用猪血进行脂肪酸分析的干血点卡片的研究

摘要

脂肪酸，特别是-3和-6脂肪酸，对动物的生殖健康和心血管健康很重要。传统上，脂肪酸监测是使用血清和血浆等冷冻血液组分进行的，但随着分析技术的进步，已开发出一种在Ahlstrom 226级滤纸上采集干燥全血微量样本的方法，可以提供动物长期脂肪酸状态的信息。采用传统冷冻法和干血斑卡(DBS)两种方法采集5头公猪的血液样本。DBS样本是用未经处理的注射器和试管采集的，大约有320个样本μ在每张卡片上放置了大约80块血液μL每点(4点)。采用Mann-Whitney统计分析对两组样本进行比较U-测试并确定DBS样本是否与传统全血样本相似。在可测量浓度的30种脂肪酸和脂肪酸组中，只有四种单独的脂肪酸，即贝母酸、ω-3二十二碳五烯酸、神经酸和肾上腺素酸，具有统计学差异。这些差异中的大多数都很小，并且可以通过e由于分析错误或污染。样品类型之间的比较发现关键欧米茄脂肪酸和多不饱和脂肪酸的浓度相似，并支持使用DBS采集作为一种侵入性较小的血液采集和脂肪酸分析方法。

1.介绍

脂肪酸是支持动物总体健康的关键饮食成分。omega-3和omega-6脂肪酸尤其有助于维持细胞膜结构和功能，支持免疫反应，并能影响动物的生殖和心血管健康[1.–3.］．在人类中，补充饮食中的多不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，已被用于治疗疾病，如甘油三酯升高、胰岛素抵抗和代谢性炎症[4.］．此外，饮食和循环中的EPA和DHA与心血管疾病患病率呈反比关系，较高水平的EPA和DHA可降低心血管疾病的风险[5.].各种生物标记物（包括脂肪酸）的血液测量有助于确定动物营养素的最佳膳食摄入[6.,7.］．通常，这些血液生物标记物在血清或血浆中进行分析;然而，与血清或血浆浓度提供的短期脂肪酸状态(几天到几个月)相比，全血已被发现反映了长期脂肪酸状态[8.,9］．

近年来，分析方法的进步不断提高，利用微样本分析脂肪酸和其他生物标志物的能力已经引起了各种物种的兴趣[10］．一种脂肪酸微量采样方法是使用特制的滤纸和通过传统采血采集的全血小滴。全血滴可以在卡片上晾干，然后可以用来分析疾病和营养标记，包括脂肪酸[10,11］．使用干血点卡采集全血在无法适当储存全血的情况下特别有用，例如野外工作。虽然DBS方法已经在人类的许多检测中得到验证，但在其他物种中验证DBS的资源很少[12］．

本研究的目的是评估DBS是否适合测量动物全血脂肪酸。它也提供了有限的数据全血DBS样本的断奶猪。我们比较了全血和DBS样本在采集后一周内的分析结果。

2.材料和方法

2017年秋季，从五头无关的去势家猪身上采集全血(野猪家)重量介于6.8和9.1之间断奶时体重为kg。断奶前，猪以母猪的乳汁为日粮，母猪以玉米和豆粕为基础混合哺乳日粮喂养。在断奶期间定期兽医健康检查期间，从每头猪的颈静脉采集血液。血液收集在未经处理的注射器和试管中，并直接输送给猪收集后，将其交给Perkinlemer Spot Saver卡（马萨诸塞州Perkinlemer Waltham）。这些卡由Ahlstrom 226级滤纸制成，经过测试和验证，符合疾病控制中心（CDC）和食品和药物管理局（FDA）的规范用于干血采集。这些规范包括滤纸为100%纯棉纤维，不含湿强度添加剂，pH值在5.7和7.5之间，灰分含量不超过0.1%[13］．这些规范确保了实验室和测试的一致性，并提高了它们的生物稳定性。每个血卡上的四个点都收到了大约80份μL血，一共320人μ每只动物每卡4头猪。5人的血^thpig应用于3张卡片上的所有斑点。单个血点足以进行脂肪酸分析，但如果斑点质量差或受到污染，则收集额外的斑点。这些卡片在装运至北卡罗来纳州州立大学之前一直保存在室温下。还从每只动物身上收集了一份肝素化全血样本，用于肛门检查冰封−80°C。收集后一周内，将所有五个冷冻肝素化样品和五张spot卡发送至Lipid Technologies（Austin，MN）进行完整的脂肪酸分析。另外两张来自5号猪的卡片保存在室温（约23°C）下分别为一年和两年，然后送往Lipid Technologies进行分析。

对照全血(WB)样本的比较(N= 5)和干血斑(DBS) (N= 5)通过使用Mann-Whitney非参数统计的手工计算进行U以及与α= 0.05来确定WB是否与DBS不同。此外，从5号猪的WB、初始DBS以及1年和2年的DBS样本之间进行了视觉评估。

3.结果

在分析的36个个体脂肪酸和10个脂肪酸组中，20个个体脂肪酸和所有10个脂肪酸组都有可测量的浓度(表)1.）．当比较所有5头猪的WB和DBS时，4种脂肪酸有统计学显著差异。全血山梨酸(22:0)、二十碳五烯酸(Osbond) (DPA, 22: 5w6)和神经酸(24:1)低于DBS，但肾上腺酸(22:4w6)高于DBS。


类型	星展银行								白平衡
猪ID	1.	2.	3.	4.	5.	平均的	5.^2.	5.^3.	1.	2.	3.	4.	5.	平均的

脂肪酸
肉豆蔻酸(14:0)	1	1．25	1.35	1.33	0.98	1．18	0.87	0.66	1．25	1.04	1．40	1．39	1．05	1.23
棕榈酸（16 : 0)	25.75	25.68	25.01	26.24	22.34	25.00	24.14	25.14	25.68	26.10	25.64	27.70	23.49	25.72
棕榈烯酸(16:1 w7)	4.44	4.19	4．25	5.10	6.40	4.88	5.92	5.95	4.40	3.99	4.29	4.64	6.57	4.78
硬脂酸(18:0)	7.65	9.05	8.63	8.43	7.28	8．21	10.56	9.55	7.94	9.37	8.47	8.66	6.89	8.27
油酸（18 : 1w9）	22.41	20.50	24.56	24.92	22.06	22.89	24.45	26.56	22.98	20.30	24.44	24.11	21.85	22.74
亚油酸(18:2w6)	27.65	28.49	24.51	23.70	29.47	26.76	25.20	23.82	27.08	28.66	24.30	23.89	29.53	26.69
γ-亚麻酸（18 : 3w6）	0.29	0.28	0.38	０．２７	0．30	0．30	0．30	0	0.23	０．２６	0.34	0.20	0.33	０．２７
花生二酸(20:0)	0.16	0.19	0.15	0.08	0	0.12	0.11	0	0.21	0.15	0.12	0.07	0	0.11
泡林酸(20:1w7)	0.11	0．24	0．24	0.12	0.17	0.18	0.15	2.34	0.11	0.21	0．25	0.09	0.21	0.17
α-亚麻酸(18.3 w3)	0.53	0.58	0．56	0.51	0.58	0．55	0．50	０．４０	0．56	0.51	０．５２	0.42	０．５９	０．５２
二十烯酸(20:2w6)	０．２７	０．２７	0．25	0.15	0.32	0．25	0.29	0.29	0.28	０．２６	0.29	0.21	0.23	0．25
h-γ亚麻酸(20:3w6)	0．35	0.45	0.33	0.38	0．41	0.38	0.32	0.28	0.33	０．４０	0．30	0.32	0.36	0.34
花生四烯酸(20:4w6)	6.19	6.12	6.78	5.85	6.90	6.37	4.16	3.39	6.34	6.17	6.93	5.86	6.38	6.34
环保署（20） : 5w3）	0.18	0.20	0.17	0.18	0.16	0.18	0.15	0.22	0.18	0.20	0.15	0.14	0.17	0.17
山楂酸(22:0)	0.31	0.29	0．25	0．41	0．30	0.31^A.	0．48	0.32	0.03	0.07	0.04	0.08	0.08	0.06^B
肾上腺素(22:4w6)	0.49	０．４７	0．50	０．５２	0．48	0.49^A.	０．２６	0.06	０．５２	0.54	0.61	0．55	0.51	0．55^B
DPA（渗透键酸）（22 : 5w6）	0.32	0.34	0.32	0.39	0.36	0．35^A.	0.13	0.08	0．24	0.32	０．２６	0.34	0．30	0.29^B
盐酸(22:5w3)	0．69	０．５９	0.60	0.58	0.51	０．５９	0.38	0．25	0．56	0．65	0．56	0.61	0.49	0．57
DHA (22: 6w3)	1.02	0.66	1.02	0.62	0.86	0．84	0．55	0.19	0.98	0．71	0.96	0.62	0.92	0．84
神经酸(24:1)	0.19	0.18	0.14	0.20	0.10	0.16^A.	0.15	0.10	0.11	0.09	0.12	0.10	0.05	0.09^B
饱和烃	34.87	36.46	35.40	36.50	30.91	34.83	36.15	35.66	35.11	36.73	35.68	37.89	31.52	35.39
单烯	22.70	20.91	24.94	25.25	22.33	23.23	25.38	29.04	23.20	20.60	24.81	24.30	22.11	23.00
PUFA	37.98	38.44	35.41	33.15	40.36	37.07	32.55	29.35	37.29	38.68	35.22	33.17	39.80	36.83
HUFA	9.24	8.83	9.71	8.53	9.68	9.20	6.26	4.69	9.14	9.00	9.78	8.44	9.12	9.10
总w3	2.43	2.03	2.35	1.88	2．11	2.16	1.73	1．42	2.28	2.08	2.19	1.79	2.16	2．10
总w6	35.55	36.41	33.07	31.27	38.25	34.91	30.66	27.93	35.01	36.60	33.04	31.37	37.64	34.73
总计w9	22.59	20.68	24.70	25.12	22.16	23.05	25.23	26.70	23.09	20.39	24.56	24.21	21.90	22.83
将/ w3	14.65	17.93	14.10	16.60	18.12	16.28	17.75	19.62	15.34	17.60	15.12	17.50	17.41	16.59
欧米伽- 3 HUFA	20.48	16.44	18.37	16.17	15.80	17.45	19.62	18.61	18.83	17.45	17.05	16.25	17.22	17.36
ω- 6 HUFA	79.52	83.56	81.63	83.83	84.20	82.55	80.38	81.39	81.17	82.55	82.95	83.75	82.78	82.64

^1.(不同的标^a、b)的平均值列在( )对于DBS，与WB相比。^2.样本代表在室温下持有1年的DBS卡，不包括在DBS平均值中。^3.样本代表在室温下持有2年的DBS卡，不包括在DBS平均值中。

当将5头猪的1年和2年储存样本与该猪的初始DBS和全血样本进行比较时，可以看到大多数脂肪酸和酸组的视觉差异。这些差异仅仅是基于在所有样本组中观察到的浓度之间的定性比较。没有统计分析是适当的，因为样品只能从单一的动物。

4.讨论

在DBS和WB样本中有统计差异的四种脂肪酸都是低浓度的脂类，除了山梨酸，在只有一到两个样本中受到相当大的比例差异的驱动，卡源样品中山梨酸的持续较高值可能表明DBS卡纤维或环境污染物的干扰。不幸的是，没有空白卡作为阴性对照，因为之前的测试是由开发者和CDC和FDA制定的标准没有表明需要[13］．如果确实发生了污染，很可能是在动物围场收集时发生的，而不是在被污染的卡片上。然而，控制卡将被考虑在未来的研究。总的来说，我们的研究提供了强有力的证据，为使用DBS收集作为替代液体WB收集猪，当样品可以在提取后不久进行分析。DBS可用于在困难的自由放养野外条件下高效取样，也可用于因任何原因无法提供大血量样本的动物。这些DBS样品也更容易运输，因为它们可以保持在环境温度下，干燥过程导致减少病原体载量，并且在许多地区，干燥样品的运输被认为是豁免的非管制材料[10,14]。这些因素可减少样本收集和管理的总成本。

这些样品中脂肪酸组成的少数差异对脂肪酸研究来说是令人鼓舞的，特别是涉及omega脂肪酸和PUFAs的研究，因为这些类别中的关键脂肪酸没有差异。最容易被降解的脂肪酸[15]，EPA，DHA和花生四烯酸在统计学上没有显著差异。这意味着DBS样本应提供一种更快的采集方法，与传统全血采集结果具有可比性。

当将储存时间作为5号猪DBS样品的一个因素时，在原始的“新鲜”样品和在室温下储存1或2年的样品之间存在着潜在的差异。由于低N，这无法进行统计分析。收集这些长时间的样本并不是这个项目的目标;然而，通过时间后采样和存储技术，可能需要进一步研究DBS卡的有效性。

虽然这个数据集在广度上是初步的，但它为比较营养研究领域提供了有价值的信息。目前正在研究在外来物种中使用全血脂肪酸DBS卡，这些物种可能无法获得大的血液样本、大的样本群体和血液样本处理(或温度管理)。目前，有研究使用DBS分析管理和自由放养的东方盒(Terrapene卡卡)及常见啮(Chelydra serpentina)乌龟[16]及放养的绿海龟(龟鳖目mydas)和坎普的雷氏海龟(肯氏龟) ［17］．通过利用猪作为外来哺乳动物的国内模型，该数据集提供了强有力的证据，DBS可以用于外来哺乳动物样本和爬行动物样本。

5.结论

液体全血和DBS样本的比较支持DBS采集作为一种侵入性较小的血液采集和脂肪酸分析方法。分析的脂肪酸浓度在两种收集方法之间是相似的，包括关键的omega脂肪酸和PUFAs，这对许多物种的心血管和一般健康至关重要。对存在差异的四种脂肪酸应谨慎分析，对山梨酸问题应进一步研究。从5号猪采集的DBS储存样品的差异表明，储存时间是有限的，需要进一步研究来评价温度和湿度储存条件对样品稳定性的影响。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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