文摘

客观的。本研究旨在筛选差异表达谱下的mRNA失重骨质疏松症通过高通量测序技术,以及在分子水平上研究失重骨质疏松症的发病机制尤其是在骨髓间充质干细胞(bmsc)。方法。小鼠骨髓间充质干细胞线分为地面组和模拟微重力(SMG)组。BMP-2被用来诱导成骨分化,SMG组放入2 d-gyroscope模拟失重状态。转录组测序是由Illumina公司技术、地面和SMG集团之间的度是使用DEseq2算法进行的。分子功能和信号通路富集度被全面分析通过多种科学方法,包括但不限于,KEGG GSEA, PPI分析。结果。263度的确定是通过比较这两组,包括186个调节基因和77个表达下调基因。分析表明,度浓缩在成骨细胞,破骨细胞细胞增殖,分化,细胞凋亡;KEGG分析显示,度明显富集在肿瘤坏死因子信号通路和FoxO信号通路;从数据库Reactome浓缩的结果显示,度主要是参与Hoxb3基因的转录,RUNX1招聘KMT2A基因,和Hoxa2染色质信号通路的激活。四个基因,白细胞介素6、趋化因子受体CXCR4 IGF1和PLOD2确认为中心基因进行后续分析。结论。本研究阐明的意义10基因在失重骨质疏松症的发展中心。此外,这项研究的结果提供了理论依据和小说思想的后续研究失重骨质疏松症的发病机理和临床治疗。

1。介绍

骨质疏松症、系统性退行性骨病,特点是系统性骨质流失和发育不全;降低骨质密度、变薄和osteophytic骨骨小梁断裂;和骨折的风险增加1]。目前,antiosteoporosis药物是临床上分为两大类:骨吸收抑制药和骨形成促进药物(2),在临床实践中取得了良好的效果。然而,一些研究报告(3],宇航员遭受失重骨质疏松症由于缺乏生理特殊失重环境下机械负荷刺激的空间,因此,它几乎是困难的常用antiosteoporosis药物来缓解骨质疏松症在宇航员的发展4],严重威胁到宇航员的身体和心理健康和飞行任务的顺利执行。这些原因主要是归因于缺乏探索失重骨质疏松症的发病机理和治疗。

骨髓间充质干细胞(bmsc)是一个类的成体干细胞自我更新和多向分化潜能5),它可以分化成一系列细胞包括成骨细胞、脂肪细胞、内层,肌肉细胞、神经细胞。此外,它扮演着一个重要的监管作用,维持身体的正常生理活动。研究表明,bmsc是重要的监管机构在维护骨细胞,成肌细胞体内的内容。相关学者(6,7]发现bmsc的分化成成骨细胞被抑制,和脂肪细胞的分化被提升在失重状态下,这可能导致肌肉系统萎缩和骨质疏松症的症状。因此,研究bmsc的机制和相关的目标基因的表达在失重环境下已成为失重骨质疏松的预防的关键。

航天数据(8体现,weightlessness-induced骨矿物质密度降低,平均每月率为1.0% ~ 1.6%,是10 ~ 15倍的速度在绝经后妇女骨质疏松。因此,为了确保长期太空飞行的宇航员成功完成太空任务,本研究旨在调查失重骨质疏松症的致病基因和可能机制,以及为后续临床药物靶点提供参考。

近年来,随着高通量测序(高温超导)技术的迅速发展,其高通量的特点,短时间,高灵敏度使它应用于几位生物医学领域9]。高温超导技术可以找出基因集各种疾病中发挥重要的监管作用。因此,研究首先构造一个失重的骨质疏松症细胞模型下,分析差异表达基因(度)通过高温超导技术,其次是分析基因耳科(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)度推出他们的发病机理。然后,蛋白质相互作用(PPI)网络构建探索蛋白质导致失重骨质疏松症之间的关系。这将提供一个强大的基础发生和发展的分子机制失重骨质疏松和潜在的药物治疗的目标。根据研究结果,本研究将为早期检测提供有效手段,失重骨质疏松症的诊断和治疗宇航员和航空航天工业最终做出相应的贡献。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和实验条件

骨髓间充质干细胞(bmsc, C3H10T1/2)从Procell购买生命科技有限公司有限公司(请中文)和例行孵化high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Procell,中文)含10% head-inactivated胎牛血清(美国双子的边后卫)37°C和5%的公司₂饱和湿度孵化器。在模拟失重的前一天,细胞接种 盖玻片的密度 电脑/块和孵化一夜six-well盘子。盖玻片上的细胞密度达到30%后,接种细胞的盖玻片被插入到槽的不锈钢支架旋转,放入预热旋转室充满高糖DMEM培养基含有10%的边后卫,和成骨分化解决方案添加BMP-2成骨的归纳。泡沫排水后,幻灯片放在2 d-clinostat的旋转臂(2 d-rwv旋转血管壁,由中国航天员科研训练中心)(10]。这些细胞被旋转在24 48 h r / min的细胞培养。旁边的地面组将陀螺仪和孵化。模拟失重后,细胞被收集到一个离心管后续RNA提取。2 d-clinostat和模拟微重力装置的结构如图1。

2.2。Illumina公司高通量测序数据库

试剂盒工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)是利用提取总RNA从地面组和SMG组细胞样本,分别。安捷伦2100生物分析仪是用于评估的质量中提取总RNA。浓缩后的真核mRNA聚(反面通过磁珠低聚糖(dT),信使rna被缓冲。支离破碎的信使RNA是用作模板和随机寡核苷酸引物合成第一链cDNA M-MuLV逆转录酶系统,其次是退化的RNA链RNaseH和第二链cDNA与核苷酸的合成DNA聚合酶I系统。提纯双链cdna end-repaired, A-tailed,连接到测序连接器,筛选了200个基点的互补AMPure XP珠子,进行PCR扩增,纯化PCR产品再次与AMPure XP珠子。最后,图书馆得到放大和测序Illumina公司Novaseq6000音序器。

2.3。质量控制基因表达矩阵

生成的矩阵分析了基因表达价值观澄清组之间的差异和它们是否适合后续分析。主成分分析(PCA)和相关热点图是用来显示这两个群体之间的差异。的基因测序得到的两组进行了维恩图解分析为后续分析。此外,表达式的值的小提琴图6样品被可视化 ,这显示密度在每一个样本的数据。

2.4。筛选度在失重骨质疏松症

DEseq2算法利用之间的显著差异,分析地面组和SMG组细胞样本。度被定义为的筛选阈值 和 ,这被认为是统计上的显著差异。样本和基因进一步进行聚类分析,和度是由R的热图(“pheatmap”包)显示表达式每组度的大小和变化模式。

2.5。度的函数和信号通路富集分析失重骨质疏松症

度上传到大卫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/,基因功能注释在线数据库工具)11),去执行(基因本体)和KEGG(京都基因和基因组的百科全书)分析,并浓缩Reactome数据库分析和GSEA分析进一步开展在分子水平上探索度的生物学意义。去是一个国际标准分类系统基因功能,这主要包括细胞组件(CC),分子功能(MF)和生物过程(BP)。KEGG信号通路的主要公共数据库,允许信号通路相关的信息度。Reactome数据库涵盖了一些物种的反应和生物信号通路,更重要的是丰富度途径能找到。基因集富集分析(GSEA)进一步探索度的主要细胞信号通路。

2.6。蛋白质相互作用网络分析(PPI)

字符串是一个数据库分析不同基因表达的蛋白质之间的相互作用关系。选中的共同度被用来构建交互网络使用字符串数据库,和获得的基因网络导入Cytoscape 3.8.0软件进行进一步分析,然后最密切互动子网是基于MCC算法进一步筛选。研究[12)表明,MCC算法旨在确定最相关的关键目标和子网的复杂和庞大的互动网络,这是一个最有效的方法来识别目标基因。这有助于研究疾病的分子机制和新药物的目标从更全面的角度来看。

2.7。免疫印迹分析

免疫印迹分析主要是用于检测相关蛋白的表达水平。bmsc接种T25培养瓶,诱导成骨分化之后,SMG组的样本受到模拟失重实验。然后,总蛋白提取的bmsc两组分别使用phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)细胞溶菌作用缓冲区。皮尔斯BCA蛋白质分析工具包(Beyotime生物技术,中国)是用来确定蛋白质标准曲线和样品的蛋白浓度。然后,蛋白质样本与缓冲溶液混合,煮在100°C。蛋白质分离10%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜通过半干的传输方法。膜被密封在室温下2小时5%的脱脂牛奶,三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐水和渐变20 (TBST)缓冲区;主要抗体包括趋化因子受体CXCR4、IGF1和GAPDH(英国Abcam)稀释和孵化一夜之间在4°C。和膜被山羊孵化anti-rabbit辣根过氧化物酶共轭(英国Abcam)在室温下1 h。最后,蛋白质信号与增强化学发光检测装备,和乐队密度测量使用推出生物成像工具。

2.8。统计分析

所有数值数据都表示为 三个独立的复制实验。结果使用学生的统计比较 - - - - - -测试。 被认为是一个统计上的显著差异。统计分析都是由SPSS19.0软件(SPSS公司,美国)。

3所示。结果

3.1。数据预处理矩阵的表达式

根据Illumina公司测序仪器的结果,样本之间的关系和获得的数据进行了综合评价。PCA分析表明,地面和SMG组区分PC2轴(图2(一个));相关热图分析显示两组之间的很强的相关性,这是宝贵的,以备后续分析(图2 (b));可重复性散点图表示,集团内的数据分布呈正相关(图2 (c))。维恩图显示有10443个基因,同时与后两组测序(图相对应2 (d));小提琴图显示的表达符合正态分布(图6个样品2 (e))。

3.2。度的表达式分析失重骨质疏松症

通过设置阈值的 和 ,地面和SMG组的测序结果显示,共有263度被检测到,其中包括186调节基因和77个表达下调基因,和他们的特定的基因分布是火山地块(图所示3(一个)),与此同时,分层聚类分析的结果表明,共同度的表达水平地面组和SMG组之间(图明显不同3 (b))。本研究进一步表现出前20度的表达,如雷达情节(图所示3 (c))。具体coupregulated和codownregulated基因补充表所示1。

3.3。功能性浓缩度的分析

筛选度被上传到数据库和大卫在失重骨质疏松症功能富集分析。结果阐明,在英国石油公司主要是参与调节度的负调控多细胞生物过程,核糖核酸生物合成的过程,,和附着力;在曼氏金融,他们主要与细胞分化的调节,抗氧化活性,细胞增值和监管;在CC,他们主要是在细胞外基质含有胶原蛋白丰富,突触,高尔基体小泡。表达下调度多细胞生物过程、MSC移植和有丝分裂细胞周期相变主要是参与英国石油(BP);监管nucleobase-containing化合物代谢和atp酶激活活动主要是与曼氏金融联系在一起;和超分子复合体,细胞内的膜结合细胞器,染色质是主要富集在CC。此外,泡沫块显示最多的前十项结果的显著差异,如图4(一),接下来的20项显著差异是和弦图(图所示4 (b))。此外,浓缩与特定阈值的结果 补充表所示2。

3.4。度的信号通路富集分析

筛选度被上传到数据库和大卫KEGG、Reactome GSEA信号通路富集分析失重骨质疏松症。浓缩KEGG分析显示,度主要是参与细胞因子之间的相互作用,肿瘤坏死因子信号通路,FoxO信号通路。最强的十大信号通路相关选择和显示为泡沫图(图4 (c)),未来20信号通路,并有很强的相关性选择画和弦图,如图4 (d)。进一步的通路富集分析也表现在Reactome数据库中探索特定的信号通路。此外,Reactome信号通路富集分析进一步表明度主要富集在Hoxb3基因的转录,RUNX1招聘KMT2A基因和Hoxa2染色质信号通路的激活。十大最相关的信号通路图(图被显示为泡沫4 (e)),未来20与最相关的信号通路是和弦图(图所示4(f))。此外,浓缩KEGG和Reactome特定阈值的结果 补充表所示3和4,分别。GSEA分析在这项研究进一步表明,调节途径主要包括核糖体生物起源、基因复制,在真核生物和RNA运输,而下调途径主要包括ECM受体相互作用,Th17细胞分化,和B细胞受体信号通路(图5)。

3.5。蛋白质相互作用网络分析(PPI)

在分析功能和异常的信号通路,共同度被应用于构造PPI网络数据库使用字符串,和生成的基因网络导入Cytoscape 3.8.0软件进一步分析。MCC算法用于确定子网基因网络内最亲密的互动,和完全,3个子网生成。十大基因MCC值计算如下:白细胞介素6、趋化因子受体CXCR4, IGF1,小君,CD80、CD274, BCL6, CX3CL1 COL23A1, PLOD2。详细的结果如图6,深点的颜色表示的更重要作用基因在失重骨质疏松症的进展。

3.6。免疫印迹的验证结果

趋化因子受体CXCR4的表达和IGF1被免疫印迹检测分析。如数据所示7(一)和7 (b)趋化因子受体CXCR4失重环境中高度表达,IGF1虽然卑微表达。这与本研究的结果是一致的。

4所示。讨论

骨质疏松症,目前公认的最普遍的系统退行性骨病在世界各地,主要是由成骨细胞和破骨细胞功能失衡引起的。主要分为初级和中级骨质疏松,骨质疏松和二级(13)主要包括内分泌代谢疾病,影响骨代谢,毒品,停用,骨质疏松症和其他明确病因。其中失重骨质疏松症引起的太空飞行是一种特殊的废弃骨质疏松症(14]。一些研究显示15),主要原因是由于减少骨质流失骨骼失重状态下加载和机械部队。一些学者还发现(16],失重骨质疏松症与后全身体液的再分配人类进入太空。然而,很少有研究关注的分子目标导致失重骨质疏松症的发生。为了找到有效的潜在的治疗目标,有必要进一步探讨失重骨质疏松症的发病机理。

近年来,随着高温超导技术和生物信息学的快速发展,它已经被广泛应用于研究疾病的发生和发展,并进一步分析疾病的致病基因和他们的生物学意义17- - - - - -19]。此外,这部小说为基础的药物筛选中心基因也被报道(20.]。因此,本研究旨在调查监管机制和致病基因的主要功能在失重骨质疏松症的发生与发展,旨在为骨质疏松症的发病机制提供新颖的想法和随后的治疗目标。

去浓缩分析表明,表达下调度主要是参与的负调控生物过程,MSC迁移,有丝分裂细胞周期阶段的变化,和破骨细胞的成熟,这表明成骨细胞是失重条件下容易发生骨质疏松症进展;浓缩KEGG信号通路分析表明,调节度主要是参与细胞因子相互作用,肿瘤坏死因子信号通路,FoxO信号通路。先前的研究报道,TNF介导的绝经后骨质疏松症和骨质疏松症的发展系统性红斑狼疮(SLE)患者,这项研究的结果是一致的,肿瘤坏死因子信号通路介导的骨质疏松症在失重条件;浓缩Reactome信号通路分析阐明度主要是参与Hoxb3基因转录,RUNX1招聘KMT2A基因和Hoxa2染色质激活信号通路,表明Hoxb3和RUNX1相关信号通路在失重骨质疏松也起到了至关重要的作用。GSEA分析进一步表明,度主要参与核糖体生物起源、基因复制和RNA运输、ECM受体相互作用,Th17细胞分化,和B细胞受体信号通路在真核生物。这些功能可能对骨组织有一定的影响,主要包括调节成骨细胞分化、骨骼发育、骨矿化,调节骨吸收,膜内的骨生长,调节骨重塑。上述功能和信号通路相关的度是关键病机,介导失重骨质疏松症。

失重骨质疏松症的发生和发展是多种基因的联合行动的结果和信号通路。在这项研究中,PPI网络进一步构造识别和验证增效基因,和十大使用MCC基因计算算法,也就是说,白细胞介素6、趋化因子受体CXCR4, IGF1,小君,CD80、CD274, BCL6 COL23A1, PLOD2。其中,白细胞介素6、趋化因子受体CXCR4、IGF1和PLOD2终于纳入本研究的后续分析,因为这些基因和失重骨质疏松症之间的关系仍不清楚,这是值得进一步分析。因此,这些基因集将提供新思想对于理解失重骨质疏松症的发病机理。

细胞因子白介素multibiological特征位于人类染色体7 p21,这不仅广泛在各种类型的炎症是一个常见的炎症因子也在多个阶段和系统生物学中发挥了重要作用,如肝硬化(21]。相关学者发现白细胞介素6可以促进骨细胞的形成和吸收(22- - - - - -24]。临床研究显示[25白细胞介素6],信使rna是骨移植组织中高度表达的锥体骨折患者的骨质疏松症。它也被发现(26]一些炎症因子如白细胞介素6可能上调在成骨细胞RANKL的表达,加速RANKL信号转导,直接导致骨破坏。我们的研究进一步证实,白介素在失重骨质疏松症的进展密切相关。科学家趋化因子受体4型(CXCR4)是一个7-transmembrane G-protein-coupled受体(27),这是广泛表达于外周血和其他器官组织,包括造血干细胞、内皮细胞,淋巴细胞和肿瘤细胞28],主要参与趋化性免疫和造血系统(29日]。研究[30.]表明SDF-1 / CXCR4扮演重要角色在骨分化的发生和发展,骨再生,和骨科疾病,如新血管形成,BMSC移植和细胞因子的分泌。此外,SDF-1 / CXCR4也可以通过MAPK信号通路促进bmsc骨再生和分化(31日]。然而,我们的研究结果表明,趋化因子受体CXCR4失重骨质疏松症中高度表达,这可能与低表达状态在正常骨质疏松症。结合前面的发现血管内皮细胞倾向于细胞凋亡在失重条件下通过SDF-1 / CXCR4信号通路(32),本研究推断SDF-1 / CXCR4通路主要介导血管内皮细胞的凋亡过程,而不是在失重条件下骨分化。Procollagen-lysine, 2-oxoglutate 5-dioxygenase (PLOD2)是沉重的家庭的成员之一。研究[33- - - - - -35)表明,PLOD2被HIF-1介导αTGF -β,microRNA-26a / b促进神经胶质瘤的发生和发展。与此同时,PLOD2诱导骨髓基质细胞的分化36],PLOD2的异常表达可能导致勃拉克综合症(37),表现为骨生成缺陷,骨头脆弱和脆性断裂。本研究首先发现PLOD2扮演了重要的角色在调解失重骨质疏松症的进展。IGF1,即胰岛素样生长因子I,也是一个由人类蛋白质编码基因和多个单元的一个重要产品通过自分泌和旁分泌分泌。它已经表明,IGF1促进黑色素瘤细胞的转移,同时促进肝癌细胞的迁移和入侵通过上调EGR1的表达。IGF1骨骼发展也起到了至关重要的合成代谢作用[38),IGF1的低表达可能诱发骨质疏松骨折的风险,这与本研究的结论是相一致的。

5。结论

总之,寻找新的药物靶标,以防止或减缓失重骨质疏松症的一个主要在航天需要亟待解决的问题。在这项研究中,确定了度由高通量测序失重骨质疏松症模型,并分析了协同度之间的关系,进一步探索监管机制影响失重骨质疏松症的发生。白细胞介素6、趋化因子受体CXCR4、IGF1和PLOD2起着至关重要的作用,在失重骨质疏松,这提供了一个理论依据失重骨质疏松症的发病机理和治疗。

数据可用性

Bulk-RNA测序的原始数据用来支持本研究的发现是沉积在NCBI加入ID SUB11153018,这将是在1月1日公布2023年NCBI由于一些利益冲突,我们的实验数据的重要性。另外,相同的原始数据也可以发现在Figshare,和url如下。基因矩阵数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。我们共有6个文件上传Figshare,网址如下:https://figshare.com/s/74eb3ca1839318a2b249https://figshare.com/s/ef0cd053ad787107410dhttps://figshare.com/s/a02ce47840e7ecef1af6https://figshare.com/s/6093aec3ae70d11e9af6https://figshare.com/s/6fe3d14cbdbd9820a3adhttps://figshare.com/s/8adf677a50441fb43b92

同意

所有作者都同意这篇文章的出版。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突相关的手稿,和作者所批准的出版工作。

作者的贡献

本研究与团队合作完成。每个作者都有研究做出了相应的贡献。明艳、Zhibin刘、王董构思的想法。王董、李Weihang和章子怡丁写了主要的手稿。王董、李Weihang和章子怡丁使用软件。章子怡叮,全史,Shilei张,张Zhuoru下载并收集数据。李董Wang Weihang Xiaocheng王,张Shilei分析数据。Zhibin刘,明艳,王栋准备数据。明艳,Weihang李、王董和手稿Xiaocheng王的诉求。Xiaocheng Wang Zhibin刘,章子怡叮,Shilei章回顾了手稿。 Dong Wang, Weihang Li, and Ziyi Ding contributed equally as the co-first authors. Dong Wang, Weihang Li, and Ziyi Ding contributed equally to this work.

确认

本研究由国家自然科学基金支持的中国没有。82072475)。

补充材料

具体coupregulated和codownregulated基因补充表1所示。详细的浓缩的结果,KEGG, Reactome所有特定的阈值 补充表2所示,3和4分别。(补充材料)