结核分枝杆菌下一代全基因组测序：机会和挑战

抽象的

结核分枝杆菌耐药性是全球结核病控制的一个威胁。全面和及时的药敏确定对于提供对耐药结核病的适当治疗至关重要。表型药敏试验(DST)是药物治疗的金标准玉米菌菌耐药性测定。玉米菌菌全基因组测序（WGS）具有综合DST和流行病学调查的一站式方法。我们在这方面讨论了下一代WG在理解结核病分子流行病学和耐药机制的巨大机会。还讨论了患者管理和追踪及时公共卫生干预的患者管理和传动链追踪的潜在临床价值和公共卫生影响。我们展示了在低收入和中等收入环境中实施WG的当前挑战。WGS分析已经在实验室常规调整，以便在患者管理和公共卫生干预措施中，以低负担的高收入设置，如英国。我们预测，该技术将在高负荷环境中类似地进行调整，其中对该流行病的影响将是最大的。

1.介绍

为了抑制结核病（TB）的出现和传播（TB）耐药性，通过综合药物易感性测试（DST）了解的早期检测和有效治疗至关重要。对于监测和理解结核病毒性抵抗力的发展，演变，生物学和流行病学也很重要，以告知社区一级或公共卫生干预措施。Xpert MTB / RIF（Cepheid，Inc. Sunnyvale，CA，USA）等分子方法，以及线探针测定基因型MTBDR加/sl（Hain LifeScience，GmbH，Nehren，德国）的访问权限增加了DST和缩短了周转时间的结果。然而，这些方法为有限数量的药物提供阻力信息。结核分枝杆菌WGS是DST的一种有吸引力的方法，用于通知治疗决策和监测高负荷设置中的耐药性，其中对于具有TB的每个人的常规抵抗测试的能力不足。

对WGS数据的分析还可用于流行病学调查，如追踪传播链。在这份手稿中，我们回顾了如何玉米菌菌下一代WGS分析可能会影响耐药性的预测，又在高负荷环境中的结核病的临床管理。我们强调了如何分析玉米菌菌全基因组序列数据可以常规为单独的治疗，传播链追踪以及公共卫生干预措施的连续耐药监测提供指导。我们还研究了应用的挑战或障碍玉米菌菌WGS分析用于常规临床用途，特别是在资源限制TB高负荷国家。

2.提供的机会玉米菌菌全基因组测序

２.１.传动链调查

下一代测序（NGS）的出现使得WGS成为分子流行病学研究的更快，更实惠，更越来越多的替代方案。从WG生成的数据允许无与伦比的检测遗传变异能力玉米菌菌。WGS数据分析导致了重建玉米菌菌系统发育，这提高了我们对全球分布的理解玉米菌菌[1]．

WGS已被用来回答有关TB传输的问题，并且在不久的将来将成为常规方法玉米菌菌因为它具有优于传统类型方法的分辨率。研究表明玉米菌菌通过比较分离株之间的单核苷酸多态性（SNP）差异，可以估计基因组。具有最小数量的SNP差异或最短SNP距离的隔离物将是链接的，可能代表传输事件或群集[2-6.]．广泛使用5个SNP或更少的链接传输的截止值;然而，已经建议最多三个SNP代表人类传输[2-6.]．沃克等（2012）查看了英国的流行病学相关的分离物的SNP差异，并且没有连锁对超过五个SNP差异，因此提出了五个SNP截止[6.]．

这种方法的缺点是它依赖于流行病学相关的配对。特别是在大多数负担高的环境中，往往没有流行病学的联系，这将使这种做法存在问题。另一种方法是观察不可能的传播对之间的SNP差异。使用这种方法，基于所有不可能的传输对都有两个以上SNP差异的事实，使用0-1的SNP差异来定义聚类[3.]．在已知传播发生时间的估计的情况下，突变率被用来确定SNP截断[7.]．该方法假设随着时间的推移，突变率是恒定的，这并不总是这种情况。每天突变率为0.003 snps，用于确定≤10NP的切断作为识别的变速器[7.]．

整个基因组数据的分析，例如SNP的聚类，给我们深入了解传输动态以及在爆发期间游戏中的内部内部变化玉米菌菌[2那3.那5.那6.]．

整个基因组数据与社会网络分析相结合，使能社会环境的识别是加拿大不列颠哥伦比亚省爆发的驾驶员[2]．通过详细的整个基因组数据分析旧金山的另一个爆发，没有链接无明显流行病学联系的情况，并确定了微观化事件，有助于定义可能的传播链[8.]．WG的分辨率优于分枝杆菌散布的重复单元 - 变量数量串联重复（Miru-VNTR），其通过WG的能力来辨别谱系的谱系玉米菌菌具有相同MIRU-VNTR基因型[2那3.那5.那6.]．WGS还允许推断在使用SNP距离之间使用SNP距离之间的传输方向推断，即使在没有流行病学数据的情况下也是[3.那6.]．这至关重要，因为TB爆发经常发生在流行病学数据难以收集的社区中。WG的卓越分辨率使我们能够区分复发和重新感染[9.]．这对于准确评估治疗和预防规划至关重要。WGS已被用于理解高负荷环境下的传输动力学，证明这种方法确实可能在确定中具有最大的影响玉米菌菌高负荷设置中的传输动态[7.那10.]．

2.2。鉴定混合感染

混合玉米菌菌感染被描述为由一个以上突出的TB疾病玉米菌菌拉紧。传统上，它们是基于MIRU-VNTR结果上的至少两个不同模式来识别的。玉米菌菌使用杂合贱呼叫的下一代WGS分析可以提供更好的混合感染分辨率。然而，研究利用了基于杂合碱基调的混合感染的不同定义。在一个样品中存在超过80和140个异质基因呼叫，用于定义混合感染[7.那9.]．其他研究使用了混合基调用等分类，其中38%的reads支持该变体为混合感染[3.]．混合感染在高负荷环境中更为常见，TB患者报告了10％至20％[11.那12.]．

与新案例相比，在再现病例中报告了更高的混合感染率[12.]．它们也与差的结果有关，特别是在不同的菌株具有不同的耐药模式，并且在艾滋病毒感染引起的潜在免疫抑制的情况下[13.那14.]．混合感染可能对诊断产生影响，这是通过XPERT测定的低灵敏度（80％）对利福平测定对混合感染的影响的影响，而均匀感染的均匀感染相比，93％[11.]．混合感染的鉴定对于评估结核病干预的有效性也是至关重要的。有时可以通过在同一时间的不同图案的分离株存在分离株的分离株耐药模式的变化[15.]．用不同DST型材的菌株的混合感染的情况可能很容易被错误分类为在治疗后抗抗性的抗性时抗性的案例被误分类，错误的干预措施。

2.3。预测耐药性和耐药机制的理解

与其他通常以特定基因为靶点来确定耐药性的分子方法不同，WGS允许对整个基因进行询问玉米菌菌赋予耐药性突变的基因组。在已知与耐药相关的基因外发生的突变可以从Tb全基因组鉴定。因此增加了寻找新型药物阻力突变的可能性。可以从全基因组中鉴定补偿突变，即不直接参与耐药性但是补偿耐药性突变的适应性成本的突变[16.]．尽管含有耐药性突变，但具有这种补偿性突变的菌株将具有高适合度[16.]．通过分析广泛耐药结核病(XDR-TB)暴发的分离株的全基因组突变，我们知道并非所有暴发都是由耐药菌株的无性繁殖引起的，但有些疫情是由获得性耐药性引起的，在许多分离株中，这种耐药性似乎是独立获得的[17.那18.]．

虽然在很大程度上进行了回顾性，但是对于测定耐药性的WG与常规DST表示良好的一致性，尤其是从早期培养完成时的转变时间更短19.那20.]．在一项回顾性分析中，基于WGS构建的耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病个体化药物方案与基于表型DST数据构建的方案密切一致[21.]．重要的是，在WGS的基础上构建的药物制度并未出现任何表型抗性的任何药物，而是WGS预测对乙胺醇等药物的抗性更多[21.]．如果WGs将从治疗方案中列出的药物，如果决定纯粹是关于表型DST的信息，那么WG。通过影响治疗方案的组成，这可能导致更有效的方案，并且还可以减少不必要的药物的毒性。

有很大的证据表明，在适当的方案选择方面，WGS优于XPERT和线路探针测定[21.]．具有WGS低抗性的分离株对表型DST敏感，可能是因为DST设定的临界浓度过高[21.]．在表型易感菌株中发现的新突变或定义不明确的突变很难解释[21.]．这突出了在遗传决定因素方面的知识差距玉米菌菌仍需要解决的耐药性。对Hain线探针测定的WGS比较物种鉴定和抗性测定的一线探针测定和第一线药物的抗性测定表现出WG的可比处理时间[22.]．当WGS新引入实验室工作流程时，结果的周转时间与表型DST相当;然而，在成功纳入常规实验室工作流程后，WGS结果比表型DST早9天公布[22.]．对于耐药性确定数据不足的相对高的分离株率突出了进一步改善WG的需要减少这些速率。WGS结果的周转时间可能会进一步降低，如果努力将WG直接施加到诸如痰液的临床样品，而不需要培养的情况是成功的。

2.4。全基因组测序用于连续耐药监测

为了衡量控制策略的有效性玉米菌菌全球耐药性，对耐药性发生的准确数据至关重要。谁为所有TB结核病患者建议常规DST，以不断监测耐药性。然而，大多数高负荷国家仍然依赖于每五年进行的流行病学调查。这是因为所有TB患者常规DST的能力缺乏;在大多数情况下，诸如XPERT MTB / RIF的分子方法是涉嫌MDR-TB例的常规DST的唯一可用方法。有些国家的能力只能在国内以外的实验室发出二线DST的样本。WGS分析所有TB患者的常规耐药监测是一个有吸引力的大道。然而，这将在鉴于大多数高负荷国家难以获得疑似耐药案件的情况下，这将具有禁止的成本。

在短期内，为使用WGS的所有结核病患者进行常规DST投资似乎并不划算。然而，需要对高负担环境下常规WGS的影响和成本效益进行研究，以确定在这种环境下实施WGS的可行性。WGS分析获得了一线和二线药物的药敏结果;这些数据也可以成为了解各自国家结核病流行病学的宝贵资源。WGS已成功用于补充乌干达的一项耐药性调查，其中使用WGS分析了对异烟肼和利福平具有表型耐药性的一小部分分离株，试图了解耐药性的程度[23.]．

3.常规临床用途实施全基因组测序的挑战

3.1。用于WG和质量控制的DNA提取

传统上用于提取DNA的方法玉米菌菌原则上可用于提取WGS的DNA。然后需要检测DNA的质量和浓度，通常使用定量PCR、分光光度计(如量子位机)或琼脂糖凝胶电泳来确定提取的DNA的质量是否满足特定仪器的最低标准。然而，在选择DNA提取方法之前，重要的是要考虑所使用的文库制备方法或试剂盒，因为试剂盒通常规定了文库制备所需的最小输入DNA。表格1总结了一些可用的图书馆准备套件，与它们兼容的NGS平台以及图书馆准备所需的最小输入DNA。

3.2。对全基因组测序的培养需求

玉米菌菌传统上，WGS依赖于培养文化中的生物体。培养为测序成功提供了两个重要的目的。首先，它确保了选择性的增长玉米菌菌其次，增长允许提取足够量的DNA进行测序。但是，这会影响WG的周转时间。研究还表明，培养方法可以丰富某些菌株玉米菌菌因此影响种群结构或克隆复杂性玉米菌菌[34那35]．因此，不同种类的培养基和生长条件可能会影响检测混合感染的能力。这很重要，因为在病人管理方面，我们可能会忽略耐药性，在分子流行病学方面，我们可能会忽略传播事件。

最近，研究人员已经开始探索绕过培养细菌的长途过程作为WGS的起点。下一代测序玉米菌菌从直接从痰中提取的DNA没有培养，靶向扩增或捕获主要是主要的，因为痰是人细胞，分枝杆菌细胞和口腔/鼻咽细菌细胞的复杂混合物。直接从没有靶向扩增或捕获的痰中提取的DNA不仅含有分枝杆菌DNA，还含有口腔/鼻咽细菌DNA和大量的人/宿主DNA，这取决于萃取前痰液的去污的成功。由于NGS中使用的测序引物的非特异性，只有较少的读数将来自玉米菌菌在这种情况下玉米菌菌与宿主或口服细菌DNA相比，DNA低，痰液中的情况通常是痰液。因此，这些方法已经成功排序玉米菌菌尽管具有非常低的覆盖率和深度限制了下游分析数据的效用（表2）[26.]．

为了实现高覆盖和深度的成功天然气勘探，富集或捕获方法能够选择性地捕获或富集玉米菌菌DNA已经被开发出来，以获得适合测序的DNA浓度和纯度水平。目标浓缩系统（Agilent Technologies，Inc.Santa Clara，USA）是一种这样的系统（表2）。该系统允许高质量玉米菌菌不需要培养的WGS [24.那27.]．富集系统可在确保及时完成高质量的WGS以告知患者管理方案方面发挥作用。然而，这些系统非常昂贵，并增加了相对昂贵的WGS过程。这些浓缩系统所涉及的实验室工作流程也非常复杂，因此，在受结核病打击最严重的地区，大多数规划可能仍然无法实现。

一种比较简单、成本较低的方法是，先用盐水洗掉人体细胞或DNA，然后再继续玉米菌菌使用乙醇沉淀的DNA提取（表2）[25.]．原则上，这类似于也已成功使用的差分裂解协议。差分裂解方案涉及裂解人体细胞，然后使用DNase治疗以除去人/宿主DNA，然后进行玉米菌菌使用商品化工具提取DNA [26.]．这些更简单的方法勾选理想的提取方法的所有盒子;工作流程简单，并且不适合测序的成本，并且使用人体细胞的耗尽至少，在临床相关的时间框架中产生高质量序列。然而，差分裂解方案已经取得了较小，因为在DNA提取期间尝试耗尽人细胞或DNA时，读取对人类基因组的读取映射的比例在某些情况下高达99％。26.]．

尽管在开发所有这些方法方面取得了直接从痰液测序的进展，但我们仍然只能通过降低毛毛载荷减少和覆盖率来获得具有高毛状负荷的样品中的良好结果[24.]．然而，能够从基于快速的WGS的DST受益的人是最高风险的发病率和死亡率的最高风险，例如艾滋病毒阳性人，他们更有可能具有育贫病，使得目前的方法不适合这种情况。因此，需要更多的工作来优化直接从痰液中DNA提取和WGS的协议，从而可以广泛应用该技术在最需要的地方。

３．３．结核分枝杆菌耐药基因基础的不完整理解

使用测序玉米菌菌目前我们对耐药性相关突变特征的认识和理解限制了耐药性的测定。目前的这些特征抗性突变文库可能不包括所有可能与抗性表型相关的突变玉米菌菌。对某些一线药物如利福平药物和异烟肼，但对于新药仍然不完全不完全，数据链接基因型 - 表型抗性相对完整3.）。在大量分析中，从六大洲的超过10,000个分离物，通过敏感性的敏感性从91.3％〜97.5％预测到第一线药物，异烟肼，乙胺醇和吡嗪酰胺的表型抗性，并且预测了易感性的特异性93.6％至99.0％[36]．在对所有四种一线药物的明确表型易感性的分离物的具体分析中，WG在97.9％中正确预测了荡丝。[36]．然而，应该注意的是，这些预测精度的估计基于具有完整表型和基因型谱的分离物。

具有抗性赋予突变的敏感表型至少基于所确定的突变的预测性能，以真正的抗性分离物[36]．虽然发现抗性赋予抗性突变是本研究抗性表型的良好预测因子（一线药物超过90％的敏感性），但突变与少数案件中的意外表型相关联，突出了仍需要的基因卵彼此差异解决[36]．

分离株的表型抗性和遗传易感差异可能是因为我们正在寻找已经与抗性相关的基因突变，而这些表型可能是由已知与抗性相关的位点以外的基因变化所解释的。WGS可用于增加知识体系，并描述一些尚未确定和特征不佳的耐药基因决定因素。为了实现这一目标，通过分析WGS数据发现的新突变必须用表型和临床结果数据进行验证。

努力有助于关闭这些差距，对6464个多且广泛的耐药性的基因组进行了很多分析玉米菌菌来自30多个国家的分离株发现了一种新的抵抗相关突变，包括小型indelspncA和大删除凯格[37]。尽管需要进一步的功能表征来充分了解这些突变在耐药性，治疗失败，并且最终对治疗结果的影响中的作用，但只有通过这种努力，我们可以一天理解遗传决定因素玉米菌菌挖掘机足以让WGS在结核病患者管理中发挥重要作用。迫切需要研究突变，已知和新发现的突变的相关性，以确定不同突变对多药治疗方案背景中治疗结果的影响。

3．4．处理全基因组测序大量数据的挑战

WGS产生大量数据，因此需要昂贵的基础设施进行存储和分析。WGS数据的分析还需要通常在临床实验室中不可用的专业生物信息管理员。然而，易于使用自动分析管道和数据库的发展将及时允许具有最小生物信息化技能的人来分析整个基因组序列数据。在这方面正在进行的进展的良好示例是免费开放访问在线工具，用于快速检测玉米菌菌从原始全基因组序列数据，如TB Profiler, Mykrobe Predictor TB, CASTB, KvarQ和PhyResSE，耐药性和谱系特异性突变[38-40]．该工具可以易于理解的临床医生可以用于患者管理的格式[38-40]．虽然仍然需要进一步测试和验证临床用途的原型，但它们现在可以用于研究目的。在分类WGS数据在临床实验室中创建的分析瓶颈，它是朝着正确方向方向的一步。

4。结论

的未来玉米菌菌WGS能够直接将方法施加到痰，因为这是最常见的临床材料。直接从痰样品中测序，无需培养将提供更准确的混合感染群体结构的图像。由于有利的培养条件，可以捕获混合感染中不同菌株的相对表示在没有对其中的一些菌株的情况下捕获。这将更好地通知治疗和预防干预措施。玉米菌菌来自痰的WG是可能的，并将是在不久的将来进入的方式。这将显着降低电阻确定的周转时间，并提供有关传输动态的及时信息。

随着技术的快速进步，WGS的成本继续下降。然而，对于负担沉重的低收入人群来说，这项技术仍然昂贵和难以获得，而这些人将从这项技术中受益最大。我们期待在不久的将来玉米菌菌WGS将适用于低收入的高负荷设置，以了解定期耐药监测，以了解抵抗机制，可通知设计更便宜的分子诊断。但是，如果玉米菌菌WGS是真正对高负荷设置的疫情产生影响，需要发生调整常规实验室算法。这种适应需要在实验室基础设施和重点竞争力之后升级，例如生物信息学，数据库和软件开发，以提供支持并允许通过WGS生成的大量数据处理和解释。综上所述，玉米菌菌WGS，特别是直接来自痰，将在抗击结核病的斗争中发挥至关重要的作用，因为这显着缩短了结果的周转时间，使得能够提供可能患毒性毒性的TB患者的有效治疗方案。

利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

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