在R18与聚精氨酸肽是有效得多的TAT-NR2B9c的（NA-1）肽当给予永久性大脑中动脉闭塞的大鼠60分钟后

摘要

We examined the dose responsiveness of polyarginine R18 (100, 300, and 1000 nmol/kg) when administered 60 minutes after permanent middle cerebral artery occlusion (MCAO). The TAT-NR2B9c peptide, which is known to be neuroprotective in rodent and nonhuman primate stroke models, served as a positive control. At 24 hours after MCAO, there was reduced total infarct volume in R18 treated animals at all doses, but this reduction only reached statistical significance at doses of 100 and 1000 nmol/kg. The TAT-NR2B9c peptide reduced infarct volume at doses of 300 and 1000 nmol/kg, but not to a statistically significant extent, while the 100 nmol/kg dose was ineffective. The reduction in infarct volume with R18 and TAT-NR2B9c peptide treatments was mirrored by improvements in one or more functional outcomes (namely, neurological score, adhesive tape removal, and rota-rod), but not to a statistically significant extent. These findings further confirm the neuroprotective properties of polyarginine peptides and for R18 extend its therapeutic time window and dose range, as well as demonstrating its greater efficacy compared to TAT-NR2B9c in a severe stroke model. The superior neuroprotective efficacy of R18 over TAT-NR2B9c highlights the potential of this polyarginine peptide as a lead candidate for studies in human stroke.

1.简介

虽然发达国家的中风发病率在下降，但它仍然是世界范围内死亡和残疾的主要原因，由于人口老龄化以及糖尿病、高血压和肥胖症的持续流行，全球疾病负担不断增加[1]。就急性缺血性脑卒中的治疗而言，单独使用tPA(组织纤溶酶原激活物)或近期联合血栓切除术进行再灌注治疗是目前最有效的治疗干预[2-6]。然而，尽管TPA /血栓治疗的成功，接收这种治疗中风患者的数量相对较少。This is due to a combination of factors including the narrow therapeutic time window for tPA/thrombectomy (3–4.5 h after stroke), delays in patients obtaining medical care, the requirement for a brain scan to exclude haemorragic stroke, and the need for highly trained personnel and specialised equipment to perform the intervention. Given these limitations, the search continues for a neuroprotective agent that can be safely administered early after stroke onset to limit the extent of brain injury after stroke and that can be used when reperfusion interventions cannot be implemented. Additionally, any neuroprotective treatment that improves the efficacy, safety, and therapeutic window for tPA/thrombectomy would be of great clinical significance.

在神经保护剂方面，我们的实验室最近证明了聚精氨酸和富含精氨酸的肽具有强大的神经保护特性体外损伤模型模拟中风的作用[7-9]。此外，我们还扩展了这些体外通过证明该聚精氨酸肽R9，R12，和R18显著减少在永久大脑中动脉闭塞（MCAO）中风模型梗塞体积发现[8，10]。基于这些体外和在活的有机体内结果，我们最近提出[8，9]为富含精氨酸的肽，包括“神经保护肽”稠合到富含精氨酸的细胞穿透肽（例如，TAT-NR2B9c的[11]和TAT-JNKI-1 [12]）代表一类新针对精氨酸残基是用于神经保护的关键神经保护剂。

在本研究中，我们通过检测R18多精氨酸肽的剂量响应性，并将永久性MCAO后的治疗时间从30分钟延长至60分钟，进一步评估其疗效。与此同时，研究还比较了R18和TAT融合NR2B9c肽(TAT-NR2B9c)的疗效。TAT-NR2B9c在多种啮齿类动物和非人灵长类动物脑卒中模型中已被证明具有神经保护作用，并可减少人类破裂动脉瘤血管内修复后的缺血性脑损伤[11，13-15]。

2。材料和方法

2.1。肽使用的研究

在R18（H-RRRRRRRRRRRRRRRRRR-OH）和TAT-NR2B9c的（H-YRKKRRQRRR-KLSSIESDV-OH，也被称为NA-1）在本研究中使用的肽由Mimotopes（澳大利亚，墨尔本）合成。将肽经HPLC纯化，以98％的纯度，并受到肽水解和氨基酸的液相色谱分析，以获得肽含量（Mimotopes）的的精确测量。在0.9％的氯化钠制备用于注射（辉瑞，珀斯，澳大利亚）的肽中，等分到650 μL体积于3ml注射器中，保存于- 20℃，直至使用。

2.2。手术过程永久大脑中动脉闭塞

按照西澳大利亚大学动物伦理委员会进行永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）以及行为和组织学评估的手术过程和下列准则由概述澳大利亚规范动物科学为目的的管理和使用。

在我们的实验室中进行的长丝永久性MCAO中风模型前面已经描述10，16]。Briefly, male Sprague-Dawley rats weighing 275–340 g that had been fasted overnight underwent facemask anesthesia with 4% of isoflurane (mix 30% oxygen/70% nitrous oxide) and maintenance with 2% isoflurane. The tail artery was cannulated to allow blood pressure monitoring and for measurement of arterial blood gases (pO₂,pCO₂)、pH和葡萄糖。MCAO程序被认为是成功的，如果有>减少25%的脑血流基线后，插入的灯丝，通过激光多普勒测量。在手术过程中，使用直肠探头(美国克利夫顿的Physitemp仪器)密切监测体温，并保持在37-37.8℃，根据需要使用风扇加热或冷却。

在MCAO大鼠60分钟后，通过右颈内静脉使用注射泵(0.9%氯化钠，600μ或三种不同剂量的肽(R18或TAT-NR2B9c: 100, 300，或1000 nmol/kg, 600μL / 6分钟)。所有的治疗都是随机的，所有的程序都是在对治疗不知情的情况下进行的。

50只雄性SD大鼠接受手术永久性MCAO。八只动物被排除在研究：五只动物被排除由于减少不足脑血流量以下MCAO，一个被排除由于麻醉诱导过程中死亡，而被排除两只动物，因为没有明显的梗塞病灶MCAO后24小时检测(one saline and one R18 100 nmol/kg treated animal). A further six animals died several hours before the 24-hour post-MCAO study end-point but were still included in the final infarct volume analysis. These animals comprised two R18 treated (one 100 nmol/kg and one 1000 nmol/kg) and four TAT-NR2B9c treated (two 100 nmol/kg, one 300 nmol/kg, and one 1000 nmol/kg) animals. While the exact cause of the deaths could not be determined, it is possible that it reflects the severity of the stroke in this model, which is known to result in up to 90% of the affected hemisphere being infarcted by the stroke. For infarct volume analysis each treatment group consisted of six animals. Due to animal deaths before the 24-hour study end-point, four to six animals per group were available for behavioural testing.

2.3。手术后的监测

动物的体温用直肠探头每30-60分钟测量为至少2小时手术后和37.0和37.8℃之间维持。为了避免低温，大鼠笼子的术后监测期间放置在加热垫和收容在保持在26-28℃的保持室。如果需要，附加的加热或冷却，通过施加风扇加热或冷喷水进行的。

2.4。梗死体积的评估

梗塞体积如前所述24小时MCAO后评估[17]。Briefly 2 mm cerebral coronal brain slices were stained in 3% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Digital images of coronal brain slices were acquired and analysed using ImageJ software (3rd edition, NIH, Bethesda, USA) by an operator blind to treatment status. The total infarct volume was determined by measuring the areas of infarcted tissue on both sides of the 2 mm sections and corrected for cerebral oedema [17]。

2.5。行为测试

为了评估任何治疗是否改善感觉运动结果，在MCAO后24小时进行了三种行为测试。使用Bederson等人开发的5分制量表(0 - 5)进行神经学评估。[18]。评分范围:0分(无缺陷)，1分(弯曲前爪)，2分(无法抵抗侧推)，3分(绕圈)，4分(烦躁绕圈)，5分(对刺激/麻木无反应)。胶带剥离试验是一种评估感觉运动损伤的双侧不对称爪子试验[19]。胶带(美国Dedham多样化的生物技术)10毫米×10毫米大小的手掌表面放在前爪和第一次尝试删除磁带所花费的时间(时间检测胶带),删除录音的时间,尝试删除磁带记录的数量。每个前肢按顺序从未受影响的一侧(右侧)开始进行评估，动物完成任务的时间最长为120秒(正常的老鼠通常需要5至30秒的时间来移除胶带)。每只大鼠在手术前一天被评估三次，在MCAO后24小时被评估一次。旋转棒测试通过评估老鼠在旋转棒上行走的能力来评估平衡和协调能力，旋转速度从每分钟4转逐渐增加到每分钟40转。这只动物跌倒的时间被记录了下来。

2.6。统计分析

通过方差分析（ANOVA）总梗死体积和生理参数进行了评价，接着Fisher的事后分析。采用秩和检验测试的神经功能评价测量进行了分析。使用ANOVA，随后之Scheffe多重比较从粘合带移除和转棒测试数据进行分析事后分析。被认为是显著。数据表示为平均值±标准偏差（SD）。

3.结果

3.1。生理数据，梗死体积测量和动物死亡

在手术期间和MCAO之前测量的生理参数均在正常范围内，并没有动物在治疗组之间差别显著（表1)。

每个治疗组的平均总梗死体积数据如图所示1。这些结果表明R18肽在剂量为100 nmol/kg和1000 nmol/kg时显著减少了19.7%的梗死体积()及24% (，而在300nmol /kg时，梗死体积减少了12% ()，尽管在统计上不显著。相比之下，在剂量为300 nmol/kg和1000 nmol/kg时，塔特- nr2b9c肽使梗死体积减少了6.8% (）和7％（），分别为，这些效果都没有统计学显著。At 100 nmol/kg, TAT-NR2B9c was ineffective in reducing infarct volume. In comparative terms, at 100 nmol/kg R18 was significantly more effective in reducing infarct volume than TAT-NR2B9c (19.7% versus 1.1%,)。

3.2。功能结果评估

尽管没有统计学显著，有改进的趋势在性能中的一些为R18和TAT-NR2B9c的处理组测定的行为参数的（图2-4)。与车用对照相比，100、300和1000 nmol/kg R18治疗组动物的神经学评分均有改善(图2)2)。By contrast, for TAT-NR2B9c, only the 1000 nmol/kg treatment group was associated with an improvement in neurological score compared to vehicle. Measurements for the adhesive tape test after MCAO were variable; however, treatment with the 300 nmol/kg R18 or 1000 nmol/kg TAT-NR2B9c appeared to improve the time required to detect tape from the right paw of the nonaffected forelimb, while the 100 nmol/kg TAT-NR2B9c treatment appeared to improve the time required to detect tape from the left paw (Figure图3（a）)。同样，在分别用1000 nmol/kg和100 nmol/kg的塔特- nr2b9c处理的动物中，从右爪和左爪移除胶带的尝试次数都有所增加(图2)图3（b）)。Additionally, treatment with 1000 nmol/kg R18 was associated with the shortest time to remove tape from the right paw (Figure图3（c）)。For the rota-rod test, the group receiving 100 nmol/kg R18 was the only treatment group that displayed an increased time to remain on the rotating cylinder when compared to vehicle (118 sec versus 77 sec, Figure4)。

3.3。失重法

All groups recorded a loss in body weight 24 hours after MCAO ranging from 28.5 grams for the TAT-NR2B9c 100 nmol/kg treatment group to ≈34.5 g for the 300 nmol/kg R18 and TAT-NR2B9c treatment groups (Figure五)。

4。讨论

The results of the present study add to our previous findings, which showed that 1000 nmol/kg R18 when administered 30 minutes after permanent MCAO significantly reduces infarct volume in the rat [10]。重要的是，我们现在证明R18在更宽的治疗窗口(60分钟)和更宽的剂量范围(100-1000 nmol/kg)更有效，而且总的来说，R18比广泛描述的神经保护肽TAT-NR2B9c更有效。R18和稍低程度的塔特- nr2b9c的治疗，通过行为测试评估，导致了一些功能恢复，但没有达到统计上显著的水平，这很可能反映了研究中使用的中风模型的严重性以及相对较少的动物数量。尽管有这些限制,我们的研究结果强调的潜在临床适用性R18中风治疗干预,尤其是考虑到证据表明TAT-NR2B9c优越作为神经保护代理,这是计划进入三期临床试验在中风患者20]。R18的优异的神经保护功效，与TAT-NR2B9c的很符合我们的体外在谷氨酸发现诱导的细胞死亡的神经元的兴奋性毒性模型[8]。

的TAT-NR2B9c的肽已经显示出是在啮齿动物的神经保护[11，21-25]和非人灵长类动物中风模型[13，14]，并已被认为是安全的，并导致发生动脉瘤夹闭术[例缺血性脑损伤没有显着减少15]。NR2B9c多肽(KLSSIESDV)来源于n -甲基- d -天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚基蛋白的细胞内末端羧基区[11并与富含精氨酸的TAT肽(YRKKRRQRRR)融合，从而进入大脑和神经元细胞。NR2B9c肽设计作为竞争性抑制剂的psd - 95适配器蛋白质(突触后密度- 95)绑定NR2B亚单位蛋白,在这一过程中,阻止下游细胞信号传导与NMDA受体的过度刺激,导致一氧化氮合酶激活和一氧化氮的后续生产;然而,我们(9] 和别的 [25，26提出了其他的神经保护机制。

作为一种替代机制，我们已经提出了TAT-NR2B9c的神经保护性质很大程度上由TAT肽本身[介导的9，而我们[7，27] 和别的 [28，29]以前曾报道显示适度的神经保护性质。此外，由于TAT肽的精氨酸含量和正电荷，它很可能具有相似的作用模式和精氨酸富含精氨酸的肽[8，9]。arginine-rich肽,我们此前提出,至少在部分神经保护与这些肽横向细胞膜的能力,在这一过程中,细胞表面的水平减少离子通道和受体,从而减少发生的有毒大量钙性脑缺血后神经元(8，9]。这种作用机制是符合富含精氨酸的肽的能力证实，以减少皮层神经元兴奋性毒性谷氨酸钙离子内流[8，9，三十-32和激发表达NR1-NR2 NMDA受体的卵母细胞中的受体电流[33]，以及肽神经保护效能与肽内吞或细胞膜转运特性相关的观察[34]。此外，几个研究已经证明，TAT融合肽和富含精氨酸的细胞穿透肽可以减少细胞表面离子通道和受体的神经元中的表达[26，31，35-38]和其它细胞[39]。

有证据表明精氨酸残基是肽和蛋白线粒体摄取的关键元素[40-43]和富含精氨酸的肽会对线粒体有益的作用。例如，在分离的大鼠肝线粒体，阳离子四 - 和聚阳离子肽和尤其是那些含有精氨酸的是在阻断诱导的线粒体肿胀的钙和保持膜电位高效[44]。Similarly, cationic compounds including tetrapeptides containing an arginine residue (e.g., SS-20, SS-31) or biguanidines (e.g., metformin) have been shown to target mitochondria and exert positive effects on the organelle by limiting complex I activity and reactive oxygen species production [41，45]，抑制线粒体通透性转换孔的开口[46]，保护嵴架构[47]，加速ATP恢复[47]，以及防止细胞色素c释放[48]。虽然线粒体这些有益作用的确切机制尚未完全已知，阳离子胍基的能力与线粒体膜磷脂的阴离子磷酸基团尤其是内膜磷脂心磷脂（-2净电荷）相互作用可以是一个因素。

最近，马歇尔等人。[49]证实聚精氨酸肽的神经保护特性在在活的有机体内NMDA诱导的视网膜神经节细胞的兴奋性中毒模型和提供的证据表明，肽减少神经元的线粒体氧化应激。此外，在HEK293细胞中证明了聚精氨酸的肽定位于线粒体和减少线粒体呼吸，膜电位，和活性氧的水平[49]。值得注意的是，马歇尔等人[49发现被视网膜神经节细胞吸收的多精氨酸肽被定位在小的球形胞质结构中，作者认为这是线粒体。同样有趣的是最近围绕富含精氨酸的博尔纳病病毒线粒体靶向蛋白X的研究。融合到细胞穿透肽的全长蛋白X和X衍生肽显示出神经元、轴突和线粒体保护特性[50，51]。

另一机制，使富含精氨酸的肽发挥神经保护作用，可能与多聚精氨酸和富含精氨酸的肽抑制前蛋白转化酶（例如，弗林蛋白酶和PC4 [的蛋白水解活性的能力52，53]），组织蛋白酶C [54和蛋白酶体[55，56]，下列脑缺血，其可以是有益的效果。例如，弗林蛋白酶是遍在表达的负责膜结合蛋白，包括金属蛋白酶，已知其具有对血脑屏障以下中风不良影响的活化钙依赖性转化[57]。类似地，已知的治疗，以抑制蛋白酶体，其负责短命胞质蛋白的降解是公知的，以减少中风的脑损伤[58，59]。

总之，从目前的研究支持其他调查结果，结果从我们的实验室[8-10]和建议，精氨酸和富含精氨酸的肽可能代表了一类新的神经保护剂具有巨大的临床潜力，急性和慢性神经损伤的治疗。重要的是，它是可能的报告急性脑损伤的动物研究融合到一个“神经保护肽”富含精氨酸的细胞穿透肽的有益作用主要归因于精氨酸残基的影响包含在肽内[9]。这增加的证据表明，富含精氨酸的肽（包括R18）可以是在范围急性临床神经学病症的有益的生长的重量。还有证据表明，富含精氨酸的肽可以改善中枢神经系统损伤功能的恢复作为TAT-NR2B9c的在击球中的作用[证明实验研究60]和TAT-ISP在脊髓损伤[61]。因此，有支持需要对富含精氨酸的肽的效应临床研究，以确定这些肽是否在病人中风或其他急性和慢性神经性疾病同样有益的证据越来越多。

利益争夺

B. P. Meloni和N. W. Knuckey是关于使用富含精氨酸肽作为神经保护治疗的几项专利的持有者。其他作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

Meloni提出了研究的理论和实验设计。D. Milani进行中风动物实验，监督动物护理，并对结果进行分析和解释。N. W. Knuckey和R. S. Anderton对实验设计和结果分析的发展做出了贡献。J. L. Cross对动物护理和动物加工做出了贡献。D. Milani和B. P. Meloni撰写了论文的初稿和终稿。

致谢

这项研究已通过圣母院澳大利亚圣母大学的支持下，西澳大利亚神经科学研究所（WANRI），神经外科，查尔斯爵士盖尔德纳医院，西澳大利亚州补助的神经创伤研究计划，并通过西澳大利亚大学探路者补助金。作者还感谢诺曼·帕尔默教授在论文的准备提供援助。

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