文摘

客观的。软骨修复的缺陷,一个共同的条件造成很多因素,仍然是一个巨大的挑战。根据他们chondrogenic分化能力,间充质干细胞(MSC),基于软骨再生软骨缺损修复是一种很有前途的方法。然而,MSC分化内层中或相关细胞谱系是精心控制的干细胞分化阶段因素和影响生物活性元素的数组,这可能会阻碍目标细胞的高效生产。因此,确定一个转录因子促进chondrogenic分化是至关重要的。在此,我们探讨的机制scrapie-responsive基因1 (SCRG1),促进软骨再生的候选基因,调节chondrogenic msc分化。方法。的表达SCRG1中检测出脐cord-derived msc (UCMSCs)定量逆转录聚合酶链反应(存在)在chondrogenic分化和免疫组织化学分析。SCRG1 chondrogenic潜在的功能后评估通过慢病毒载体基因击倒或超表达。最后,建立了兔软骨缺损模型来评估SCRG1在软骨修复的效果在活的有机体内。结果。表达SCRG1调节期间在体外UCMSCs chondrogenic分化。SCRG1UCMSCs击倒抑制chondrogenic分化,而SCRG1过度提倡chondrogenic UCMSCs分化体外。此外,UCMSC overexpressing SCRG1促进软骨修复在活的有机体内。从力学上看,SCRG1提升chondrogenic分化通过upregulation Wnt5a表达式和随后的抑制β连环蛋白。结论。我们的结果表明,SCRG1促进chondrogenic分化UCMSCs通过抑制Wnt /规范β通过Wnt5a连环蛋白信号。我们的发现提供了一个未来的目标chondrogenic分化和软骨再生。

1。介绍

软骨缺陷通常引起的骨折创伤,手术,肿瘤,和其他因素。由于其再生能力较差,一旦受损的软骨,预后差(1]。目前,软骨移植被认为是最有效的软骨修复,和自体nonarticular软骨和间充质干细胞(MSC)的两个最重要的来源是基于组织工程软骨组织移植。然而,有许多问题自nonarticular软骨移植,包括二次伤害,道德考虑,来源不足,阻碍了临床应用。相比之下,再生医学MSC-based msc可以克服这些问题很容易获得,具有良好的组织相容性,具有生物活性2]。因此,MSC-based组织工程是一个有前途的替代治疗软骨缺损修复的策略。

msc具有自我更新和multilineage分化能力,可以分化为软骨细胞,骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞和子宫内膜细胞(3,4]。体细胞脐带msc (UCMSCs)有几个优势其他msc(例如,骨髓和脂肪msc),如无痛,无致瘤性,低免疫原性,和强大的增殖和分化5,6]。因此,UCMSCs是一项重要的组织工程和再生医学的种子细胞来源。MSC-based组织工程包括三个密切相关的组成部分:即。、msc、诱导因素,支架(7]。在这些组件中,msc,生成软骨细胞在诱导因素的活动,形成可行的组织工程再生的基础。然而,干细胞分化成软骨细胞的机制很复杂,知之甚少。目前,chondrogenic分化的msc在体外通过添加生物转化生长因子等诱发β、胰岛素和糖皮质激素(8,9]。几个基因在chondrogenic分化被认为是重要的,尤其是SRY-box家族转录因子9 (SOX9) [10,11]。Sox9,调节chondrogenic分化期间,可以增加chondrogenic基因的表达,如胶原蛋白II型α1链(COL2A1)和aggrecan (能)[12]。值得注意的是,这个过程需要3 - 4周chondrogenic分化,不方便在临床应用13]。因此,小说的发展方法或目标应有助于促进chondrogenic分化,提高软骨再生功效。

各种生物活性因子促进干细胞的分化,因此有利于组织再生(14]。然而,许多这些因素仍有待探讨。在目前的研究中,我们旨在识别和描述可能促进UCMSCs chondrogenic分化的分子。以前转录组分析发现一些差异表达基因(度)与msc chondrogenic分化有关,包括上调Scrapie-Responsive基因1(SCRG1)[15]。SCRG1首次被发现在高位朊病毒感染所引起的传染性海绵状脑病(16]。SCRG1位于4 q34.1,编码98个氨基酸的蛋白质。强烈表达和分泌的神经系统,主动脉和睾丸16]。SCRG1能刺激软骨形成的小鼠C3H10T1/2细胞(一种小鼠胚胎成纤维细胞,可以分化成软骨细胞)在体外(9]。到目前为止,然而,它的影响UCMSCs chondrogenic分化和底层的机制尚不清楚。在这里,我们探讨SCRG1参与chondrogenic分化的机制,这将为软骨修复再生医学提供新的见解。

一系列的信号转导途径参与细胞分化,包括Wnt /β连环蛋白、切口、印度的刺猬,转化生长因子β/ SMAD,河马信号通路(17,18]。Wnt /β连环蛋白通路在细胞命运的决心很重要,和它的激活和抑制对软骨和骨骼的形成至关重要。有许多类型的Wnt配体,但是他们的角色在软骨分化需要说明。

在这项研究中,我们探讨了函数和潜在机制的SCRG1 chondrogenic人类UCMSCs的分化在活的有机体内和在体外。我们的研究结果应该为未来的组织工程在再生医学中的应用。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和UCMSCs文化

本研究经伦理委员会批准的延安医院隶属于昆明医科大学(证书编号:2008 - 001)。脐带是获得健康的捐赠者,提供提前签署知情同意。分离、培养UCMSCs根据我们之前的方法(5,19]。UCMSCs是有文化的α最小基本介质(αmem)补充10%胎牛血清,1% penicillin-streptomycin, 5 ng / mL基本成纤维细胞生长因子。当confluency细胞生长达到80% - -90%时,他们被胰蛋白酶化通道。细胞通道4 - 6后被用于实验。

2.2。流式细胞术和Multilineage分化

UCMSC表面标记流式细胞术分析。收集细胞的密度 细胞/毫升,用磷酸盐(PBS),在染色resuspended缓冲区,并沾抗体(美国562245年,BD)对CD73 CD90、CD105、CD34、CD45、CD19, CD11b, HLA-DR在黑暗中30分钟。之后,这些细胞被洗resuspended PBS,然后分析了使用流式细胞分析仪(FACSCanto™II, BD,美国)。成骨、脂肪形成的和chondrogenic变异进行评估UCMSCs的分化潜能。成骨分化脂肪形成的文化协议按照制造商的指示。21天,钙矿化和脂滴发现使用茜素红S和油红O染色技术,分别。微球文化系统是用于chondrogenic分化。收集细胞的密度 细胞/毫升,10μL液滴被播种到12-well盘子。2 h后细胞粘附,chondrogenesis-inducing介质(05 - 220 - 1 - b, BI,以色列)添加到盘子。媒介取代每周两次。21天,葡糖氨基葡聚糖被阿尔新蓝染色检测。

2.3。基因转染的慢病毒颗粒

慢病毒颗粒(击倒和超表达)都从Genechem购买(上海,中国)。三个短发卡rna(成分)对SCRG1被设计出来,和最有效的(见表1序列信息)被用于后续的实验。对于病毒转染,UCMSCs被播种在six-well板的密度 细胞/。中添加了“(分泌物)当细胞达到30%汇合。12 h的病毒转染后,媒介完全培养基所取代。在转染后72 h,细胞被选中与嘌呤霉素(2μg / mL)。为分析或通过细胞收获confluency 80% - -90%。基因表达的SCRG1被存在量化。

表1
针对SCRG1信息成分。
2.4。总RNA提取和存在

总RNA提取细胞和微球使用超级提取总RNA工具包(美国Promega LS1040)和总RNA是反向转录成cDNA使用GoScript逆转录混合(美国Promega A2791)。我们执行中存在使用1μg的互补SsoFast EvaGreen®Supermix工具包(美国Bio-Rad 1725201)根据制造商的指示。正向和反向引物序列如表所示2。分析了每个样本一式三份。基因表达结果归一化β肌动蛋白相比,提出了叠化控制。

表2
引物序列用于这项研究。
2.5。RNA序列(RNA-seq)和生物信息学分析

RNA-seq进行识别信号通路被激活SCRG1超表达。超表达阴性对照组(OE-nc)和超表达SCRG1集团(OE-SCRG1)收获,每组有三个样品分析。总RNA提取使用试剂盒®试剂(美国表达载体)和用作互补脱氧核糖核酸库输入材料制备、测序使用Illumina公司NovaSeq 6000紧随其后。度的分析,两组都使用了DESeq2 R包(v1.20.0)。基因集富集分析(GSEA)应用于识别重要的和一致的生物差异的两个州。基因排序根据微分表达式的两个样本的程度。预定义的基因集合然后测试确定基因丰富列表的顶部或底部。基因和基因组的京都百科全书(KEGG)分析了数据集使用的本地版本GSEA工具(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)。

2.6。阿尔新蓝和红色染料O /快速绿色染色

微球的UCMSCs分化chondrogenic媒介21天,然后固定在4%多聚甲醛(PFA)一夜之间。接下来,样本嵌入在石蜡,切成5μ片,deparaffinized,水化,沾1%阿尔新蓝在室温下过夜。之后,幻灯片被冲洗三次使用盐酸0.1 N和蒸馏水来中和酸性,然后用无水乙醇脱水,并与中性胶密封。图像捕捉到一个尼康Eclipse 50我(日本)。番红精O /快速绿色染色的切片deparaffinized,水化与PBS和沾快速绿色解决方案5分钟。后来,幻灯片是在水中清洗,孵化在30年代的番红精求解决方案,与无水乙醇脱水两次,与中性树脂密封,使用尼康成像Eclipse 50我(日本)。

2.7。免疫印迹分析

细胞溶解了UCMSCs radioimmunoprecipitation分析缓冲和蛋白酶抑制剂补充。蛋白质浓度测定用BCA分析工具包(Beyotime生物技术,中国)。蛋白质的溶解产物(20 - 40μg)分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,然后封锁与tris-buffered脱脂牛奶5%盐水渐变20 (TBST)在室温下1 h,其次是孵化与抗体Wnt5a (1: 1000;# 2530年代,细胞信号技术,美国),β连环蛋白(1:1000;# 8480年代,细胞信号技术,美国),GAPDH (1: 5000;美国Proteintech 60004 - 1 - ig)一夜之间在4°C。膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(美国Proteintech 1: 5000年,SA00001-2)在室温下1 h。蛋白质的乐队是可视化使用增强化学发光(ECL)工具包(美国亲和力生物科学KF005)和检测使用ChemiDoc™触摸成像系统(美国Bio-Rad)。乐队的强度是决定使用ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/)和归一化GAPDH水平。评估SCRG1 Wnt5a和的影响βUCMSCs连环蛋白表达,细胞治疗重组人类SCRG1(英国Abcam rhSCRG1, ab161421)浓度450 ng / mL 1 h。

2.8。免疫组织化学

免疫组织化学(包含IHC)染色,片deparaffinized二甲苯和患者分级乙醇。内源性过氧化物酶活性被3%的H2O210分钟。山羊血清阻断与5%后在室温下1 h,一夜之间,片被孵化在4°C以下主要抗体:SCRG1 (1: 800;美国Proteintech 14038 - 1 - ap), Col2a1 (1: 400;美国Proteintech 28459 - 1 - ap),和能(1:800;13880 - 1 - ap - 100μ美国Proteintech L)。第二天,孵化了片streptavidin-HRP-conjugated二级抗体1 h,然后使用diaminobenzidine衬底可视化。片与苏木精复染色、脱水和中性密封胶。平均光密度(MOD)积极使用ImageJ Pro + v6.0疣状进行了分析。的蛋白表达SCRG1慢病毒转染后被包含IHC检测。UCMSCs播种在24-well盘子。盖玻片加工如上所述均为包含IHC染色鼠标anti-SCRG1(1: 200年,14038 - 1 - ap, Proteintech,美国)。检测COL2A1和能表达与重组人类Wnt5a (UCMSCs激活rhWnt5a;Abcam)和rhSCRG1 ab204627,细胞无血清培养系统在37°C 4 h,然后处理rhWnt5a (300 ng / mL)和rhSCRG1 (450 ng / mL) 37°C 24 h。接下来,执行包含IHC染色与初级抗体COL2A1(1: 100)和(1:200)能如上所述。

2.9。软骨缺损模型和UCMSCs植入在活的有机体内

所有动物实验伦理委员会批准延安医院隶属于昆明医科大学(证书编号:2020-090-01)。评估SCRG1的影响在活的有机体内,我们使用16-week-old雄性新西兰白兔。软骨缺损模型建立了通过手术在股骨滑车沟如下。首先,兔子和异氟烷麻醉,后膝关节囊是一层一层地打开,,膝盖骨脱臼内侧暴露的股骨远端关节面。接下来,一个电钻,3.5毫米直径是用于创建一个完整的软骨厚度缺陷股骨滑车沟的相应的表面,之后UCMSCs被添加到缺陷。有三个组,即。,blank control group (Blank), negative control lentiviral vector group (OE-nc), and overexpression of SCRG1 group (OE-SCRG1). For the blank group, only Matrigel (356231, Corning, USA) was administered to the defects. For the OE-nc and OE-SCRG1 groups, UCMSCs were transfected with negative control virus and overexpression of SCRG1 virus, respectively, then mixed with Matrigel on ice at a final concentration of 2 × 107细胞/毫升。这种混合物被应用到缺陷。人工基底膜固化后,膝关节髌骨重新定位,胶囊和皮肤被关闭分层技术使用适当的缝合线。所有的兔子都肌内注射青霉素连续三天预防感染和被允许自由移动的笼子。

2.10。修复组织的病理分析

在手术后12周,兔子被牺牲在深麻醉下,和股头被孤立的成像和宏观评价根据国际准则的软骨修复社会(icr)评分系统20.]。随后,各股头被固定在4% PFA 48 h和脱钙为3周。接下来,嵌在石蜡和样本分为5μm切片,苏木精和伊红染色()),阿尔新蓝,和红色染料o .再生组织分析根据修改后的icr组织学评分系统,并且每个样本评估由三个病理学家对幻灯片信息视而不见。

2.11。统计分析

统计分析与执行GraphPad棱镜8 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。所有数据给出平均值与标准偏差( )。学生的差异进行评估 - - - - - -测试或单向方差分析(方差分析)。一个 < 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。识别和UCMSCs分化

7天之后,许多梭形细胞中观察到的主要文化(图1(一))。两周后,confluency细胞达到80%,在这段时间里,他们被使胰蛋白酶化进一步通过。细胞通过5(图1(一)流式细胞术分析收集)。结果表明,细胞表达CD73(积极率:99.83%),CD90(积极率:99.90%),和CD105(积极率:98.30%),但对CD45不利,CD34, CD19 CD11b, HLA-DR(图1 (b)),与msc(识别标准一致21]。这些结果表明,孤立的细胞被UCMSCs。的功能描述UCMSCs被组织学染色进一步验证。结果表明,UCMSCs可能分化成成骨,脂肪形成的,和chondrogenic血统,在图中以茜素红S,油红O,和阿尔新蓝染色,分别。这些发现表明,UCMSCs拥有multilineage分化潜能(图1 (c))。

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隔离和UCMSCs的识别。(a)的照片UCMSCs通道0 (P0)和P5,纺锤形UCMSCs。 。(b)流式细胞术的结果。绿线代表同形像控制,红线代表UCMSCs。UCMSCs积极CD73、CD90、CD105表达和负CD45, CD34, CD19, CD11b, HLA-DR表达式。(c)茜素红S,油红O、阿尔新蓝染色。结果表明,UCMSCs分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。 。
3.2。SCRG1调节在UCMSCs Chondrogenic分化

评估SCRG1表达水平在UCMSCs chondrogenic分化,细胞培养在chondrogenesis-inducing中使用微球文化系统21天。首先,验证chondrogenic UCMSCs分化,阿尔新蓝染色进行评估粘多糖在细胞外基质分泌的软骨细胞,存在然后用来量化软骨细胞标记物的表达水平。结果表明粘多糖的积累在细胞外基质(图2(一个)在21天),软骨细胞标记物的表达水平显著增加在chondrogenic分化(图2 (b))。此外,存在被用来衡量的表达水平SCRG1在软骨形成,显示一个持续和显著增加chondrogenic分化(图2 (c))。我们也分析了蛋白表达水平的SCRG1包含IHC染色后21天的感应。结果显示显著增加SCRG1-protein表达式在chondrogenic分化(数字2 (d)和2 (e)),与存在的研究结果一致。

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SCRG1 chondrogenic期间调节分化。(一)阿尔新蓝染色UCMSCs chondrogenic在21天0和分化;结果表明粘多糖的积累后21天在chondrogenic分化,表明UCMSCs软骨形成。 。(b) chondrogenic基因的信使rna表达水平(SOX9,COL2A1,能在感应)调节。(c)在感应SCRG1 mRNA表达水平的调节。(d, e)蛋白水平SCRG1 chondrogenic分化调节后21天,包含IHC检测到的。 。实验重复三次; ( - - - - - -测试)。
3.3。SCRG1击倒抑制Chondrogenic UCMSCs分化

检查的影响SCRG1 UCMSCs chondrogenic分化,我们用慢病毒载体表达shRNA针对SCRG1 UCMSCs。存在结果显示SCRG1转染后表达明显降低SCRG1成分(图3(一个))。转染后SCRG1的蛋白质表达水平也下降了SCRG1成分(图3 (b)和3 (c))。转录因子的SOX9 chondrogenic分化中起着重要的作用,和软骨细胞细胞外基质富含胶原和蛋白聚糖,COL2A1和最能代表(11]。SCRG1击倒后,信使rna表达水平SOX9,COL2A1,能显著降低,表明SCRG1可能参与chondrogenic分化(图3 (d))。阿尔新蓝染色显示后蛋白聚糖的合成被抑制SCRG1击倒(图3 (e))。此外,包含IHC染色显示COL2A1的表达水平,能减少SCRG1击倒(图3 (f)和3 (g))。

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SCRG1击倒抑制chondrogenic分化UCMSCs的潜力。(a - c) mRNA和蛋白表达水平的SCRG1转染后下降SCRG1成分,检测到存在和包含IHC。 。(d)SOX9,COL2A1,能SCRG1击倒后mRNA水平下降。在21天(e)阿尔新蓝染色。结果表明,粘多糖合成SCRG1击倒后显著降低。COL2A1 (f, g)蛋白质含量和能检测到包含IHC SCRG1击倒后21天下降。 。实验重复三次; ( - - - - - -测试)。
3.4。SCRG1提升Chondrogenic UCMSCs分化在体外

我们下过表达SCRG1 UCMSCs使用慢病毒载体。存在和包含IHC结果表明SCRG1转染后表达增加(数据4(一)- - - - - -4 (c))。此外,细胞中存在分析overexpressing SCRG1 (OE-SCRG1)表明chondrogenic基因的表达水平SOX9,COL2A1,能显著增加的价格相比负对照组(OE-nc)(图4 (d))。阿尔新蓝染色显示SCRG1过度增加葡糖氨基葡聚糖合成(图4 (e))。同样,包含IHC证明SCRG1超表达的蛋白表达水平增加COL2A1和能(数字4 (f)和4 (g))。因此,SCRG1击倒抑制chondrogenic UCMSCs分化,而SCRG1过度推广chondrogenic分化。

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SCRG1过度推广chondrogenic UCMSCs分化。(a - c) mRNA和蛋白水平的SCRG1被存在和包含IHC检测。结果表明,信使rna和蛋白质水平的SCRG1 SCRG1过度后增加。 。(d)SOX9,COL2A1,能信使rna水平SCRG1过度后增加。(e)阿尔新蓝染色显示,粘多糖的增加SCRG1过度后21天。 。COL2A1 (f, g)蛋白质含量和能检测到包含IHC天21 SCRG1击倒后增加。 。实验重复三次; ( - - - - - -测试)。
3.5。SCRG1提升Chondrogenic分化UCMSCs Wnt5a信号通路

确定机制促进UCMSCs SCRG1对软骨形成的影响,我们进行了RNA-seq OE-nc和OE-SCRG1团体之间的识别度。根据这个结果,我们执行使用GSEA KEGG通路富集分析,发现最显著富集的通路是“KO 04550”(信号通路调节干细胞的多能性)(图S1)。在这个信号通路中,我们注意到Wnt5a顶级丰富基因列表的底部。结果显示Wnt5a是负相关时这个途径SCRG1超表达(图5(一个),S2)。Wnt /β在软骨分化[连环蛋白信号传导中起着重要作用22]。因此,我们假设SCRG1通过Wnt5a信号通路调节软骨分化。基于免疫印迹分析,UCMSCs SCRG1击倒后,Wnt5a明显减少β连环蛋白显著增加。然而,rhSCRG1管理后,Wnt5a回收的蛋白质表达水平β连环蛋白减少(图5 (b)和5 (c))。Wnt5a SCRG1正相关和负相关β连环蛋白,这表明Wnt5a可以促进chondrogenic分化抑制Wnt /规范化β连环蛋白信号通路。进一步确定的影响Wnt5a UCMSCs软骨形成,细胞治疗和rhWnt5a rhSCRG1protein SCRG1击倒后,然后受到细胞包含IHC染色。结果表明,COL2A1的蛋白表达水平和能减少SCRG1击倒后,处理后恢复rhWnt5a和rhSCRG1protein 24 h,表明SCRG1促进软骨形成的UCMSCs Wnt5a(数字5 (d)和5 (e))。

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SCRG1 UCMSCs通过Wnt5a信号通路的调节软骨形成。(a)调节多能性干细胞的信号通路是最大大丰富了基于GSEA KEGG通路,wnt5a负相关,这种途径后SCRG1超表达。(b, c)免疫印迹分析表明,Wnt5a shSCRG1转染后下降,恢复后rhSCRG1管理局(450 ng / mL);蛋白质水平的βWnt5a连环蛋白表现出相反的趋势。COL2A1 (d, e)蛋白质含量和能被包含IHC UCMSCs中发现。COL2A1结果表明,蛋白质含量和能减少SCRG1击倒后,处理后恢复rhWnt5a (300 ng / mL)和rhSCRG1 (450 ng / mL)蛋白在24 h。 。实验重复三次, ( - - - - - -测试)。
3.6。UCMSCOE-SCRG1促进软骨再生在活的有机体内

验证UCMSCs SCRG1对软骨再生的影响在活的有机体内,我们将UCMSCs移植到一个软骨缺损模型(图6(一))。在移植后12周,兔子被安乐死,滑车骨软骨样本收获宏观和组织学评价。宏观评价,明显的缺陷在对照组,观察和一些透明组织可见底部的缺陷。OE-nc组,透明的组织,包含的缺陷和小型、分散的裂缝或裂缝是可见的。再生组织几乎完全与周围的软骨,集成和缺陷表面有点不平衡。OE-SCRG1组,缺陷表面是光滑和再生组织紧密连接到周围的软骨,没有裂缝或裂缝检测(图6 (b))。只有分数(图6 (d)OE-SCRG1组显著高于OE-nc和控制组织( )。组织学评价,他走时染色显示缺陷对照组满心坏死,纤维组织,而阿尔新蓝和红色染料O /快速绿色染色显示没有粘多糖和软骨细胞再生的缺陷。OE-nc组)染色显示缺陷包含细胞和纤维组织,而阿尔新蓝染色鉴定一些糖胺聚糖表达再生组织,和红色染料O /快速绿色染色显示软骨细胞再生的发生缺陷。OE-SCRG1组)染色显示相当大的细胞增殖的缺陷,具有类似细胞形态学周围正常的软骨,以及一些缺陷表面的纤维组织。阿尔新蓝染色发现大量葡糖氨基葡聚糖的缺陷和红色染料O /快速绿色染色表明,大量的软骨细胞生成,和生成的组织是一样的(图周围的软骨组织6 (c))。修改icr组织学评分(图6 (e))还表明,缺陷修复OE-SCRG1组显著高于OE-nc和对照组( )。总之,这些结果表明,SCRG1超表达促进chondrogenic UCMSCs体内分化。

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UCMSCOE-SCRG1促进软骨缺损修复在活的有机体内。(一)软骨缺损模型和UCMSC管理局的示意图。(b)软骨缺陷的照片在12周后UCMSC管理。空白组的明显缺陷的观察,而表面是光滑和再生组织紧密连接到周围的软骨OE-SCRG1组。(c))、阿尔新蓝和红色染料O /快速绿色染色在手术后12周。结果表明,缺陷在空白组包含坏死,纤维组织,而OE-SCRG1组显示相当大的软骨细胞再生和组织形态类似于正常周围的软骨。(d) icr宏观分数在手术后12周。分数在OE-SCRG1group明显高于OE-nc集团( )。(e)修改icr组织学得分在手术后12周。OE-SCRG1组的得分显著高于OE-nc组( )。 。 ; ( - - - - - -测试)。

4所示。讨论

Chondrogenic分化是msc的最重要的能力之一。相对于其他类型的msc、UCMSCs有很多优势,比如强大的分化能力,非侵入式收集、致瘤性,低免疫原性。因此,UCMSCs软骨组织工程的理想种子细胞的来源。然而,潜在的分子机制UCMSCs生成软骨需要进一步的研究。在这项研究中,我们成功地孤立UCMSCs,发现SCRG1提升chondrogenic UCMSCs分化在体外和在活的有机体内通过抑制Wnt /规范β通过Wnt5a连环蛋白信号通路。

由于软骨的再生能力弱,需求越来越先进的方法或新的目标来改善软骨缺损修复的精度和有效性。导演msc分化为软骨细胞再生医学是一个有前途的方向,已广泛应用于再生软骨缺陷(23]。虽然各种方法应用于促进chondrogenic分化,如生长因子、液,长非编码rna (lncRNA),和小分子核糖核酸24,25),需要进一步的研究来确定一个最优的方法。虽然SCRG1表示人体的许多组织在组织水平,其功能仍不知道。在这里,检查的功能在UCMSC SCRG1 chondrogenic分化,我们使用慢病毒载体抑制或过表达SCRG1。结果表明,SCRG1积极监管chondrogenic基因的表达,包括SOX9,COL2A1,能,类似于之前的研究9,25),这表明SCRG1提升chondrogenic UCMSCs分化在体外。Chondrogenic和干细胞成骨分化发生在相反的方向(26,27]。不同的转录因子,如Wnt10b SOX9, RUNX2 [22,28,29日),是调节或表达下调,以确定msc在chondrogenic和成骨分化的细胞命运。先前的研究显示,SCRG1高度表达在软骨分化和成骨分化过程中大大减少了30.,31日]。同样,我们的结果表明,过度SCRG1提升UCMSCs分化成软骨和chondrogenic UCMSCs的承诺可能是一个关键因素。

我们建立了一个全层软骨缺损模型新西兰白兔膝关节的软骨修复的常用动物模型实验。与其他模型不同,我们没有使用三联式移植细胞组成,支架,诱导物(7,32,33]。相反,我们使用增长因素都可以降低人工基底膜支架。随着人工基底膜液体在冰上和彻底凝固在37°C,我们与基底膜基质UCMSCs冰混合,然后将混合移植到的缺陷。在移植后12周,再生组织包含的缺陷,但没有人工基底膜,这表明它可能是吸收。因此,我们认为人工基底膜是主管脚手架MSC移植。我们也评估软骨修复使用标准的icr宏观评分系统和修改icr组织学评分系统,得分越高表明更好的修复。基于我们的研究结果,OE-SCRG1集团取得最高的分数。组织学分析,他走时染色显示OE-SCRG1组缺陷满心再生细胞,不包含坏死或纤维组织。阿尔新蓝染色显示,许多葡糖氨基葡聚糖被生成,绿色和红色染料O /快速染色表明,再生细胞缺陷是软骨细胞。然而,尽管我们的观察再生软骨细胞的缺陷表明SCRG1促进软骨再生在活的有机体内从内生兔细胞,软骨细胞是否出现或分化UCMSCs需要进一步研究。

我们还执行RNA-seq和生物信息学分析,发现SCRG1提升chondrogenic分化Wnt5a信号通路。基于GSEA,我们KEGG通路富集分析。结果表明,最重要的是丰富了通路有关“调节干细胞的多能性”(KO 04550)(图S1)。这个途径参与细胞命运的承诺。SCRG1过表达时,UCMSCs开始分化,失去他们的多能性。我们的研究结果表明,SCRG1过表达促进chondrogenic UCMSCs分化和UCMSCs可能分化成软骨细胞。此外,wnt5a后最高富集基因通路KO 04550 SCRG1超表达(图S2)。这些发现表明,wnt5a细胞分化有关,和SCRG1超表达促进chondrogenic UCMSCs分化。因此,我们相信Wnt5a UCMSCs chondrogenic分化的关键因素。UCMSCs SCRG1击倒后,Wnt5a明显减少β连环蛋白显著增加。然而,rhSCRG1管理后,Wnt5a回收的蛋白质表达水平β连环蛋白减少(图5 (b))。我们还发现的蛋白表达水平COL2A1 SCRG1击倒后,能减少和治疗后恢复rhWnt5a和rhSCRG1protein在24 h(图5 (d))。因此,我们相信Wnt5a UCMSCs chondrogenic分化的关键因素。Wnt5a Wnt信号通路中的配体,对细胞特定类型函数通过激活规范Wnt /β连环蛋白通路或抑制Wnt /规范β连环蛋白通路(34]。在MSC chondrogenic分化,Wnt5a抑制Wnt /规范化β连环蛋白信号通路,促进msc分化成软骨(22,35),与我们的研究结果一致。检查是否SCRG1与Wnt5a相互作用,我们进行了反向coimmunoprecipitation (co-IP)实验。不幸的是,我们的结果表明,SCRG1没有直接联系Wnt5a(表S1)。我们还执行(PPI)分析蛋白质间交互作用使用GeneMANIA PPI交互数据库(https://genemania.org/)丰富Wnt5a和SCRG1之间,我们发现在以往的研究(图S3),SCRG1 Wnt5a可以间接连接通过FZD1和WIF1 [36,37]。基于上述结果,我们推测SCRG1通过Wnt5a信号通路促进chondrogenic分化。规范化Wnt /β连环蛋白信号通路密切相关干细胞成骨分化和chondrogenic [38]。之前的研究表明,激活规范Wnt /β连环蛋白信号通路可能导致成骨分化的msc (39),而其抑制作用可以促进chondrogenic msc分化[40]。激活途径可以降低β连环蛋白降解,成骨分化,同时抑制途径可以增加β连环蛋白降解,chondrogenic分化(41]。Wnt5a Wnt信号通路中的配体,对细胞特定类型函数绑定到它的受体。具体来说,Wnt5a可以抑制规范化Wnt /β连环蛋白信号通路,促进msc分化成软骨(22,35),与我们的研究结果一致。另一方面,以往的研究报道,Wnt5a可以激活规范Wnt /β连环蛋白信号抑制纤维/脂肪形成的祖细胞的分化成脂肪细胞(42]。因此,Wnt5a可能促进软骨形成,抑制干细胞的分化为其他细胞类型。然而,这种机制需要进一步研究。

5。结论

本研究表明,SCRG1促进chondrogenic分化UCMSCs通过抑制Wnt /规范β通过Wnt5a连环蛋白信号通路,从而提供一个潜在的新目标高效软骨再生和生产力chondrogenic分化。

数据可用性

所有数据将以合理的要求。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

作者的贡献

Yuchuan周和郑添了同样的工作。

确认

这项工作是由中国政府支持引导当地云南省科学技术发展基金(YDZX20205300002962),格兰特为生物医药产业发展云南省工业和信息化部(2020),重点研究和发展项目的云南省科学技术部(202003 ac100014)和云南省的重点研发国际合作项目部门科技(2018 ia045)。

补充材料

图S1:丰富基于GSEA KEGG途径分析。探索潜在的机制,我们执行RNA-seq和生物信息学分析,发现SCRG1提升chondrogenic分化Wnt5a信号通路。基于GSEA,我们KEGG通路富集分析。结果表明,最重要的是丰富了通路有关“调节干细胞的多能性”(KO 04550)。图S2:最丰富的基因通路调节干细胞的多能性。Wnt5a与这个途径丰富基因和负相关后SCRG1超表达。这些发现表明,wnt5a细胞分化有关,和SCRG1超表达促进chondrogenic UCMSCs分化。图S3: SCRG1-related分子网络,分析了genemania。我们执行(PPI)蛋白质间交互作用的分析使用GeneMANIA PPI交互数据库(https://genemania.org/)丰富Wnt5a和SCRG1之间,我们发现在以往的研究(图S3), SCRG1 Wnt5a可以间接通过FZD1和WIF1相连。表S1: Wnt5a抗体的蛋白质列表拆除。检查是否SCRG1与Wnt5a相互作用,我们进行了反向coimmunoprecipitation (co-IP)实验(因为没有商业抗体SCRG1免疫印迹和co-IP分析)。我们的研究结果显示,和Wnt5a SCRG1没有直接联系。(补充材料)