生长明显减少(图)1）.这些增殖差异促使我们研究细胞因子和趋化因子是否可能控制RCC细胞株的个体生长特性。

执行RT²profile PCR Array人类细胞因子和趋化因子，84种靶mrna的表达(表1)测量。在这84个因子中，我们在细胞内mRNA水平检测了5种细胞因子IL6, IL8, IL11, IL15和VEGF，通过ELISA在细胞外蛋白水平进行验证。IL6、IL8、IL11、IL15和VEGF的mRNA浓度似乎与RCC细胞和非恶性肾细胞的分泌蛋白水平相对应(图)2）.IL6、IL8和IL15的转录模式与所有细胞系的分泌蛋白水平非常相似。而在Caki-1细胞中，il - 11蛋白的分泌水平较低，VEGF蛋白的分泌水平较高，与细胞内mRNA的分泌水平存在差异。786-O细胞的结果正好相反。然而，细胞因子mRNA和蛋白水平的比较显示出明显的相关性，说明mRNA阵列可用于细胞因子和趋化因子的表达分析。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

图2

比较所选细胞因子的mRNA水平和蛋白水平。采用定量DNA阵列(人细胞因子和趋化因子RT)检测IL6 (a)、IL8 (b)、IL11 (c)、IL15 (d)和VEGF (e)细胞内mRNA水平和细胞外蛋白水平的稳态水平²分析器PCR数组;酶联免疫吸附试验(ELISA)分析。mRNA的表达量是相对于非恶性RC-124细胞的mRNA水平(RC-124 mRNA = 1.0)。蛋白表达为pg蛋白/ml细胞培养上清。

此外，采用全局归一化主成分分析进行质量检测。PCA对所有5个细胞系中检测到的所有细胞因子和趋化因子的浓度进行分析(图)3.)分裂癌症和非癌症细胞(PC1)，并定义所有细胞系(PC2)的个体特征。正如预期的那样，本研究中使用的五种细胞系被正确地分为两大类，分别对应于恶性与良性的生理机能。

图3

细胞因子和趋化因子表达的主成分分析(PCA)。786 - o, RCC细胞株Caki-1 RCC4, A498以及良性的肾细胞系rc - 124被绘制在一个二维坐标平面上定义的主成分1 (PC1)和2 (PC2)分析细胞因子和趋化因子的表达数据衡量人类DNA阵列(细胞因子和趋化因子RT²分析器PCR数组;试剂盒)。恶性细胞的聚集用灰色三角形表示。

执行人类细胞因子和趋化因子RT²Profiler PCR Array，分析每个细胞系的各种细胞因子和趋化因子的表达，并与非恶性细胞系RC-124进行比较。以下32种细胞因子和趋化因子未表达:ADIPQ、BMP7、CCL1、CCL17、CCL18、CCL19、CCL22、CCL24、CCL3、CCL8、CD40LG、CXCL13、CXCL9、FASLG、IFNG、IL10、IL12B、IL13、IL16、IL17A、IL17F、IL21、IL22、IL24、IL3、IL4、IL5、IL9、LTA、THPO、TNFSF11、XCL1。

与RC-124细胞相比，52个因子被调节(图)4）.趋化因子组(图4(一))以过表达CCL20、CXCL10为主，最主要的是CCL5，过表达超过100倍。最引人注目的是这三种趋化因子在A498细胞中的强烈上调，甚至与其他RCC细胞系相比也是如此。在生长因子家族中，显示了更均衡的因子分布模式(图)4 (b)）.然而，四种恶性细胞系中仅检测到CNTF、CSF1、CSF3、LIF、MSTN和VEGFA。

(一)

(b)

(c)

(d)

图4

细胞因子和趋化因子在RCC细胞系中的表达谱。通过DNA芯片(Human cytokine & chemokines RT)检测RCC细胞株Caki-1、786-O、RCC4和A498以及非恶性肾细胞株RC-124中细胞因子和趋化因子的表达数据²分析器PCR数组;Qiagen)，并以相对mRNA表达，归一化至非恶性的RC-124细胞(RC-124 = 1.0)。细胞因子和趋化因子被分为四组:趋化因子(a)、生长因子(b)、TNF超家族成员(c)和白细胞介素(d)。

检测到五名TNF超家族成员(图4 (c)）;然而，只有TNFSF13B在所有四种恶性细胞系中强烈过表达，在cki -1和RCC4细胞中过表达高达25倍。考虑到白细胞介素家族(图4 (d))，共检测到13种不同因子在4种恶性细胞系中均表达上调的白细胞介素IL1A、IL1B和IL1RN。

4.讨论

肿瘤发生的过程是由多种机制驱动的，包括增殖增加、血管生成和免疫调节[13]。一般来说，细胞因子和趋化因子主要是免疫防御的调节因子。特别是CCL5通过整合素诱导支持白细胞增生[14，15]。有趣的是，CCL5在所有四种RCC细胞系中表达均高表达。由于肿瘤的发生与炎症反应有关，RCC细胞分泌CCL5的升高可能是肿瘤相关炎症的一部分。与此观察相对应的是，我们发现促炎白细胞介素IL1A和IL1B在四种RCC细胞株中表达水平均升高。有趣的是，抗炎IL1RN的过度表达[16]只能在低增殖的RCC4和A498细胞中观察到。这可能意味着IL1RN可能会干扰抗增殖途径，或者抗炎过程通常会减弱细胞生长。

在TNF超家族中，TNFSF13B在所有四种RCC细胞系中都显著过表达。观察高增殖Caki-1和786-O与低增殖RCC4和A498细胞株的细胞生长的巨大差异，然而，正如之前的研究所做的那样，将TNFSF13B分类为RCC中的增殖因子[17这一消息无法得到明确证实。

正如预期的那样，增殖细胞因子的表达水平，例如CSF-1、CSF-3、node和VEGFA，与高增殖(Caki-1, 786-O)和低增殖(RCC4, A498) RCC细胞的细胞生长速率相关。这一观察结果已被几项研究证实。CSF-1和VEGFA表达与RCC进展和患者生存不良预后相关[11，18，19]。此外，TGF的一个成员NODAL的水平升高β超家族，赋予增强的致瘤性[20.- - - - - -23]。如预期的，强烈过表达的增殖因子，例如VEGFA和NODAL，可能是肾细胞癌新的预后标志物。

反之，在低增殖的RCC4和A498细胞中BMP6的表达显著增加，而在高增殖的Caki-1和786-O细胞中未检测到BMP6的表达。由于BMP6被认为是乳腺癌中的肿瘤抑制因子[24]，与非恶性细胞系RC-124相比，RCC细胞中BMP6的上调可能有助于抑制RCC4和A498细胞的生长。

综上所述，有许多细胞因子和趋化因子不仅在恶性和非恶性肾细胞中有差异表达，而且在四种RCC细胞系中也有差异表达。这些结果可能反映了肾细胞癌患者之间以及肾细胞癌亚型之间的异质性。此外，这可能表明，由于参与细胞因子/趋化因子信号转导的替代因子的激活，细胞因子/趋化因子系统成员的功能替代。值得注意的是，两种增殖因子(VEGFA, node)和一种肿瘤抑制因子(BMP6)可能与RCC的恶性表型密切相关，因此可能适合作为RCC诊断和治疗的新标记蛋白。

的利益冲突

作者没有利益冲突需要披露。

作者的贡献

Nadine Gelbrich和Hannes Ahrend对这项研究做出了同样的贡献。

致谢

作者感谢Katja Wittig出色的技术支持。

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分析细胞病理学

摘要