埃塞俄比亚德西地区肺结核患者结核患病率、药敏试验和结核分枝杆菌分离株基因分型研究

抽象的

由于其成本进行初始看似很高，及时诊断和结核病（TB）的有效的治疗方法通常是由缺乏或资源短缺在很多结核高负担国家的阻碍。然而，有效的治疗方法的好处是可以最终胜过那些经验性治疗。这里，横截面研究是对样本涂片阳性新和复治结核病患者中进行。收集关于社会人口和艾滋病病毒感染状况的数据。样品用于鉴定，常规药物敏感性测试，以及通过缺失打字和spoligotyping分子分型培养。结果表明，青年是不成比例的影响。新发病例正在接受治疗下，只能进行一般的治疗指南。Monoresistance或多重耐药性在新的患者16.5％发现。Spoligotyping表明，有44种型态与家庭H3和T1（谱系4）和CAS-德里（谱系3）占主导地位。从血统7某些罕见的模式也被发现。 Spoligotype pattern, HIV positivity, and previous treatment were not associated with drug resistance. That the vast majority of the patients were new cases and young and the large number of these patients with mono- or multiple drug resistance indicate that most TB cases are due to recent transmissions and that urgent actions are needed to curb the transmissions.

1.介绍

最新的世界卫生组织（世卫组织）报告显示，在人类免疫缺陷病毒之后，患有90万新结核病（TB）病例和150万结核病（TB）死亡，作为全球传染病死亡的第二次导致死亡（艾滋病病毒） [1］.与HIV燃料的辛凝集全球结核病危机，并且通过存在多药（MDR）Tb和广泛的耐药性（XDR）Tb（MDR TB加上含氟喹啉的额外耐药性和含氟喹啉的额外耐药性以及含氟喹啉的额外耐药性以及额外的耐氟喹及其额外耐药性）进一步复杂和妨碍可注射的二线药物）。全球近五百万例MDR结核病出现，其中〜50,000也是XDR TB [2]。世卫组织报告指出，“实现耐多药结核病诊断和治疗目标的进展远远偏离轨道”，在大多数耐多药结核病负担沉重的国家，发现的耐多药结核病病例不到25%[3.］.2012年，估计结核病病例和儿童结核病死亡人数分别占全球总数的6%和8% [3.］.

据报告，在全球范围内，药物敏感结核病正在减少，但耐多药结核病和广泛耐药结核病正在上升，这主要是由于每年有过多的耐多药结核病病例未得到诊断、治疗或不适当治疗[4- - - - - -6］.因此，世卫组织在2012年宣布耐多药结核病为公共卫生危机。这表明在全球范围内选择了更严重的结核病形式，随后的传播产生了初级多药耐多药。耐多药和广泛耐药结核病的增加以及儿童结核病(即最近的传播)的增加是结核控制规划存在分歧的有力指标。

药物方案不适当，患者违约，先前的抗结核治疗，延迟诊断和启动有效治疗，以及MDR结核病菌株的原发性感染是导致MDR / XDR结核病的危险因素7］.1994年至2009年间MDR结核病案件的全球负担在新案件中的0〜28％，在此前处理的案件中的0〜61％（61％）[8，9].自从结核病爆发以来芽孢杆菌没有被地理边界界定，人们已经变得越来越多的移动，TB菌株，包括那些患有耐药性的人，在全球范围内传播。在过去几十年中，在引入几种基因分型方法后，全球TB的流行病学研究已经促进了几种基因分型方法，其中包括区分复发性Tb是由于再激活，外源性再感染或混合感染，临床分离物分类为系统发育谱系和菌株水平，测定人口结构，药物和疫苗的开发，以及用于药物敏感性检测（DST）和流行病学数据，MDR和XDR菌株的传播[10.，11.］.

根据世卫组织报告，埃塞俄比亚估计发病率为223，患病率为212，TB死亡32人每10万人[1］.埃塞俄比亚在新的和后悔案件中有一个最低估计的MDR结核病率（1.6％和12％，resp。）在27个高负荷国家之间。本报告还表明，只有1％的新的细菌学证实的结核病病例和只有4.4％的后退病例有DST覆盖率。

TB的患病率以及从埃塞俄比亚其他地区报告的耐药性和治疗成功水平大大变化，如最近的一些报告所示[12.- - - - - -15.］.本研究的目标是(我)研究结核病的流行程度在研究区(Dessie、埃塞俄比亚),(2)描述物种分枝杆菌引起肺结核的新的和再处理的情况下,(iii)来确定分枝杆菌的药敏模式分离,(iv)型分枝杆菌分离株的分子,(v)评估治疗效果。这些目标是由于缺乏有关研究地区结核病情况的信息。

2。材料和方法

2．1.研究地点和研究时间

这项研究是在Dessie，埃塞俄比亚东北部进行的，在上一个政府和两家私人医院和三个保健中心从肺TB（PTB）患者获得的样品。当他们在自己的时间寻求保健，获得这些患者。有抗酸杆菌显微镜检查和影像学检查无培养和药敏试验能力，但设施可用。痰标本从患者PTB收集从2012年10月1日至2013年9月30日。

2.2。学习规划

横断面研究年龄≥10岁的涂片阳性新诊断和再治疗PTB患者。以社会人口统计数据为重点的调查使用预先设计好的问卷。

使用通用痰液收集管收集早晨痰样品，并立即储存在-20°C之后的WHO指南[16.]直到他们在Armauer Hansen Research Institute（Ahri）的实验室运送到实验室。然后，首先在Petroff的方法后首先净化并集中痰样品[17.］.每个标本接种到两个Lowenstein-Jensen斜体中，一个含有0.6%甘油，另一个含有0.6%丙酮酸钠。

２.３.药敏测试

DST是对异烟肼（INH），利福平（RMP），乙胺醇（EMB）和链霉素（SIGMA，St.LOUIS，USA）进行的乙胺蛋白（RMP）和链霉素（SIGMA，STR）（SIGMA，STR），[18.］.简而言之，二十四块孔板用于DST。每个孔含有2.5ml完整培养基，其补充有10％OADC和0.5％甘油。以下列浓度加入药物：INH 0.064,0.125,0.2和1.0 μ.g / mL;RMP 1.0μ.g / mL;教育统筹局成绩分别为4.0、5.0及8.0μ.g / mL;和str在2.0 μ.g / ml。通过从用无菌环（直径0.7mm和3mm）（Becton Dickinson，法国）的初级培养物中取代5-10mg的代表性样品（直径0.7mm）（法国Becton dickinson）来制备用于接种到孔中的分枝杆菌悬浮液。然后，将其置于含有玻璃珠和蒸馏水的玻璃珠粒的球形，液滴中加入慢慢摇动，以调节细菌悬浮液的浊度，以将麦克法兰标准的浊度1.两种无毒井。将1：100稀释的细菌悬浮液和另一种含有未稀释的细菌悬浮液的稀释作为对照。将接种的板在37℃培养箱内温育。在21-28天读出平板。MIC断点为0.2 μ.g / mL, 1μ.g / ml，5 μ.g / ml和2 μ.g/mL分别检测INH、RMP、EMB和STR。

2.4。DNA提取和分子分型

为了获得键入的DNA，重新悬浮了来自LJ倾斜的两种菌落环 μ.蒸馏水，80°C热灭1小时。除碎片外的流体部分被转移到一个新的管中。

区分结核分枝杆菌从其他种类的分枝杆菌中，进行PCR靶向差异9区域(RD9) [19.］.Spoligotyping [20.]，以确定43个间隔器是否存在。SPOTCLUST [21.用来生成八进制编码。SITVITWEB [10.]用于确定分离株的sit (spoligotype international types)和家系。

通过SPSS软件版本20（IBM，USA）分析数据。评估药物抵抗力和Spolocotype之间的关联，艾滋病毒状态和治疗病史的存在或不存在。一种值小于0.05被认为是统计学意义的。

2.5。质量控制

结核分枝杆菌H37RV（ATCC 27294）和牛分枝杆菌（AF 61/2122/97）包含在DST，RD9缺失打字和Spoligotyping中的质量控制。实验室程序在标准运营程序后进行。

结果

3.1。社会血统和临床数据

共有144例≥10岁的144名患者，包括128（88.9％）新病例和16例（11.1％）的再处理案件，在本研究中注册。在寻求医疗保健之前的平均住宿时间几周（范围2-48周）。六十四（44.4％）是女性，80名（55.6％）是男性（见表S1，在线提供的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/215015）.患者的中位年龄为27.5岁（范围10-78岁）。所有患者的二十五次（17.4％）是艾滋病毒阳性的（由20例新病例（7名男性和13名女性）和5个后退病例（3个男性和2个女性））（表S1，补充材料）。其中，17/25（68％）是城市居民，7/17（41.2％）是男性，10/17（58.8％）是女性。其余的（8/25,32％）是农村居民，分别为3/8（37.5％）和5/8（62.5％）分别是男性和女性。对于样品尺寸小的警告，我们推导出来，在城市和农村居民女性（15/64,23.4％）中，艾滋病毒阳性比在男性（10/80,12.5％）中更高。

按年龄组分层时，惊人的>67.4%（97/144）的年龄在10至30岁之间，其中31/97（32%）和66/97（68%）分别位于10至20岁和21至30岁年龄组。这两个年龄组各有4名患者为再治疗病例，而89/97（91.7%）为新病例。97名患者中53名（54.6%）为男性，44名（45.4%）为女性。总的来说，结核病患者分为50人 : 50在城市和农村居住之间。然而，在10-20岁年龄组和≥41年来，农村PTB患者数量比城市PTB患者数量多2 : 1（未显示数据）。

在144名患者中，32岁（22.2％）为31-40岁（具有24例新案件和8个后悔案件）。其中，18名是男性（12个农村和6个城市居民），14名是女性（7个农村和7个城镇居民）。其余（15,1.04％）为41-78岁，所有人都是新案例，其中11名（73％）是农村居民。

在144例患者样本中，26例(25例新病例和1例再治疗病例)未能在培养中生长，118例(103例新病例和15例再治疗病例)进行DST和spoligotyping。

3.2。耐药性

在103例新发病例中，86例对四种药物敏感，17例对一种或多种药物有耐药性。15例再治疗病例中，11例对四种药物均敏感，4例对一种或多种药物耐药，其中2例耐多药。两例均有21例患者表现出不同的耐药模式1）.在艾滋病毒阳性和HIV阴性TB患者中观察到RMP单抗体。

在年龄组≤30年内，4名患者具有INH单态TB，每次具有STR或BEM单态TB，并且3对INH和STR的TB耐药，所有患者（表S2，补充材料）。有8名患者是该年龄组的撤退病例;然而，它们没有表现出对任何药物的抵抗力（表S3，补充材料）。

在31〜40岁的24岁的新病例中，1个单独抗体，单独耐含有STR，4次耐受INH和STR（表S2，补充材料），而DST不能进行3其他新案例因文化消极而。另外15岁的新病例为31-40岁，对四种测试药物敏感。在8岁的病例中，3年龄组，3对所有四种药物完全敏感，1个对INH抗性，1对INH和IMB，2是MDR病例，而1是培养阴性，而1是培养物，而表S3，补充材料）。在15名患者（含有阳性培养物）的120岁以下（所有新病例中）（表S2，补充材料）中没有观察到耐药性。

培养物为25例HIV阳性患者的8例（7个新病例和1个病态）阴性。在其余17名艾滋病毒阳性患者中，仅在2中观察到耐药性，表明HIV阳性和耐药性之间没有关联。相反，较大的艾滋病毒阴性亚群由大多数（19/21）患者抵抗一种或多种药物（包括2个后退MDR结核病病例）。同样，在任何对一线药物和先前治疗的抗性之间没有观察到任何关联。最多的阻力是针对境内的，无论是单独还是组合（表1）;然而，没有任何抗性与INH相关的关联，性别，艾滋病毒状态，TB案例或年龄（表2）.虽然样品大小很小，但MDR结核病似乎与以前的治疗史有关（）和谱系3结核分枝杆菌（表S3，补充材料，和表3.）.在所有对一种或多种药物耐药的患者中(总共21例)，17例(81%)为新发病例。21例(81%)对一种或多种药物耐药的病例中有17例是新病例，但没有一例表现出耐多药结核病。

3.3。分子分型

RD9删除键入表明所有118个隔离物都是结核分枝杆菌(数据没有显示)。

患者分离物与八进制名称，Spoligotype国际类型（坐在），谱系和家庭的Spoligotype模式如表所示4．共有44种不同的模式。家庭H3（18.2％），T1（15.9％）和Cas-Delhi（13.6％）代表本研究中聚类分离物的大多数。坐25（谱系3），坐53（谱系4）分别占最大的分离株，分别为17.8％和16.95％。所获得的图案显示，谱系4是30个不同图案中的78个分离物中最多的显性，其次是具有33个不同图案的33个分离物，其中具有3个不同的图案7分离物。坐下53（带有20个聚类分离物），坐25（带21个聚类分离物），分别坐343（具有5个聚类分离物），分别是衬里4,3和7中最常见的。

有14个分离物属于T超家族（7T1,4t3,2t和1t3-eth）。Cas1-Delhi和Cas-kili分别由6分离物和1个分离物代表。H3思工有6个分离物。Lam9和Lam10分别表示3分离物和1分离物，而Manu2和X1蛹分别由1分离物。在这项工作中发现了在SitVitWeb中未找到的十个未知或孤儿模式。除了一个外，所有人都由1个分离物代表，可以根据SITVIT指定称为孤儿[10.］.在本研究中还报告了在数据库中很少表示的谱系7内的一些模式。

4。讨论

本研究旨在评估埃塞俄比亚德西地区结核分枝杆菌分离株的分子多样性和药敏模式以及结核患病率。将社会人口学特征、艾滋病毒状况和以前的结核病治疗与菌株类型和药物敏感性模式进行比较。与本研究相关的几个突出的临床相关性问题，要么证实了以前在埃塞俄比亚的发现，要么指出了需要进一步研究的主要知识差距。

新发病例的百分比高（一百零三分之十七（16.5％））窝藏抵抗一个或多个测试的药物（其中大部分是唯一有点短的是MDR）的。由于这些案件一般不嫌疑人MDR或任何抵抗，因为他们是新发病例[1，22.]，他们仍未被诊断出来，并在没有进行DST的情况下(假设DST的能力已经具备)使用标准一线药物进行经验治疗。因此，由于对一种或多种药物未检测到耐药性，治疗效果注定是无效的，其他研究也显示了这一点(如[23.，24.])。对单一或混合感染的未被发现的耐药患者进行这种经验性治疗可能导致更严重的耐药形式，包括耐多药结核病[25.，26.］.研究表明，随着时间的推移和治疗期间，耐多药结核病可演变为广泛耐药结核病(并从广泛耐药发展为泛耐药)[27.- - - - - -30.］.此外，对新人的这种初级抵抗力具有高风险。它可能在其他25个新案例样本中也可能发现更多的阻力，它们不是文化负面。

此外，大多数活跃的肺结核病例被发现是儿童和年轻人。这是未来结核病控制的一个严重问题。结核病影响到所有年龄段的人是一个令人担忧的问题，但当绝大多数患者是新病例、儿童和青年时（特别是在一个人口年龄结构呈金字塔形的国家），情况更是如此。儿童比成人更容易接触、感染和发展为疾病。除非儿童结核病得到控制，否则所有形式结核病控制的成功都将受到威胁，因为儿童结核病将成为未来进一步放大的蓄水池[31.］.最近从西北埃塞俄比亚的一项研究表明，82％的PTB患者都是新案例，40岁以下，其中4.2％的案件是MDR [32.］.一项全国性研究最近的一份报告也表明，在大多数新诊断病例中，55%的结核病病例发生在年轻年龄组(15-34岁)[33.］.这些发现表明TB在一般人群中的整体流行率不成比例地影响了由于持续或最近TB的透射而不是潜在感染的再活化。最近的传输有助于低发病率和高发病国家的大多数TB病例[34.，35.在发病率高的国家，大多数此类传播被认为发生在家庭以外[35.，36.］.因此，一些传播或流行病学联系可能很难追踪。

此外，复治例率高的那些药物易感性以及新病例是药物抗性（如上所述）的结果是严重的问题，关于治疗和TB传输控制策略分别功效，提高的问题。在11复治案件均对所有4种药物（其中HIV阳性的4，其中大部分年龄小的），无论是混合感染，在第一事件也不克隆群体的存在敏感和耐药株（即是总是容易受到药物）用作用于第二发作的发生的解释。亚治疗药物水平是已知的导致治疗失败，即使坚持治疗，但随之而来的耐药性，通常如下[37.- - - - - -39.在这些患者中没有看到，至少在这项研究之前。用药物易感菌株的Reinfection似乎是最可能的解释。由于我们没有来自这些患者的串行样本，因此我们无法从两集中进行分离株，尽管这种分析可能并不总是描射从复发中的重生[40］.在埃塞俄比亚之前报道了退休剂TB患者的药物易感结核病[13.，41.，42.］.例如，其中一个研究[13.]报道的培养阳性复治箱子27％是易受所有测试的4的一线药物。然而，这些研究显然认为TB是不重要的这种形式，给没有强调它除了传递提。因此需要对以前治疗过的患者的原因（个），药物敏感结核病进一步研究作为这方面的研究一直没有在埃塞俄比亚上下文之前解决。这项研究 [13.]还报告了一家专业结核病推荐医院的恢复案件中令人惊讶的高水平（46％）MDR结核病，这与此前报告的巨大增加[1］.

在大多数资源贫困国家，新的案例MDR结核病患者才能在第一线疗法失败后鉴定，通过该患者可以进一步传播疾病[8，43.］.这次要求一个范式转变，并指出重新评估的必要性，以便与药物易感情况和基于菌株基因型的单独量身定制的药物方案进行缔结新案例的必要性。初级抵抗的概念并不是新的，但显然是通过这种信念的掩盖。延迟启动有效治疗，治疗不适当的治疗，并且没有传动控制是初级抵抗的解释的原因[44.，45.］.假设每个传染性案例都可以将其传输到10-15人/年[46.，这个问题的严重性不可低估。

个体化药物方案治疗耐多药和广泛耐药结核病例的重要性突出表现在菌株基因型的多样性和/或遵循基于一般治疗指南的治疗后的治疗失败[28.，47.，48.］.此外，由于畸形突变，交叉抗性的现象（例如，对一线药物INH和第一线药物INH和二线药物甲胺酰胺）inha.启动子）[49.，50.]赋予抗生素无效的（乙醇是埃塞俄比亚MDR和XDR TB患者的药物方案的组成部分[1，22.])。这使得鉴定抗性的特定分子机制重要。例如，对于卡那霉素和str的氨基糖苷来说，可以说是相同的51.] Amikacin，卡那霉素和辣椒霉素[52.- - - - - -54.］.在本研究中，11个分离物是具有抗性的（包括3个单一的单静脉病例，1 MDR案例和7个INH-STR双阻情况），其中（10/11）在新病例中。另一项研究[41.[还报道了该研究现场是一部分的区域的高度抗性。对于这种高水平的STR抵抗力的原因，需要进一步的信息。

所有医院和社区其他热点更好的感染控制的法规和措施（通过适当的通风，避免会占设置，提高公共结核意识等）[55.]。参与结核病管理和治疗的所有公共和私营部门必须协同工作，精简活动[8]。所有情况下都迫切需要快速DST能力。然而，在这些能力建立之前，如果继续使用标准药物方案，就必须了解社区中传播的耐药谱。CD4的定期随访⁺建议对具有单药或多药耐药性的HIV-TB患者进行检测。强烈建议收集和储存每位患者的分离物，并保存完整的治疗记录，以用于回顾性研究和进一步分析，并监测治疗进展。这些措施应同时应用；一项或多项单靠急诊室，甚至除了一个之外，其他所有的都是不够的。这些建议已经转交给了临床医生和对研究区域有管辖权的当局。

本研究有一定的局限性。其中包括无法获得所有患者的治疗记录、仅使用一种DST方法、无法检测更多一线和二线药物的耐药性以及有限的基因分型数据。最后，研究期限限制在一年。

总之，这项研究提供了重要的发现和建议，可纳入研究地区和其他类似情况地区结核病控制的现行实践。脆弱儿童和青年中的高结核病发病率需要立即关注，采取适当的保护措施，同时采取进一步的预防措施加强病例检测。发现80%以上对一种或多种药物耐药的患者是新病例，绝大多数也是新病例≤30岁是近期原发性耐药感染传播的有力指标。现有的耐药报告通常针对MDR和XDR病例，这些病例通常集中在再治疗病例。这项研究报告的耐药率非常高（16.5%）新病例中涉及一线药物的单药和多药耐药性。未检测到的耐药性代表着助长更多耐药性的隐患。即使有了准确的诊断和有效的治疗，除非积极处理正在进行的传播，否则前者的收益可能很难实现。

伦理批准

该研究经病理学，AHRI的阿克利卢引理研究所和研究地点的卫生局伦理审查委员会。

同意

知情同意是从患者或其监护人获得的。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢医院，保健中心和TB患者的援助和参与本研究。来自AHRI核心预算的资金支持这项工作。亚的斯亚贝巴大学提供额外的资金。

补充材料

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