SRT 中风的研究和治疗 2042 - 0056 2090 - 8105 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/2372710 2372710 研究文章 R18 Polyarginine肽比TAT-NR2B9c更有效(NA-1)肽当管理60分钟后大鼠大脑中动脉闭塞永久 米拉尼 D。 1、2、3 Knuckey n W。 2、3、4 安德顿侦探 r S。 1、2 交叉 j·L。 2、3、4 梅洛尼 b P。 2、3、4 Liebeskind 大卫·S。 1 健康科学学院 圣母大学的澳大利亚 弗里曼特尔 WA 6160 澳大利亚 nd.edu.au 2 西澳大利亚神经科学研究所 Nedlands WA 6009 澳大利亚 wanri.org 3 神经外科学系 查尔斯爵士Gairdner医院 QEII医疗中心 Nedlands WA 6009 澳大利亚 scgh.health.wa.gov.au 4 中心的神经肌肉和神经系统紊乱 西澳大利亚大学 Nedlands WA 6009 澳大利亚 uwa.edu.au 2016年 10 5 2016年 2016年 24 02 2016年 11 04 2016年 2016年 版权©2016 d·米拉尼等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

我们检查的剂量响应polyarginine R18(100、300和1000 nmol /公斤),管理60分钟后永久性大脑中动脉阻塞(MCAO)。TAT-NR2B9c肽,是神经在啮齿动物和非人灵长类动物中风模型,作为一个积极的控制。MCAO后24小时内,减少梗塞总额R18对待动物的剂量,但这只达到统计显著性减少剂量的100和1000 nmol /公斤。TAT-NR2B9c肽减少梗塞体积剂量的300和1000 nmol /公斤,但没有统计上显著的程度,而100 nmol /公斤剂量是无效的。减少梗死体积和R18 TAT-NR2B9c肽治疗被改善在一个或多个镜像功能结果(即神经评分、胶带去除和rota-rod),但没有统计上显著的程度。这些发现进一步证实polyarginine肽的神经保护属性和R18延长治疗时间窗和剂量范围,以及证明其更大功效TAT-NR2B9c相比严重中风模型。R18的高级神经保护功效TAT-NR2B9c强调的潜在polyarginine肽作为研究的领先候选人在人类中风。

 1。介绍

虽然中风的发病率下降在发达国家,它仍然是死亡和残疾的主要原因在世界范围内,越来越全球疾病负担由于人口老龄化,以及不断流行的糖尿病,高血压,和肥胖 1]。急性治疗,对于缺血性中风,再灌注疗法使用tPA(组织纤溶酶原激活物)单独或最近结合血栓切除术是目前最有效的治疗干预( 2- - - - - - 6]。然而,尽管tPA /血栓切除术治疗的成功,接受这种治疗的中风患者的数量相对较少。这是由于多种因素包括狭窄的治疗时间窗tPA /血栓切除术(3 - 4.5 h卒中后),延迟病人获得医疗保健,脑部扫描的要求排除haemorragic中风,需要训练有素的人员和专业设备进行干预。考虑到这些限制,继续寻找神经保护代理,可以安全地管理卒中后早期发作卒中后限制脑损伤的程度和再灌注时,可以使用干预措施无法实施。此外,任何神经保护治疗,提高疗效,安全性,和治疗窗口tPA /血栓切除术的临床意义。

在神经保护药物方面,我们实验室最近证明polyarginine arginine-rich肽强有力的神经保护特性 在体外损伤模型,模拟中风的影响( 7- - - - - - 9]。此外,我们有这些扩展 在体外结果表明polyarginine肽R9机型,R12, R18显著减少梗塞体积在一个永久的大脑中动脉阻塞(MCAO)中风模型( 8, 10]。基于这些 在体外和 在活的有机体内结果,我们最近提出的 8, 9]arginine-rich肽包括“神经多肽”融合arginine-rich细胞穿透肽(例如,TAT-NR2B9c [ 11]和TAT-JNKI-1 [ 12)代表了一类新的神经保护药物的精氨酸残基神经保护的关键。

在目前的研究中,我们进一步评估的有效性R18 polyarginine肽通过检查的剂量响应能力和延长治疗管理时间从永久MCAO后30分钟- 60分钟。并行,研究比较的功效与乙R18融合NR2B9c肽(TAT-NR2B9c),它曾被认为是神经保护在各种啮齿动物和非人灵长类动物中风模型和减少人类缺血性脑损伤后血管内修复破裂动脉瘤( 11, 13- - - - - - 15]。

 2。材料和方法 2.1。肽研究中使用

R18 (H-RRRRRRRRRRRRRRRRRR-OH)和TAT-NR2B9c (H-YRKKRRQRRR-KLSSIESDV-OH,也称为NA-1)肽研究中使用被Mimotopes合成(澳大利亚墨尔本)。肽是HPLC-purified 98%纯度和受到肽水解氨基酸肽的液相色谱分析,获得精确的测量内容(Mimotopes)。肽是准备在0.9%氯化钠注入(辉瑞,珀斯,澳大利亚)整除为650 μL体积在−3毫升注射器和存储20°C到使用。

 2.2。外科手术为永久性大脑中动脉闭塞

手术永久大脑中动脉阻塞(MCAO)以及行为和组织学评估进行按照西澳大利亚大学动物伦理委员会,以下列出的指导方针 澳大利亚的动物保健和使用代码用于科学目的。

灯丝永久MCAO中风模型在我们的实验室已经执行先前描述( 10, 16]。简而言之,男性Sprague-Dawley老鼠重275 - 340克,禁食一夜之间经历了面罩和4%异氟烷麻醉(一氧化二氮混合30%的氧气/ 70%)与2%异氟烷和维护。尾动脉插管允许血压监测和测量动脉血液气体(pO2,pCO2)、pH值和葡萄糖。MCAO过程被认为是成功的,如果有一个>从基线后,脑血流量减少25%插入的灯丝,以激光多普勒flowmetry。在手术过程中,体温是密切监测使用直肠探头(美国克利夫顿Physitemp工具)和维持在37 - 37.8°C,与风机加热或冷却,必需的。

60分钟后MCAO大鼠静脉注射治疗通过右颈内静脉使用的输液泵车(0.9%氯化钠,600 μL / 6分钟)或三个不同剂量的肽(R18或TAT-NR2B9c: 100、300、或1000 nmol /公斤,600 μL / 6分钟)。治疗方法是随机和所有程序执行而被蒙蔽的治疗方法。

五十岁男性Sprague-Dawley老鼠永久MCAO接受手术。八个动物被排除在研究:五个动物排除由于不足脑血流量的降低MCAO后,一个被排除由于麻醉诱导期间,和两只动物被排除在外,因为没有明显的梗死病变检测MCAO后24小时(一个盐水,一个R18 100 nmol /公斤对待动物)。进一步6动物死亡几个小时前24小时post-MCAO研究终点但仍包含在最终的梗塞体积分析。这些动物包括两个R18治疗(一个100 nmol /公斤和一个1000 nmol /公斤)和四个TAT-NR2B9c治疗(两个100 nmol /公斤,一个300 nmol /公斤,和一个1000 nmol /公斤)的动物。而死亡的确切原因无法确定,有可能是它反映了中风的严重程度在这个模型中,这是导致高达90%的半球中风梗塞的的影响。梗死体积分析每个治疗组由六个动物。由于动物死亡前24小时研究终点,每组4到6个动物行为测试。

 2.3。手术后的监测

动物的体温测量每30 - 60分钟使用直肠探头至少2小时后手术和维护之间的37.0和37.8°C。为了避免体温过低,老鼠笼子被放置在一个加热垫在手术后的监测和安置在一间休息室维持在26 - 28日期间°C。如果有必要,通过应用执行额外的加热或冷却风机加热或冷水喷雾。

 2.4。梗死体积的评估

梗塞体积评估MCAO后24小时(如前所述)( 17]。短暂脑冠状切片染色在2毫米2 3%,3,去除氯(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)。数字冠状切片图像,并分析了使用ImageJ软件(马里兰州贝塞斯达美国NIH,第3版)由经营者盲目治疗状态。梗塞总额决定通过测量领域的梗塞组织两边的2毫米的部分和纠正脑水肿( 17]。

 2.5。行为测试

为了评估如果任何治疗改善感觉运动的结果,三个行为测试进行MCAO后24小时。神经系统评估了使用五分制(0−5)由Bederson et al。 18]。分数区间0没有赤字,1弯曲前爪,2无法抵抗侧推,3为盘旋,激动盘旋4,5没刺激/昏迷。胶带删除测试是一个双边不对称爪子测试来评估感觉运动障碍( 19]。胶带(美国Dedham多样化的生物技术)10毫米×10毫米大小的手掌表面放在前爪和第一次尝试删除磁带所花费的时间(时间检测胶带),删除录音的时间,尝试删除磁带记录的数量。每个前肢评估顺序从影响侧(右侧)与动物有一个最大的120秒完成任务(正常老鼠通常需要5至30秒删除录音)。每个老鼠都评估了三次手术前的那天,一旦MCAO后24小时。rota-rod测试评估的平衡和协调能力评估一只老鼠的能力保持走在一个旋转杆,旋转的速度是逐渐从4个增加至40转每分钟。动物会被记录。

 2.6。统计分析

梗塞总额和生理参数评估通过方差分析(方差分析)费雪的紧随其后 事后分析。神经系统评估测量使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行了分析。胶带去除和rota-rod测试数据分析使用方差分析其次是矫正的多重比较 事后分析。 P < 0.05 被认为是重要的。数据提出了均值±标准差(SD)。

 3所示。结果 3.1。生理数据,梗塞体积测量,和动物死亡

生理参数测量在手术之前,MCAO在正常范围内,动物治疗组之间没有显著差异(表 1)。

生理参数(均值±SD)。

参数 实验小组
车辆(盐水) R18 (nmol /公斤) TAT-NR2B9c (nmol /公斤)
One hundred. 300年 1000年 One hundred. 300年 1000年
PaO2之前,MCAO 117.19±22.44 114.66±11.34 115.16±13.79 124.16±14.35 109.33±9.04 117.83±16.55 112.83±12.93
帕科2之前,MCAO 38.33±2.94 39±3.57 39.5±3.50 42.68±6.17 43.66±8.93 39.5±5.78 39.83±3.74
pH值,在MCAO 7.36±0.05 7.42±0.09 7.37±0.04 7.44±0.06 7.38±0.04 7.45±0.04 7.39±0.06
葡萄糖(更易/ L), MCAO之前 8.0±1.37 8.15±0.68 7.81±0.96 8.11±1.00 7.21±1.31 7.71±0.81 7.50±1.73
英国石油公司(毫米汞柱),平均在手术过程中 87.33±4.17 88.33±7.06 84±5.13 91.6±5.44 91±3.09 83.66±6.34 88±3.68
温度(°C),手术后平均2 h 37.51±0.16 37.37±0.25 37.46±0.29 37.46±0.21 37.43±0.25 37.53±0.17 37.52±0.21

数据意味着每个治疗组梗塞总量呈现在图 1。这些结果表明,R18肽显著降低梗死体积剂量的100 nmol /公斤和1000 nmol /公斤19.7% ( P = 0.043 )和24% ( P = 0.013 ),分别,300 nmol /公斤,梗塞体积减少12% ( P = 0.19 ),虽然没有统计上显著的程度。相比之下,虽然TAT-NR2B9c肽剂量的300 nmol /公斤和1000 nmol /公斤梗塞体积减少了6.8% ( P = 0.56 )和7% ( P = 0.55 分别),这些效果在统计学上没有显著意义。在100 nmol /公斤,TAT-NR2B9c是无效的在减少梗塞体积。比较而言,在100 nmol /公斤R18明显更有效减少梗死体积比TAT-NR2B9c(分别为19.7%和1.1%, P = 0.045 )。

永久MCAO后梗塞体积测量24小时。治疗静脉注射接种(盐水车或R18 TAT-NR2B9c肽在100,300,或1000 nmol /公斤;600年 μL体积超过6分钟)MCAO后60分钟。值意味着±SD。 P ∗ < 0.05 相比汽车集团和控制 P # < 0.05 相比TAT-NR2B9c 100 nmol /公斤。†表示动物死后几个小时前24小时post-MCAO研究终点但仍包含在最终的梗塞体积分析。

 3.2。功能结果评估

虽然没有统计学意义,有改善的趋势的性能在某些行为参数测量R18和TAT-NR2B9c治疗组(数字 2- - - - - - 4)。神经学分数为100、300和1000 nmol /公斤R18治疗动物表现出改善的结果相比vehicle-treated控制(图 2)。相比之下,TAT-NR2B9c,只有1000 nmol /公斤治疗组与改善神经评分与汽车相比。MCAO后测量胶带测试变量;然而,治疗300 nmol /公斤R18或1000 nmol /公斤TAT-NR2B9c似乎改善所需的时间检测到磁带的右爪nonaffected前肢,而100 nmol /公斤TAT-NR2B9c治疗似乎改善所需的时间从左爪(图检测胶带 3(一个))。同样,尝试删除磁带所需数量的左翼和右翼的爪子增加动物接受1000 nmol /公斤和100 nmol /公斤TAT-NR2B9c,分别(图 3 (b))。此外,治疗1000 nmol /公斤R18与最短的时间把磁带从右爪(图 3 (c))。rota-rod测试,收到100 nmol /公斤R18是唯一治疗组显示增加时间停留在旋转筒相比,车辆(118秒和77秒,图 4)。

神经系统评分成绩永久MCAO后24小时(0 =没有赤字,5 =主要赤字)盐(车辆)和肽(R18 TAT-NR2B9c在100、300、或1000 nmol /公斤)治疗组。图上的线显示范围和正中神经的分数。

功能评估测量使用胶带移除测试之前和MCAO后24小时盐水(车辆)和肽(R18 TAT-NR2B9c在100、300、或1000 nmol /公斤)治疗组。(一)时间检测胶带。(b)试图移除胶带的数量。(c)时间删除磁带。值意味着±SD。最长时间允许胶带去除是120秒。

Rota-rod性能永久MCAO后24小时盐水(车辆)和肽(R18 TAT-NR2B9c在100、300、或1000 nmol /公斤)治疗组。值意味着±SD。

 3.3。体重测量

所有组记录体重的损失MCAO后24小时从28.5克TAT-NR2B9c 100 nmol /公斤治疗组为300 nmol /公斤≈34.5 g R18 TAT-NR2B9c治疗组(图 5)。

减肥的永久MCAO后24小时盐水(车辆)和肽(R18 TAT-NR2B9c在100、300、或1000 nmol /公斤)治疗组。值意味着±SD。

 4所示。讨论

本研究的结果添加到我们之前的结果,这表明1000 nmol /公斤R18当永久MCAO后30分钟服用显著减少梗塞体积大鼠( 10]。现在重要的是,我们表明,R18是有效的在一个更广泛的治疗窗(60分钟)和更广泛的剂量范围(100 - 1000 nmol /公斤),总的来说,R18比广泛特征更有效的神经保护肽,TAT-NR2B9c。R18治疗,以及在较小程度上TAT-NR2B9c,导致一些功能恢复评估行为测试,但没有达到显著水平,这最有可能反映出中风的严重程度模型加上使用相对少量的动物研究。尽管有这些限制,我们的研究结果强调的潜在临床适用性R18中风治疗干预,尤其是考虑到证据表明TAT-NR2B9c优越作为神经保护代理,这是计划进入三期临床试验在中风患者 20.]。R18 TAT-NR2B9c相比的优越的神经保护功效与我们的是一致的 在体外发现在谷氨酸诱导的神经会引起的细胞死亡模式( 8]。

TAT-NR2B9c肽已被证明是神经在啮齿动物 11, 21- - - - - - 25)和非人类灵长类动物中风模型( 13, 14),被发现是安全的,导致减少无意义的缺血性脑损伤患者动脉瘤手术( 15]。NR2B9c肽(KLSSIESDV)来源于细胞内端羧基的n -甲基- d(门冬氨酸)受体NR2B亚单位蛋白( 11),是融合arginine-rich答肽(YRKKRRQRRR)允许进入脑细胞和神经细胞。NR2B9c肽设计作为竞争性抑制剂的psd - 95适配器蛋白质(突触后密度- 95)绑定NR2B亚单位蛋白,在这一过程中,阻止下游细胞信号传导与NMDA受体的过度刺激,导致一氧化氮合酶激活和一氧化氮的后续生产;然而,我们( 9)和其他( 25, 26)提出了其他的神经保护机制。

作为一种替代机制,我们建议TAT-NR2B9c神经保护的特性在很大程度上是由乙肽本身( 9),我们( 7, 27)和其他( 28, 29日先前报告显示适度的神经保护属性。)此外,由于乙肽的精氨酸内容和正电荷,很可能具有类似的作用方式polyarginine和arginine-rich肽( 8, 9]。arginine-rich肽,我们此前提出,至少在部分神经保护与这些肽横向细胞膜的能力,在这一过程中,细胞表面的水平减少离子通道和受体,从而减少发生的有毒大量钙性脑缺血后神经元( 8, 9]。这种机制的行动符合确认arginine-rich肽的能力减少谷氨酸excitotoxic钙流入大脑皮层神经元( 8, 9, 30.- - - - - - 32)和唤起在NR1-NR2 NMDA受体电流receptor-expressing卵母细胞( 33),以及观察肽神经保护功效与内吞作用的肽或细胞膜横向属性( 34]。此外,一些研究已经表明,乙融合肽和arginine-rich细胞穿透肽可以减少细胞表面的表达在神经元离子通道和受体 26, 31日, 35- - - - - - 38和其他细胞 39]。

有证据表明,肽和蛋白质精氨酸残基是关键元素线粒体摄取[ 40- - - - - - 43),arginine-rich肽对线粒体起到有益的作用。例如,在孤立的鼠肝线粒体,阳离子tetra和polycationic肽,尤其是那些含有精氨酸在阻断钙高效诱导线粒体肿胀和维持膜电位( 44]。同样,阳离子化合物包括含有精氨酸残基的四肽(例如,SS-20 SS-31)或biguanidines(如二甲双胍)已被证明目标线粒体和细胞器上起到积极作用通过限制复杂我活动和活性氧的生产( 41, 45),抑制线粒体渗透性转换孔开放( 46),保护嵴架构( 47],加速复苏。ATP [ 47),和防止细胞色素c的释放 48]。而这些有利影响线粒体的确切机制目前还不完全清楚,阳离子胍基组织的能力与磷酸阴离子组线粒体膜磷脂尤其是内膜磷脂双磷脂酰甘油(−2净电荷)可能是一个因素。

最近,马歇尔et al。 49]polyarginine肽的神经保护性质的确认 在活的有机体内NMDA-induced视网膜神经节细胞会引起模型并提供了证据表明,肽减少神经元线粒体氧化应激。此外,它是在HEK293细胞中证明polyarginine肽本土化线粒体和减少线粒体呼吸、膜电位和活性氧水平( 49]。它也是有趣的,马歇尔et al。( 49]发现polyarginine肽被视网膜神经节细胞内局部小球形胞质结构,作者建议是线粒体。也感兴趣的是最近的研究围绕arginine-rich博尔纳病病毒mitochondrial-targeting蛋白质X X和X-derived全长蛋白肽融合细胞穿透肽显示神经元,轴突,线粒体保护特性 50, 51]。

另一个机制即arginine-rich肽发挥神经保护作用可能与polyarginine能力和arginine-rich肽的蛋白水解活性抑制proprotein转化酶(如furin和PC4 [ 52, 53),组织蛋白酶C [ 54),蛋白酶体( 55, 56),这可能是有益的脑缺血后产生影响。例如,furin广泛表达calcium-dependent转化酶的激活负责膜结合蛋白,包括金属蛋白酶,已知副作用在中风后血脑屏障( 57]。同样,治疗被抑制水解酶负责短暂的胞质蛋白的降解,减少中风(脑损伤 58, 59]。

综上所述,从目前的研究结果支持其他发现从我们的实验室 8- - - - - - 10),表明polyarginine和arginine-rich肽可能代表一种新的神经保护制剂有巨大的临床潜力的治疗急性和慢性神经损伤。重要的是,它是可能的有利影响报道arginine-rich细胞穿透肽融合的神经保护肽在动物研究急性脑损伤主要是由于精氨酸残基的影响包含在肽( 9]。这增加了更多的重量的证据表明arginine-rich肽(包括R18)可能是有益的急性临床神经障碍。也有证据表明,arginine-rich肽可以提高功能恢复从中枢神经系统损伤就是明证TAT-NR2B9c在中风的影响实验研究 60)和TAT-ISP脊髓损伤( 61年]。因此,有越来越多的证据支持临床研究的影响的必要性arginine-rich肽建立这些肽是否也同样有益的中风患者或其他急性和慢性神经系统疾病。

 相互竞争的利益

b·p·梅洛尼和n . w . Knuckey多项专利的持有者是关于使用arginine-rich肽神经保护治疗。其他作者声明没有利益冲突。

 作者的贡献

b·p·梅洛尼开发研究的理论和实验设计。d·米拉尼中风动物实验执行,监督动物保健,并分析和解释结果。n . w . Knuckey和r·s·安德顿导致发展的实验设计和分析的结果。j·l .交叉导致动物保健和处理。d .米拉尼和b·p·梅洛尼写了初稿和最终版本的论文。

 确认

本研究支持了圣母大学的澳大利亚西澳大利亚神经科学研究所(WANRI),神经外科,查尔斯爵士Gairdner医院,西澳大利亚创伤研究项目拨款和西澳大利亚大学的探路者。作者还要感谢教授诺曼·帕尔默在论文的准备提供帮助。

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