文摘
考虑到高生物技术相关的潜在的酵母可食用的水果,这些微生物的筛选,进行酒精发酵,在camu-camu成熟水果(Myrciaria dubia,肯)。果实收集从巴西亚马逊河以北,泛滥平原的Cauame河。酵母是孤立的,发酵能力评估使用杜伦管。进行了定量分析计算乙醇产量(g g−1),比生长速率(h−1),和乙醇生产力(g L−1·h−1)。分类识别是由核糖体基因核苷酸序列分析使用BLASTN对齐。总共15酵母殖民地被孤立,他们三个有前途的葡萄糖发酵乙醇的能力。这些隔离标识为假丝酵母orthopsilosis,毕赤酵母属kudriavzevii,Meyerozyma caribbica。在肉汤培养含有180克·L−1的葡萄糖,m . caribbicaCC003最大理论乙醇浓度达到91.7% (84.4 g·L−1),呈现一个乙醇产量和生产力0.4688 g·g−1和0.781 g·L−1·h−1,分别。这些结果表明一个有前途的潜在的生物处理应用程序隔离。本文是一种罕见的报告c . orthopsilosis内寄生的习惯,因为大多数的引用说明人类病原体。除此之外,m . caribbica是一个有前途的发酵罐酒精饮料由于其osmotolerance和高乙醇产量。这是第一篇论文报告植物内生酵母菌的果实Myrciaria dubia。
1。介绍
酵母真菌微生物的王国现在无性生殖的裂变或出芽和有性生殖结构(不是子实体1]。有超过2500种和公认的专业文献中描述2),尽管这个数字,只有大约80种用于生物工艺在实验室规模和几个十二多用于工业过程(3]。
亚马逊是世界上最大的热带雨林,包含大约220种食用水果(4),包括camu-camu (Myrciaria dubia桃金娘科、桃金娘目Magnoliopsida,被子植物门植物界)。水果都是潜在的各种各样的微生物的自然栖息地,因为大量的糖和水,有利于扩散的酵母,主要是那些酒精发酵的能力。尽管所有这些潜力,研究酵母社区联系亚马逊水果稀缺,一些约会二十多年前(5]。
Myrciaria dubia吸引了大量的关注,因为它显著的生物活性化合物的数量(6]。尤其是他们的抗氧化活性,水果已经使用了功能性食品生产,包括手工啤酒抗坏血酸浓度高(7]。除此之外,没有具体研究发表关于微生物群与它们的叶子,根或果实。相关的说明对酵母这种植物可能会导致新菌株生物燃料和食品行业的适用性。
在这种背景下,对分类的目的和生物技术应用,抽样的努力是一个必要的方法。这项工作的目的是确定酵母分离出的果实Myrciaria dubia能够执行酒精发酵和评估一些沿着发酵过程动力学参数。
2。材料和方法
2.1。抽样和酵母隔离
熟的果实m . dubia收集从灌木丛中手动(Cauame河泛滥平原,2°51′54.79 N, 60°39′44.19 W)和维护下制冷(4°C±2)直到处理(约2小时)。果实在淡水洗除去宏观粒子,沉浸在次氯酸钠溶液(1% v / v)为1分钟,1分钟和乙醇70%,最后,在无菌蒸馏水洗了2分钟。表面去污后,水果被存储在一个无菌的容器在室温下直到开发一个类似面包或酒精饮料的香气在7天(样品处理后的第一天,他们收集并没有现在的殖民地增长)。然后,他们的皮被移除,中果皮捣碎在无菌蒸馏水(1:10 w / v)。
100年整除μL在盘子传播包含花边琼脂(葡萄糖10 g·L−1酵母提取物3 g·L−1、麦芽提取物3 g·L−1蛋白胨5 g·L−1琼脂20 g·L−1pH值5.0),板块在孵化28°C到48 h。殖民地呈现典型的酵母形态分离并存储在消毒矿物油。
2.2。发酵化验
定性进行发酵试验,评价的功能分离发酵葡萄糖,D-xylose,蔗糖和麦芽糖。每个隔离的铂环量接种在含有液体的管子组成的媒体各自的糖(40 g·L−1)和酵母提取物(10 g·L−1)。管是孵化之前14天在28°C和评估每24 h确定发酵,证明通过气体保留到杜伦管(8]。在这些化验,最后细胞浓度相当于1.0麦克法兰规模,他们进行了一式三份。
一些隔离被选为定量测试,除了osmotolerance评估,根据其生长在高渗透压的能力(π= 24.68 atm),根据Jimoh et al。9]。隔离接种在250毫升厄伦美厄烧瓶内包含100毫升的浓汤(pH值5.0)由葡萄糖(180 g·L−1)和酵母提取物(10 g·L−1)和孵化28°C和120 rpm直到120 h。发酵是由测量的质量监控每12 h有限公司2发布,根据Dijck et al。10]。总培养液大约5 g·L−1(干重),根据部分动力学参数进行了评估2。4。
2.3。分类识别
酵母发酵能力被确定使用D1、D2 26 s rDNA基因的核苷酸序列。根据前面的描述(基因组DNA提取11使用引物PCR技术)和放大NL1和NL412]。的扩增子被用于测序反应使用BigDye工具包(应用生物系统公司®),使用3500自动获得基因核苷酸序列分析仪(应用生物系统公司®)。通过对齐基因库的序列比较数据库使用在线工具BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
2.4。动力学参数和分析方法
乙醇浓度([EtOH], )发酵是由化学计算,如前所述[10]。比生长速率(μ马克斯h−1)计算方程 ,在[EtOH]n/ (EtOH)我之间的关系是当前和初始沿着日志阶段和乙醇浓度t在几个小时的时间,根据Duarte et al。13]。
乙醇产量(YEtOH, )计算之间的关系质量的乙醇生产和消耗葡萄糖的质量。乙醇生产力(问EtOH, )是由之间的关系计算前的最后发酵乙醇浓度和总时间固定相。总还原糖浓度((TRS), )确定了使用二硝基水杨酸(DNS)方法。整除的20μL的样品(蒸馏水稀释,1:10 v / v)与180年涨跌互现μ蒸馏水和300 LμL (DNS解决方案。煮5分钟后,1500年μL(添加蒸馏水,吸光度决心在540海里。(TRS)是使用公式计算得到的校准曲线。
3所示。结果
3.1。隔离和发酵能力
总共15个殖民地被孤立,被认同数字代码之前“CC”(由于camu-camu,方言形式在葡萄牙Myrciaria dubia)。超过一半是能发酵葡萄糖,和一些有能力发酵蔗糖。没有殖民地D-xylose和麦芽糖发酵能力。这项研究的结果发表在表1。
由于菌落形态和发酵,一些隔离被认为克隆:CC001 CC002;CC003、CC006 CC007;和CC004 CC005, CC015。因为呈现积极的结果在所有管子的定性分析,CC001 CC003, CC015选择定量发酵化验。
3.2。分类识别
总共有六个隔离标识,获得序列沉积在NCBI数据库加入PRJNA645409数量。根据表中标识隔离2。
3.3。动力学参数和分析方法
在化验的初始葡萄糖浓度180 g·L−1,毕赤酵母属kudriavzeviiCC001和假丝酵母orthopsilosisCC015提出最终的乙醇浓度的39.94(±2.21)和34.57 (±3.42)g·L−1,分别。这些结果相对应,分别为43.4和37.5%的理论最大值;出于这个原因,他们不被认为是有前途的发酵应用程序而不是为其他动力学参数进一步评估。
Meyerozyma caribbicaCC003提出最终的乙醇浓度的84.4(±3.18)克·L−1,相应的理论最大值的91.7%。最后(TRS)表示完全消耗的葡萄糖,这意味着这是osmotolerant隔离。YEtOH0.4688克·克吗−1,问EtOH= 0.781 g·L−1。h−1,μ马克斯h = 0.025−1。乙醇生产的动能m . caribbicaCC003呈现在图1。
4所示。讨论
的发生p . kudriavzevii据报道与开花和破水果苹果,梨,李子斯洛伐克西南部[14]。其与自然发酵了纸浆水果时描述微生物有关Ziziphus mauritiana筛选(15]。剥夺了et al。16报道其发生与腐烂的水果菠萝种植园在里约热内卢,巴西。此外,这种酵母报道的发生与腐烂的水果Byrsonimasp。5),一个共同的果期植物收集网站的工作。
p . kudriavzevii也被报道与自然发酵的谷物面团在西非(17),在中国白酒大曲(18),北巴塔哥尼亚酿酒的风土条件的一个组成部分(19]。在一起,这些事实表明p . kudriavzevii是一个典型的植物内生酵母菌与水果,包括m . dubia,适合人类食用。
大部分的报道c . orthopsilosis科学数据库中与人类健康相关的问题。这个物种是密切相关的c . parapsilosis,通常描述为一个共生体在人类皮肤和致病性酵母菌,开发人体组织入侵和破坏能力(20.]。稀缺的报告描述这个酵母相关联的果实仙人掌属植物一成不变(21和番茄22]。
它的发生是自然发酵中描述的棉花种子和大米饮料由巴西印第安人(23]。这个隔离可能属于c . parapsilosis种类复杂,进一步对其准确的识别方法必须被评估使用其他分子标记。因为作为一个病原分离的可能性,其在工业过程应避免使用,直到确定的分析分类识别和安全使用。
首先,Meyerozyma caribbica被形容为毕赤酵母属caribbica,区别p . guilliermondii(24]。从甘蔗模式菌株被隔离在古巴,这也解释了它的名字”caribbica。“进一步分析重新定位它在一个新的属,目前命名Meyerozyma(25]。
其报道发生在高盐度与根际土壤(在韩国26美国]和corn-derived淀粉颗粒在伊利诺斯州(1),与不同的订单双翅目昆虫(27]。m . caribbica也被报告为一个普遍的物种在自然湿发酵巴西的咖啡水果和豆类(28),在Mangifera籼水果在墨西哥(29日]。这些事实表明,这个物种是全球分布式和提供了一个世界性的习惯。
的生物技术应用m . caribbica包括其作为生物柴油生产的油质的酵母(30.),作为生物防治剂刺盘孢属、炭疽的水果Mangifera籼(31日]。酵母粉提出有效性甚至在6个月的存储。m . caribbica没有引起任何动物毒性或明显的细胞毒性活动(32]。它被用于混合剂酿酒酵母精神生产巴西朗姆酒(甘蔗),因为它能够产生乙酸乙酯和其他化合物类似水果的香气33]。一起,与水果相关自然发生,这表明m . caribbica食品行业是安全的。
定性发酵测试的结果证实了预测的文献,大多数属于子囊菌类的团体和酵母发酵葡萄糖的能力(5]。最终获得的乙醇浓度p . kudriavzeviiCC001类似观察不同野生型菌株与世隔绝Chamnipa et al。34]。可以解释观察到的低产量相对较低的孵化温度时获得的收益率最高温度超过40°C(使用35,36]。这种可能性必须重新评估,在进一步的研究项目。
乙醇生产的c . orthopsilosis获得的是类似于Chamnipa et al。34当使用一个野生型菌株。在酒精发酵低产量似乎是对这一物种的一个共同特征。
观察到的最大理论产量的百分比m . caribbicaCC003(91.7%)获得的收益率(84.9%)高于Sukpipat et al。37当使用的m . caribbica发酵葡萄糖(50 g·L−1)乙醇。Y的值EtOH观察到这里时获得的类似酿酒酵母和p . kudriavzevii被用来生产乙醇使用葡萄糖作为底物(38),当m . caribbica被用来生成一个新的甜高粱蒸馏饮料(39]。此外,YEtOH由CC003时获得的超过四倍的野生型菌株m . caribbica从越南、孤立的,被用来发酵葡萄糖乙醇(40]。
能够生长在中度到高葡萄糖浓度也呈现高乙醇产量显示osmotolerance和适用性的株高原始重力酿造发酵麦芽汁(41]。这些结果表明,m . caribbicaCC003是一个有前途的发酵罐应用食品和酒精饮料行业。
Q的值EtOH和μ马克斯低于所有的引用相比,表明发酵速度慢可能由于相对较小的初始接种体。温度和初始接种体因素需要调整进一步工作。
5。结论
本文是一种罕见的报告的内寄生的发生c . orthopsilosis因为大多数引用指示这个物种的人类病原体。有稀缺的论文报告与水果相关的自然发生和其他环境样品。其他分子标记必须评估建立安全的区别和致病性这一物种的谱系。除了展示乙醇产量高,Meyerozyma caribbicaCC003也带来了宽容高架大量的葡萄糖和乙醇。因此,它是一种很有前途的酒精饮料生产发酵罐。后续的工作将集中在酒精饮料的生产使用m . caribbicaCC003,评估其化学剖面、营养特性,和感官特性。
数据可用性
期间产生的所有数据或分析本研究包括在发表的这篇文章。
伦理批准
不适用。
同意
不适用。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
特别要感谢大学联邦德罗PRONAT,因为材料化验和大学联邦许可的亚马孙因为训练。这项研究受到了慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq) Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)和Fundacao德帕罗尽管带动做亚马孙(FAPEAM)。