文摘

炎症会影响的多能性和自我更新间充质干细胞(msc),从而改变他们的软骨再生的能力。Sprague-Dawley (SD)大鼠骨髓间充质干细胞(bmsc)被孤立,发现有瑕疵在interleukin-1分化潜能β-(il - 1β-)诱导炎性微环境。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,在许多细胞过程中扮演了重要的角色。GSK-3的作用β在炎症可能与核因子-κB (NF -κB)信号通路和Wnt /β连环蛋白信号通路的机制仍不清楚。在这项研究中,我们发现GSK-3β可以抑制il - 1的软骨形成β受损的bmsc通过扰乱新陈代谢的平衡,促进细胞凋亡。通过使用抑制剂氯化锂和SN50,我们证明GSK-3β通过NF -调节软骨形成κB和Wnt /β连环蛋白信号通路和可能介导NF -之间的交叉反应κB和β连环蛋白在细胞核中。鉴于GSK-3的分子机制β在炎症,chondrogenic分化GSK-3β是一个至关重要的目标inflammation-induced软骨疾病的治疗。

1。介绍

关节软骨损伤是一种常见的临床问题,关节肿胀和疼痛(1]。退化性关节疾病的主要人物、主要是骨关节炎和慢性炎性关节疾病,如风湿性关节炎,重要的是研究软骨损伤的机理和如何促进软骨修复(2,3]。骨髓间充质干细胞(bmsc)可以诱导分化成软骨细胞在一定条件下,因此他们有一个潜在应用治疗软骨损伤,炎症,和其他软骨疾病(4,5]。

糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一种丝氨酸/ threonine-protein激酶参与许多细胞内功能(6]。它是重要的核转录因子,在调节活动κB (NF -κB) (7,8]。NF -κB信号通路中起着至关重要的作用,通过调节炎症基因的转录参与细胞生长和细胞死亡。据报道,NF -κB显示mRNA水平影响chondrogenic分化的Sox9, chondrogenic转录因子(9]。与此同时,NF -的表达κB p65生长板软骨细胞可以促进生长板软骨形成(10]。

此外,GSK-3β专项拨款β连环蛋白被蛋白酶降解,介导Wnt /β连环蛋白信号通路。Wnt /β连环蛋白信号通路广泛参与细胞分化,特别是软骨形成和骨生成(11,12]。并在Wnt /畸变β连环蛋白信号通路往往与有缺陷的细胞分化有关。然而,GSK-3的角色β在il - 1的bmsc软骨形成β全身的炎症还没有完全描述,下属机制值得探索。

在这项研究中,我们调查了GSK-3的效果β在il - 1βbmsc的受损软骨形成。与此同时,我们使用氯化锂,GSK-3的抑制剂β探索GSK-3的监管β在NF -κB和Wnt /β连环蛋白信号通路。此外,SN50特定抑制剂的NF -κB易位,被用来验证NF -之间的交叉反应κB和β连环蛋白在细胞核中。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和Chondrogenic分化

Sprague-Dawley (SD)雄性老鼠bmsc买来Cyagen生物科学(rasmx - 01001), DMEM / F12培养基培养(博士德,PYG0084)含10%胎牛血清(Gibico, 10100147)在37°C公司为5%2在湿润孵化器。bmsc根据通常的方法是通过当他们汇合的90%,第三段是用于实验。约 bmsc被转移到15毫升反应管和离心5分钟在室温下的150克。在孵化后0.5毫升chondrogenic分化培养基(清洁发展机制;Cyagen生物科学,raxmx - 90041)在37°C公司为5%224小时的球有一个圆的形态和漂浮在媒介。然后根据以往的研究,颗粒与10 ng / mL il - 1刺激β(211 - 11 - b) PeproTech 10 nM GSK-3β(创意BioMart 2728 r), 10毫米氯化锂(Sigma-Aldrich L9650),和/或15μM SN50 (MedChemExpress HY-P0151) [13- - - - - -16]。CDM是仔细每2 - 3天更换一次。3周后,球被收集和chondrogenic分化评估。此外,bmsc的种子 细胞每在6-well盘子。孵化后24 h,媒介是改变CDM, bmsc刺激在同一方案。3天,伴着收获来检测细胞凋亡,探讨机制。

2.2。Chondrogenic颗粒的组织学分析

丸是用PBS洗净,与4%多聚甲醛固定3小时准备石蜡包埋。然后球固定在石蜡块和3μ米得到了部分使用切片机。阿尔新蓝染色,部分被孵化1%阿尔新蓝溶液30分钟。immunofluorescent染色,部分孵化驴10%血清后30分钟脱蜡和抗原检索。然后部分与anti-Col孵化2抗体(圣克鲁斯生物技术、sc - 52658, 1: 50)一夜之间在4°C。第二天,部分是孵化FITC共轭二次抗体在37°C 1 h在黑暗中。最后,部分与4孵化 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;Solarbio C0065) 5分钟,然后下可视化荧光显微镜(日本尼康)。

2.3。DMMB化验的呕吐

在实验的最后,条件培养基收集,粘多糖(GAG)量化使用dimethyl-methylene蓝色(DMMB;美国Sigma-Aldrich)测定。简单地说,对于每一个的96孔板,40岁μL与250年样品或标准不一μ在37°C L DMMB解决方案和孵化1 h。525纳米吸收测量在一个微型板块ELISA读者。插科打诨的数量计算的OD值根据硫酸软骨素(美国Sigma-Aldrich)标准曲线。

2.4。RNA提取中存在的分析

总RNA提取使用试剂盒试剂从颗粒(美国英杰公司)根据制造商的协议。逆转录执行使用上标3合成第一链cDNA工具包(美国热费希尔科学)。chondral-related Sox9基因的表达水平,胶原蛋白2,Aggrecan评估定量实时PCR与SYBR-Green主人混合(美国热费希尔科学)。GAPDH被选为一个内部控制。被归一化GAPDH基因表达水平使用 方法。表列出了引物1。

表1
引物的信息。
2.5。免疫印迹分析

总蛋白颗粒或bmsc收集。核和胞质蛋白提取工具包(Beyotime P0027)被用来从bmsc提取蛋白质。蛋白质在10% sds - page分离和转移到PVDF膜(美国微孔)。然后用5% BSA膜被封锁在室温下1 h和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。特定的乐队被发现HRP-conjugated二级抗体和可视化增强化学发光试剂盒。蛋白质的表达是规范化GAPDH(生物技术,60004 - 1 - ig)或组蛋白(Abcam ab179)使用图像实验室软件(美国Bio-Rad)。总蛋白质颗粒,主要抗体Sox9 (CST, 82630), Col 2, Aggrecan(生物技术,13880 - 1 - ap)。bmsc的总蛋白质,主要抗体伯灵顿(CST, 14796), bcl - 2 (Abcam ab196495),生存素(CST, 2808),半胱天冬酶9 (CST, 9508),裂解半胱天冬酶9 (CST, 9507),半胱天冬酶3 (CST, 9662),裂解半胱天冬酶3 (CST, 9661)、IKKβp-IKK (CST, 8943)α/β-Ser176 / Ser180 (CST, 2697)κBα(春秋国旅,9242)》κBα-Ser32 (CST, 2859), NF -κB p65 (CST, 8242), p-NF -κB p65 (CST, 3033),β连环蛋白(CST, 8480), p -β连环蛋白(CST, 4176), GSK-3β(春秋国旅,12456),p-GSK-3β(春秋国旅,5558)。从bmsc核和胞质蛋白,主要抗体NF -κB p65和β连环蛋白。

2.6。细胞凋亡的评估

bmsc的凋亡率是决定使用流式细胞仪(FCM)分析了膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包(美国BD生物科学)。伴着收获和resuspended在500年μL绑定缓冲和沾染了5μL FITC膜联蛋白V和5μL propidium碘(π)。孵化后15分钟,样本测试使用流式细胞分析仪(美国BD生物科学)。对于每个FCM分析,10000事件被记录。膜联蛋白V + /π-和膜联蛋白V + / PI +细胞凋亡细胞被认为是早期和晚期阶段。

TUNEL染色法进行综合培养12-well板使用一步TUNEL检测组件上(Beyotime,中国)。根据制造商的指示,样本用PBS和4%多聚甲醛固定30分钟。然后用50个样本孵化μL TUNEL检测液体为60分钟37°C在黑暗中。最后,原子核与DAPI染色,荧光显微镜下样本可视化。

2.7。免疫荧光

伴着收获和resuspended PBS。暂停抹载玻片,是干的。细胞与4%多聚甲醛固定,permeabilized tritonx - 100, 0.1%和3% BSA阻塞。此后,细胞培养中的主要抗体阻断缓冲NF -κB p65和β一夜之间连环蛋白在4°C。第二天,细胞被孵化和FITC共轭TRITC共轭二次抗体在37°C 1 h在黑暗中。最后,细胞与DAPI染色和激光共焦显微镜下可视化(奥林巴斯、日本)。

2.8。统计分析

实验组都独立进行生物一式三份。数据了 (SD)。统计分析使用GraphPad棱镜8(美国GraphPad软件)。学生的 - - - - - -测试是用来评估两组之间的差异。单向方差分析被用来评估多个组之间的差异。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Chondrogenic分化的bmsc il - 1β全身炎症微环境

bmsc形成颗粒,在CDM 21天培养。建立一个炎症微环境,il - 1β从第一天被添加到清洁发展机制。il - 1的阿尔新蓝染色强度β组低于对照组(数字1(一)和1 (b))。条件培养基和呕吐量也减少il - 1β组(图1 (c))。此外,il - 1β显著减少的表达Sox9、胶原蛋白2 (Col 2 a), Aggrecan基因和蛋白质水平(数字1 (d)- - - - - -1 (f))。

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图1
Chondrogenic分化的bmsc il - 1β全身炎性微环境。(a)和(b)代表图像和阿尔新蓝染色强度量化。(c)培养基的恶作剧的内容。Sox9的表达水平,胶原蛋白2和Aggrecan检测到存在(d)和免疫印迹(e)和(f),所有的结果都表示为 ( )。NS:不重要, 和 。 μm。
3.2。GSK-3βil - 1的扰乱新陈代谢的平衡β受损的bmsc

免疫荧光染色显示,相比之下,il - 1β2组,胶原蛋白的表达是GSK-3下降β+ il - 1β组,而在氯化锂+ il - 1显著增加β组(图2(一个))。与对照组相比,呕吐量条件中被GSK-3没有改变β单独或氯化锂,GSK-3β增强和il - 1β全身的呕吐量下降,而氯化锂逆转这一趋势(图2 (b))。因此,的表达Sox9, Col 2, Aggrecan GSK-3明显减少β+ il - 1β组il - 1β集团在基因和蛋白水平(数字2 (c)- - - - - -2 (e))。

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图2
GSK-3βil - 1的扰乱新陈代谢的平衡β受损的伴。(一)代表2胶原蛋白免疫荧光图像。(b)培养基的恶作剧的内容。(c)表达水平的Sox9、c和Aggrecan检测到存在(c)和免疫印迹(d)和(e),所有的结果都表示为 ( )。NS:不重要的和 。 μm。
3.3。GSK-3β促进细胞凋亡的il - 1β受损的bmsc

免疫印迹分析被用来检测伯灵顿的表达,bcl - 2,和生存素(数据3(一个)和3 (b))。我们发现GSK-3β或氯化锂对这些蛋白的表达没有明显的影响(尽管氯化锂降低伯灵顿的表情,没有统计学意义),和il - 1β增加了伯灵顿bcl - 2表达和抑制和存活素表达。与此同时,与GSK-3 cointerventionβ这些趋势增强,而氯化锂逆转。同时,半胱天冬酶的表达,裂解半胱天冬酶9日半胱天冬酶3和裂解半胱天冬酶3也发现,结果是一致的(数据3 (c)和3 (d))。此外,流动仪分析(数据3 (e)和3 (f))和TUNEL染色(图3 (g))进行评估凋亡细胞的数量。il - 1β显著增加了细胞凋亡与对照组相比,添加GSK-3β加剧了这一效应,而氯化锂逆转它。

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图3
GSK-3β促进细胞凋亡的il - 1β受损的伴。(一)——(d) 9半胱天冬酶的表达水平,裂解半胱天冬酶9日半胱天冬酶3,裂解半胱天冬酶3,伯灵顿、bcl - 2,和生存素被免疫印迹检测。流仪分析(e)和(f)和TUNEL染色法(g)进行评估凋亡细胞的数量。所有的结果都表示为 ( )。NS:不重要, 。 μm。
3.4。GSK-3β调节NF -κB和Wnt /β连环蛋白信号通路在il - 1β全身炎症反应

探讨可能的分子机制,我们调查了NF -κB和Wnt /β在bmsc连环蛋白信号通路。在这项研究中,il - 1β大大刺激了IKK的磷酸化α/β,我κBα和NF -κB p65,增强GSK-3之外的β。有趣的是,只有NF -κB磷酸化逆转了氯化锂(数字4(一)和4 (b))。此外,我们发现GSK-3的磷酸化β显著增加了氯化锂+ il - 1β组。并与il - 1组的磷酸化βGSK-3连环蛋白增加β+ il - 1β组在减少氯化锂+ il - 1β集团(数据5(一个)- - - - - -5 (d))。

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图4
GSK-3β调节NF -κ在il - 1 B信号通路β全身的炎症。磷酸化和/或总IKK的表情β、IKKα/β,我κBα和NF -κB p65 (a)和(B)被免疫印迹检测。可视化和定量表达的胞质(c)和(d)和核(e)和(f) NF -κB p65。所有的结果都表示为 ( )。NS:不重要, ,和 。
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图5
GSK-3β调节Wnt /β连环蛋白信号通路在il - 1β全身的炎症。磷酸化和总GSK-3的表情β(a)和(b)β连环蛋白(c)和免疫印迹(d)进行检测。(e) - (h)可视化和量化的核的表达β连环蛋白。所有的结果都表示为 ( )。NS:不重要, ,和 。
3.5。GSK-3β介导NF -之间的交叉反应κB和β连环蛋白在细胞核中

此外,NF -的表达κB和β连环蛋白在细胞质和细胞核被检测到。il - 1β增加了NF -κB在细胞核表达,GSK-3β增强了这一趋势,而氯化锂和SN50逆转它(数据4 (c)- - - - - -4 (f))。与此同时,il - 1β减少β连环蛋白在细胞核中表达,GSK-3β这一趋势增强,而氯化锂逆转它(数据5 (e)和5 (f))。新,与SN50 cointervention后,特定抑制剂的NF -κB易位,β连环蛋白在细胞核中表达显著增加(数据5 (g)和5 (h))。与此同时,免疫荧光(图6)。结果表明,GSK-3β促进了il - 1β全身核易位NF -κB p65,氯化锂和SN50减少它。和il - 1β组和GSK-3β+ il - 1β集团绿色荧光信号(β连环蛋白)可以清楚地观察到细胞质中,但在细胞核几乎没有信号。然而,在氯化锂+ il - 1β集团SN50 + il - 1β组和SN50 + GSK-3β+ il - 1β集团在细胞质中绿色荧光信号明显减少,只有轻微的信号在细胞核。

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(b)
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图6
GSK-3β介导NF -之间的交叉反应κB和β连环蛋白在细胞核中。采用免疫荧光观察NF -的分布κB p65(红色)β连环蛋白(绿色)。细胞核是DAPI-stained(蓝色)。三个独立重复实验,代表图像显示。 μm。

4所示。讨论

骨髓间充质干细胞可以被诱导分化成软骨细胞在一定条件下,具有潜在的应用价值在软骨疾病的治疗17]。与之前的研究结果相一致,表明il - 1β抑制bmsc的软骨形成能力和软骨基质合成能力以及细胞凋亡bmsc软骨形成过程中(13,17- - - - - -20.]。它已经表明,GSK-3β广泛参与葡萄糖代谢的调节,细胞增殖、分化、迁移和细胞凋亡21- - - - - -25和在chondrogenic分化中扮演着重要角色26]。在这项研究中,我们发现GSK-3β加剧了被il - 1的影响β氯化锂刺激,可以逆转。

我们进一步研究了GSK-3的分子机制β在炎症微环境影响成软骨细胞分化和细胞凋亡。先前的研究已经证实GSK-3的参与β监管的NF -κB激活(7,8]。因此,NF -的监管κ由GSK-3 B信号通路β第一次被检测到。这是发现GSK-3β可以激活NF -κB信号通路,只有NF -κB磷酸化被氯化锂逆转。同样,施瓦贝和布伦纳报道,治疗肿瘤坏死因子-α刺激细胞与氯化锂导致减少的NF -κB-dependent基因转录,但并不影响我κBα退化或IKK活动(27]。与此同时,在我们的研究中,GSK-3β促进核易位NF -κB p65 GSK-3减毒的抑制作用β活动(氯化锂)或NF -κB易位抑制剂(SN50)。

大量的研究表明,Wnt /β连环蛋白信号通路中起着至关重要的作用在调节细胞增殖和分化28- - - - - -31日],GSK-3β的关键调节器Wnt /β连环蛋白信号通路(30.]。接下来,我们检查GSK-3的规定βWnt /β连环蛋白信号通路。正如所料,GSK-3β的磷酸化调节β连环蛋白,而氯化锂抑制GSK-3的活动β因此表达下调的磷酸化β连环蛋白。此外,我们发现的表达β连环蛋白在细胞核,发现GSK-3后显著降低β刺激。这可能是由于磷酸化β连环蛋白降解,从而减少核易位(32]。重要的是,的表达β连环蛋白在细胞核增加核易位NF -κB p65被SN50专门抑制,表明NF -之间的交叉反应κB和β连环蛋白在细胞核中。

总之,我们的研究证实GSK-3的角色β在chondrogenic分化的bmsc IL 1β全身炎性微环境。此外,我们的研究提供了一个新的见解GSK-3的分子机制β通过NF -调节软骨形成κB和Wnt /β连环蛋白信号通路,介导NF -之间的交叉反应κB和β连环蛋白在细胞核(图7)。


图7
原理图的机制。GSK-3β通过NF -调节软骨形成κB信号和Wnt /β连环蛋白信号并可能介导NF -之间的交叉反应κB和β连环蛋白在细胞核中。

数据可用性

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章;进一步询问可以针对相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Zhenggang王贡献与数据管理(领导),正式的分析(平等),调查(铅)、方法(平等)、可视化(平等),写作初稿(平等),writing-review和编辑(平等)。一度陷入他的贡献与数据管理(平等),正式的分析(平等),调查(平等)、方法(铅),writing-review和编辑(平等)。Weikai张贡献与形式分析(平等),调查(平等)和方法(支持)。双梁贡献与数据管理(平等)和方法(平等)。库恩陈贡献与形式分析(平等),writing-review和编辑(平等)。Shimeng徐贡献的方法(平等)和验证(平等)。张应贡献与监督(铅),融资收购(平等)、项目管理(平等),writing-review和编辑(平等)。彭程贡献与概念化(铅),融资收购(铅)、项目管理(领导),writing-review和编辑(平等)。Zhenggang王他一度陷入了同样工作和分享第一作者。

确认

这项研究是由中国湖北省自然科学基金(批准号2020 cfb216)和中国国家自然科学基金(批准号81800611)。