文摘
的治疗作用间充质干细胞(MSC)派生细胞外囊泡(EVs)软骨再生的研究。在此,我们试图分析的角色人脐带MSC - (hUCMSC)电动汽车携带微(miR -) 181 c-5p软骨损伤的修复。隔离hUCMSCs成功之后,多向分化能力进行了分析。然后,电动车被隔离和标识。coculture后PKH26-labled EVs和骨髓msc (bmsc)的生物学行为检测。之间的关系预测创伤后早期osteoarthritis-associated microrna, mir - 181 - c - 5 - p,和SMAD7验证。获得和损失函数进行投资的角色mir - 181 - c - 5 - p和SMAD7 BMP-induced软骨形成在体外和在活的有机体内。可以内化hUCMSC-EVs bmsc,促进增殖、迁移,chondrogenic bmsc的分化潜能。此外,mir - 181 - c - 5 - p可能目标和抑制SMAD7表达促进骨形态发生蛋白2 - (BMP2)诱导增殖,迁移,chondrogenic bmsc的分化潜能。同时,SMAD7抑制BMP2的修复效果的过度表达,和超表达BMP2和mir - 181 - c - 5 - p进一步促进软骨损伤的修复在活的有机体内。我们目前的研究强调了修复效果hUCMSC-EVs携带mir - 181 - c - 5 - p软骨损伤。
1。介绍
软骨,一种结缔组织,充当缓冲压力和保护关节运动中发挥了重要作用;然而,软骨损伤后很难自我恢复由于缺少神经组织和血管(1]。此外,位于膝关节的透明软骨的特点是弹性和僵硬,增加更多的挑战在软骨损伤的修复2]。最近,一个内生再生策略,同时促进软骨细胞的招募和骨髓间充质干细胞(bmsc),是软骨再生的重视3]。
脐带间充质干细胞(UCMSCs)已被证明是有效的骨再生的因为他们的优势容易收集,良好的分化能力,低免疫原性(4,5]。有趣的是,细胞外囊泡(EVs)源自人类UCMSCs被广泛用作治疗方法在治疗不同的疾病包括神经系统、心血管、骨骼、皮肤的伤口,和软骨疾病(6]。更重要的是,hUCMSC-derived EVs (hUCMSC-EVs)携带小分子核糖核酸(microrna)可能是一个令人鼓舞的治疗策略hUCMSC-EVs疾病治疗的临床应用7]。之前记录,mir - 181 c hUCMSC-EVs[中高度表达8]。此外,mir - 181 - c参与治疗骨关节炎关节软骨的损伤特征(9]。Smad7发现的直接目标基因mir - 181 - a和mir - 181 b在神经炎症10]。然而,SMAD7在修复软骨损伤的作用正在调查中。Downregulation SMAD7促进骨形成蛋白2 - (BMP2)诱导软骨形成(11]。BMP2诱导软骨分化是一个关键因素,可以促进chondrogenic分化的干细胞(12]。BMP2也是一个强有力的负责bmsc的成骨细胞分化的诱导物(13]。鉴于上述证据,本研究旨在修复软骨损伤进行深入调查和评估hUCMSC-EVs的作用及其在这一过程中潜在的分子机制。
2。材料和方法
2.1。生物信息学分析
创伤后早期osteoarthritis-associated microrna的微阵列数据集GSE99736获得基因表达与前滑膜地区综合数据库样本1周后虚假的操作(控制; )虚假的操作(和6周后恢复; )选中。分析了两组差异表达的microrna利用R语言“limma”包 和 作为标准,其次是建设热地图的帮助下R语言“pH&Eatmap”包。
microrna的靶基因预测的母星,TargetScan PicTar, microT。候选基因和疾病之间的相关性进行了分析通过PH&Enolyzer工具。通过CAdxpedia Coexpression基因之间的关系进行了分析,分析了蛋白质交互(PPI)网络利用数据库的字符串,这是可视化的帮助下Cytoscape 3.5.1软件。
2.2。细胞培养
HEK293细胞和人类bmsc从美国购买类型文化集合(写明ATCC)细胞库(美国马纳萨斯)和在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(美国UT DMEM HyClone,洛根)与10%胎牛血清(补充的边后卫;Gibco,沃尔瑟姆,妈,美国),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(Gibco) 37°C, 5%的公司2和饱和湿度。
2.3。隔离、文化和hUCMSCs的识别
这项研究是伦理委员会的批准,浙江大学医学院附属第二医院,和知情同意之前所有参与者提供的样本集合。隔离和hUCMSCs文化,人类脐带样本( )是获得健康的母亲分娩后和加工后6 h内集合。脐带是第一次洗两次磷酸缓冲盐(PBS)补充青霉素和链霉素去除血液。冲洗脐带被切成3 - 4厘米段培养皿、培养在DMEM / F-12 (Gibco)补充10%的边后卫(Gibco), 1% GlutaMAX (Gibco), 100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(Gibco) 37°C公司为5%272 h。之后,在超培养基培养细胞(Lonza、12 - 725 F、瑞士)补充血清模拟Ultroser™G(259509年,生命科学,新布伦瑞克,新泽西州,美国)。随后,一半的媒介是每三天,重新和脐带组织被移除后的纤维母细胞集落。细胞分离与胰蛋白酶和通道,直到80 - 90%融合。早期通过hUCMSCs(通道2到6)被用于后续的实验。
hUCMSCs表面标记的识别, 细胞孵化主要抗体(所有从BD,富兰克林湖,新泽西,美国):PE反CD44 (1: 100、550989), PE反CD151 (1: 100、556057), PE反CD73 (1: 100、550257), APC反CD133(1: 100、566596),又PE反CD34(1: 100、560710)在4°C 30分钟。PBS洗涤后,细胞被孵化与特定的二级抗体30分钟(黑暗条件),其次是分析细胞表面标记表达式利用FACScan流流动系统(圣地亚哥,正欲、钙、美国)。
hUCMSCs检测分化能力,hUCMSCs在成骨细胞培养介质(huxuc - 90021;美国Cyagen,圣克拉拉,CA) 14天或在脂肪生成的介质(huxuc - 90031;Cyagen) 21天或chondrogenic分化培养基(huxuc - 9004;Cyagen) 21天。随后,分化的细胞被固定在4%多聚甲醛,在PBS洗一次,然后利用碱性磷酸酶染色茜素红(高山)和2% (A5533 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)来识别hUCMSCs成骨分化。油红O (O0625 Sigma-Aldrich)染色进行识别脂肪形成的分化潜能,而1%的阿尔新(A5268 Sigma-Aldrich)解决方案检测chondrogenic分化潜能。
hUCMSCs对待二甲亚砜(DMSO)应用控制,和鞘磷脂酶抑制剂GW4869 (10μM,σ)添加到实验组,分别培养24小时。24小时后,条件培养液(CM)和综合培养。细胞分为控制、hUCMSC-CM hUCMSC-GW4869-CM组。
2.4。细胞转导
细胞被播种到six-well板块和转导的质粒mir - 181 - c - 5 - p模仿,模仿负控制(数控),mir - 181 - c - 5 - p抑制剂,或抑制剂数控(50 nM;通过Lipofectamine GenePharma、上海、中国)2000。包装混合转导到细胞,收集48 h后转导。证实了超表达或可拆卸的效率逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。
2.5。隔离和hUCMSC-EVs的识别
hUCMSCs培养在超媒体(EV-free)补充10%的边后卫(Lonza, 12 - 725 F) 72 h。电动汽车被上层清液的收集和净化厘米。72 h后,上层清液在300 g离心10分钟,10分钟,2000克和10000克为30分钟,分别在4°C。接下来,上层清液离心机在100000 g 70分钟在4°C的超离心机(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。上层清液被丢弃,沉淀resuspended 1毫升的PBS。70分钟在100000 g离心后,上清液丢弃,沉淀在prechilled resuspended PBS获得电动汽车。
EVs获得被观察到100 KeV下透射电子显微镜(TEM) (HT7830、日立、东京、日本)。此外,粒度和浓度的电动汽车被量化利用纳米粒子跟踪分析(NTA)通过NanoSight LM10仪器(NanoSight有限公司明顿公园,英国) 60年代。
2.6。吸收hUCMSC-EVs
200年孤立hUCMSC-EVs停牌μL(预冷PBS和孵化红色荧光染料PKH26 (4μmol / L, MINI26-1KT Sigma-Aldrich)在环境温度为5分钟。接下来,hUCMSC-EVs孵化了bmsc在37°C 24 h和4%多聚甲醛固定。细胞骨架是沾微丝绿色荧光探针(C1033 Beyotime,中国上海)30分钟,和核沾染了10μ33342克/毫升的赫斯特(C1025 Beyotime) 10分钟。EVs的吸收是一个共焦激光扫描显微镜下观察(德国蔡司LSM710),有5个随机领域的观点为每个样本。
2.7。Cy3荧光标记
hUCMSCs分离用0.25%胰蛋白酶(GIBCO)然后resuspended超中补充的边后卫调整细胞浓度10% 细胞/。Cy3-labeled mir - 181 - c - 5 - p (mir - 181 - c - 5 - p - cy3)从GenePharma采购和转染hUCMSCs根据Lipofectamine 2000(11668 019,英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA,美国)指令。hUCMSCs表达cy3 - mir - 181 - c - 5 - p被播种到6-well板块和cocultured bmsc Transwell室4 d。之后,bmsc的核沾染了10μ33342克/毫升的赫斯特(C1025 Beyotime)。最后,荧光共焦显微镜下观察表达。
2.8。构建重组腺病毒
重组腺病毒的帮助下构建AdEasy重组腺病毒技术。BMP2的编码区和SMAD7以及成绩单mir - 181 - c - 5 p是放大利用高保真PCR和克隆到一个腺病毒穿梭载体(Ad-GFP HanBio,中国上海)携带绿色荧光蛋白,也就是说,Ad-BMP2, Ad-SMAD7,和广告- mir - 181 - c - 5 - p,分别。向量是采用代重组腺病毒在HEK293细胞中,以Ad-GFP为控制。聚凝胺(tr - 1003 g, 4 - 8μg / mL;σ)是提高转染效率。
2.9。细胞计数Kit-8 (CCK8)测定
bmsc的增殖能力评估采用CCK8工具包(美国K1018, Apexbio,波士顿,MA)。细胞被播种到96 -文化板块( 细胞/),每增加了100μL中补充10%的边后卫。孵化后表示,10μL CCK8的解决方案是添加到每个在37°C和孵化4 h。孵化后,光密度值(OD)被量化为450 nm和细胞生长曲线构造的OD值在第一天,第二天,第三天。五个平行井准备每个实验。
2.10。Transwell迁移分析
总共 细胞无血清培养系统中被添加到顶端Transwell室(BD猎鹰,富兰克林湖,新泽西,美国),和基底外侧室被加入DMEM补充的边后卫(600 10%μ为孵化8 h L) 37°C。顶端的细胞室被移除,剩下的细胞表面的Transwell底部固定利用4%多聚甲醛。与0.2%结晶紫染色后15分钟,阳性细胞一个倒置光学显微镜下观察(CarlZeiss、德国)和拍照,随后利用ImageJ计算软件。
2.11。Dual-Luciferase报告基因分析
目标结合位点的SMAD7 mir - 181 - c - 5 - p是插入到dual-luciferase报告基因向量pGL3子向量(WI Promega,麦迪逊,美国),其次是准备SMAD7结合位点的突变向量序列的帮助下一个点突变工具包(豆类、日本),即PmirGLO-SMAD7-WT PmirGLO-SMAD7-MUT。记者质粒是cotransfected mir - 181 - c - 5 p模拟及其数控293 t细胞48 h。后来,荧光素酶的活动是量化利用Dual-Luciferase®记者分析系统(E1910 Promega)。
2.12。RT-qPCR
试剂盒(没有。16096020,热费希尔科学、美国纽约)是采用总RNA提取。互补DNA(互补)是相对地转录利用RT工具包(RR047A、豆类、日本),信使rna的检测。检测microrna的水平,RT的帮助下获得的互补脱氧核糖核酸是PrimeScript™microrna RT-qPCR工具包(B532451, Sangon生物科技、上海、中国)。SYBR®绿色(DRR081、豆类、日本)试剂用于加载、和样本受到RT-qPCR实时荧光定量PCR仪(ABI 7500, ABI,促进城市、钙、美国)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为标准化者mRNA而U6 microrna。用于扩增的引物是由一般生物技术(上海,中国)。引物序列补充表中列出1。相对目标基因的转录水平的计算方法。
2.13。免疫印迹
电池和电动汽车是细胞溶解在电台免疫沉淀反应分析裂解缓冲(P0013B Beyotime)。蛋白质浓度测定处理利用bicinchoninic酸测定工具包(IL A53226热费希尔科学,罗克福德,美国)。蛋白质是由钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和转移到聚乙二烯二氟化物膜(IPVH85R、微孔、德国)。膜被封锁的环境温度在5%牛血清白蛋白和1 h孵化与BMP2的主要抗体(Abcam ab14933, 1: 1000年,英国),SMAD7 (sc - 365846, 1: 1000年,圣克鲁斯,CA,美国),胶原蛋白II (ab34712, 1: 5000年,Abcam) aggrecan (ab3778, 1: 1000年,Abcam) Sox9 (ab185966 1/1000 Abcam), CD9 (ab236630, 1: 1000年,Abcam)、CD63 (ab134045, 1: 1000年,Abcam)的研究(ab79559, 1: 1000年,Abcam) GAPDH (ab181602, 1: 5000年,Abcam)β肌动蛋白(ab8226 1: 5000年,Abcam)一夜之间在4°C。膜被孵化的辣根peroxide-labeled山羊anti-mouse二级抗体(ab6808;1:2000;Abcam)或山羊anti-rabbit二级抗体(1:5000年,ab6721 Abcam) 1 h在环境温度。增强化学发光工作解决方案(微孔)的发展应用。每组乐队的灰度量化蛋白质印迹图像处理利用ImageJ分析软件。β肌动蛋白是作为电动汽车标准化者识别和GAPDH休息。
2.14。异位软骨形成在一个小鼠模型
动物协议是由动物伦理委员会批准,浙江大学医学院附属第二医院。无胸腺的裸小鼠(ν/ν)(4 - 6周大;雌性)采购从线性生物技术(上海,中国)。老鼠接受adenovirus-infected bmsc异常表达BMP2 SAMD7,和/或mir - 181 - c - 5 - p,每24小时( )。此外,共聚物聚乙二醇citrate-co-N-isopropylacrylamide (PPCNg)合成,PPCN粉溶解在PBS(100毫克/毫升)和消毒过滤通过0.22μm过滤器。bmsc ( )与100年resuspendedμL PPCNg解决方案。细胞悬液(皮下注射 / 100μL)的腹侧老鼠,三次鼠标。
4周后小鼠皮下注射的小鼠安乐死和异位组织块从注射部位被移除,紧随其后的是图像通过microcomputed断层扫描和x射线成像在45 KV和500 mA。然后准备到石蜡包埋组织部分为后续实验。
2.15。苏木精和伊红染色())
石蜡包埋的部分是脱蜡、水化、固定在环境温度30年代,60年代,然后用苏木精染色,其次是分化与1%盐酸酒精3 s。部分与伊红染色3分钟和密封胶,紧随其后的是形态结构的观察膝关节的软骨组织在显微镜下(BX63、奥林巴斯、日本)。
2.16。阿尔新蓝染色
脱蜡和补水后,石蜡包埋部分与0.1 N盐酸酸化5分钟。然后沉浸在阿尔新蓝染色的部分解决方案(B8438σ)10分钟,其次是2洗利用0.1 N盐酸溶液各1分钟。然后,部分密封胶和风干。软骨组织的形态结构的光学显微镜下观察膝关节。
2.17。免疫组织化学染色(包含IHC)
小鼠软骨组织部分被烤20分钟60°C,在二甲苯中浸泡15分钟,用乙醇脱水的100%,95%,90%,85%,和80%,重蒸馏的水清洗几次。的部分浸在3% H2O2在环境温度为10分钟阻断内源性过氧化物酶和受到抗原检索。密封后与正常山羊血清屏蔽解决方案(Sangon生物技术)20分钟,一夜之间,部分被探测的主要抗体胶原蛋白II (Abcam ab34712, 1: 50), aggrecan (13880 - 1 - ap 1: 200年,Proteintech,武汉,中国),和Sox9 (ab185966 1: 1000年,Abcam)在黑暗中。接下来,部分与二级抗体reprobed山羊anti-rabbit免疫球蛋白(ab6721 1: 1000年,Abcam) 30分钟,其次是孵化与南非广播公司(向量解决方案,Inc .)、美国)37°C为30分钟。开发的部分被轻拍(P0203 Beyotime) 6分钟。30年代的部分与苏木精染色,与梯度乙醇脱水的70%,80%,90%,和95%乙醇和绝对2分钟,分别与二甲苯清除,用中性树脂安装,在显微镜下观察(BX63,奥林巴斯)。
2.18。统计分析
SPSS 21.0软件(美国、IBM、纽约Armonk)是数据分析处理。测量数据的形式描述 来自至少3独立研究。未配对的 - - - - - -测试申请了两组之间的比较,和单向方差分析(方差分析)与图基的事后测试多个组之间的比较。双向方差分析的数据进行比较在不同的时间点。 显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。hUCMSC-EVs bmsc可内化
分析影响hUCMSC-EVs bmsc的生物功能,我们第一次分离和培养hUCMSCs,显微观察表明hUCMSCs呈纺锤状形态(补充图展出1)。同时,hUCMSCs高度CD151表达积极的标记,CD73, CD44和低表达负面标记CD34和CD133(补充图1 b)。进一步,我们发现孤立hUCMSCs能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞(补充数据1 c-1g)。RT-qPCR透露osteogenic-related表达升高因素RUNX2 osterix, chondrogenic-related因素Sox9 COL2, PPAR - adipogenetic-related因素γ在不同的CM(补充图1 h)。这些发现支持,hUCMSCs被成功提取。
随后,我们从hUCMSCs使用超速离心法分离出的电动汽车。在透射电镜下,hUCMSC-EVs展出一个圆形或椭圆膜vesicle-like形态(图1(一))。EVs的直径大约是50 - 150纳米(图1 (b))。此外,在hUCMSC-EVs,电动汽车的水平表面标记CD9、研究和CD63显著增加,而β肌动蛋白不表达(图1 (c))。上述结果证实hUCMSC-EVs的成功隔离。
(一)
(b)
(c)
(d)
接下来,bmsc与PKH26孵化——(红色)标记hUCMSC-EVs和电动汽车的hUCMSCs 24小时后在显微镜下观察。红色荧光观察bmsc(图1 (d))。上述结果表明,bmsc hUCMSC-EVs吸收。
3.2。hUCMSC-EVs促进增殖、迁移和软骨bmsc的分化能力
分析电动汽车的影响从hUCMSCs软骨损伤的修复,我们对待hUCMSCs GW4869 24 h和孵化bmsc与上层清液从CM。与CM coincubation之后,bmsc的增殖和迁移能力得到提升,而那些被镇压后进一步增加GW4869 (hUCMSC-GW4869-CM)(数据2(一个)和2 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
bmsc的chondrogenic能力进一步增强与CM孵化后但hUCMSC-GW4869-CM孵化(图后减少2 (c))。被RT-qPCR和免疫印迹分析,cartilage-specific基因的表达胶原蛋白II, aggrecan,和Sox9显著升高bmsc coincubated厘米,而反对hUCMSC-GW4869-CM治疗后发现趋势(数据2 (d)和2 (e))。集体,可以内化hUCMSC-EVs bmsc促进扩散、迁移,和软骨分化bmsc的能力。
3.3。hUCMSC-EVs交付mir - 181 - c - 5 - p BMSC促进BMSC扩散、迁移,和软骨分化
的分子机制hUCMSC-EVs促进软骨损伤的修复是我们的下一个焦点。微分分析微阵列数据集GSE99736产生93差异表达microrna的热图和最小的前30名microrna的表达值绘制(图3(一个))。microrna高度表达的复苏组mir - 101 c, mir - 101 - a - 3 - p, miR-29c-3p, mir - 195 a - 5 - p, miR-30a-5p, let-7b-5p, miR-23b-3p, miR-26b-5p, mir - 181 - c - 5 - p,和mir - 3473 e。先前的证据指出,高架mir - 181 - c - 5 - p在hUCMSC-EVs [8]。因此,我们决定进一步分析的角色mir - 181 - c - 5 - p在软骨损伤的修复。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
正如所料,mir - 181 - c - 5 - p在hUCMSC-EVs高架RT-qPCR(图3 (b))。hUCMSC-EVs coincubation之后,高架mir - 181 - c - 5 - p表达式bmsc(图中发现3 (c))。bmsc与hUCMSCs coincubated表达cy3 - mir - 181 - c - 5 - p,我们发现bmsc显示红色荧光,表明Cy3-labeled mir - 181 - c - p被bmsc内化(图5 -3 (d))。因此,hucmsc evs - mir - 181 c - 5 p可以通过bmsc内化。
分析的影响hucmsc - ev - mir - 181 - c - 5 p在软骨损伤的修复,EVs提取mir - 181 - c - 5的差别后,对这些基因在hUCMSCs - p。RT-qPCR展出下降mir - 181 - c - 5 - p在hUCMSC-EVs(图表达3 (e))。此外,mir - 181 - c - 5 - p在bmsc表达下调与电动车从hUCMSCs转导coincubated mir - 181 - c - p抑制剂(图5 -3 (f))。此外,抑制mir - 181 - c - 5 - p在EVs抑制增殖,迁移,bmsc chondrogenic能力(数据3 (g)- - - - - -3(我))。功能丧失,mir - 181 - c - 5 - p EVs进一步减少胶原蛋白的表达II, aggrecan, Sox9 bmsc(数字3 (j)和3 (k))。
这些发现公布,hUCMSC-EVs交付mir - 181 - c - 5 p bmsc,进而促进了增殖,迁移,软骨分化bmsc的潜力。
3.4。mir - 181 - c - 5 - p抑制SMAD7 bmsc的表达式
进一步了解的机制mir - 181 - c - 5 - p hUCMSC-EVs影响bmsc,我们使用了microrna的目标基因预测工具母星,TargetScan, PicTar,和microT预测的目标基因mir - 181 - c - 5 - p,分别取得了2205年,1001年,337年,和1300年的目标基因mir - 181 - c - 5 - p,分别。十字路口后,收集126个候选靶基因(图4(一))。候选靶基因和软骨之间的相关性进行了分析通过使用PH&Enolyzer工具(图4 (b)),20个基因包括MAPK1 AKT3, SMAD7被发现有高分数据相关成绩的排名。coexpression关系的进一步分析显示,有coexpression包括SMAD7(图9基因之间的关系4 (c))。的差别如前所报道,对这些SMAD7促进BMP2-induced软骨形成(11]。因此,可以推测,mir - 181 - c - 5 - p可能抑制SMAD7影响BMP2-induced软骨形成。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
的结合位点mir - 181 - c - 5 - p和SMAD7随后被预测的TargetScan数据库(图4 (d)),这进一步验证了荧光素酶测定的荧光素酶活性显著抑制细胞cotransfected mir - 181 - c - 5 p模仿和SMAD7 3 - - - - - -UTR WT,观察无显著差异的cotransfection mir - 181 - c - 5 - p模仿和SMAD7 3 - - - - - -UTR狗(图4 (e))。此外,SMAD7表达bmsc后显著降低过度的mir - 181 - c - 5 - p,而丧失mir - 181 - c - 5 - p带来相反的趋势(数据4 (f)和4 (g))。
获得的数据表明,mir - 181 - c - 5 - p可能目标3 - - - - - -UTR区域的bmsc SMAD7基因和抑制SMAD7表达式。
3.5。mir - 181 - c - 5 - p抑制BMP2-Induced SMAD7 bmsc的表达式
接下来,mir - 181的监管机制- c - 5 - p BMP2-induced SMAD7调查。腺病毒感染的bmsc overexpressing BMP2(绿色荧光),这表明,伴着强绿色荧光表达和显著升高BMP2和SMAD7(人物的表情5(一个)- - - - - -5 (c))。后广告- mir - 181 - c - 5 - p(绿色荧光)治疗,伴着强烈的绿色荧光,mir - 181 - c - 5 - p的表达明显增加,而SMAD7表达降低(图5 (d)- - - - - -5 (f))。随后,我们发现Ad-BMP2治疗促进SMAD7表达式,同时进一步广告- mir - 181 - c - 5 - p治疗抑制SAMD7表达式(图5 (g)和5 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
最终,BMP2提升SMAD7表达式,mir - 181 - c - 5 - p抑制BMP2-induced SMAD7表达式。
3.6。mir - 181 - c - 5 - p促进BMP2-Induced软骨形成通过抑制SMAD7 bmsc的表达式
接下来,我们检查的影响mir - 181 - c - 5 - p / SMAD7表情BMP2-induced软骨损伤修复使用上面构建的细胞模型。Ad-BMP2治疗后,胶原蛋白的表达II, aggrecan, Sox9显著增加,后进一步增加Ad-BMP2和广告- mir - 181 - c - 5 - p治疗(数字6(一)和6 (b))。BMSC增殖,迁移,chondrogenic能力增强后BMP2的过度表达,是进一步提高后进一步过度mir - 181 - c - 5 - p(数字6 (c)- - - - - -6 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
上述结果表明,mir - 181 - c - 5 - p可以抑制BMP2-induced SMAD7表达和移植cartilage-specific基因的表达促进增殖、迁移,chondrogenic bmsc的分化潜能。
3.7。超表达BMP2和mir - 181 - c - 5 - p促进修复软骨损伤
的在活的有机体内影响mir - 181 - c - 5 - p在软骨损伤hUCMSC-EVs也被调查。我们混合PPCN-g水凝胶与bmsc感染Ad-SAMD7或广告- mir - 181 - c - 5 - p,然后皮下注射到小鼠(图7(一))。微ct扫描观察显示,在Ad-BMP2和Ad-SAMD7治疗,观察更小体积的软骨组织。然而,在Ad-BMP2和广告- mir - 181 - c - 5 - p治疗,组织体积增加(图7 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
此外,BMP2诱导软骨形成,显著抑制SMAD7的过度。超表达mir - 181 - c - 5 p有效提升cartilage-like组织的形成和软骨细胞的数量增加,伴随着几肥厚性软骨细胞(图7 (c))。免疫组织化学还透露,胶原蛋白的表达II, aggrecan, Sox9 Ad-BMP2和Ad-SAMD7治疗后降低,而反对趋势观察后Ad-BMP2和广告- mir - 181 - c - 5 - p治疗(图7 (d))。
因此,可以得出结论,BMP2能够诱导软骨损伤的修复,而过度的SMAD7抑制BMP2的修复效果,和超表达BMP2和mir - 181 - c - 5 - p进一步促进了BMP2-induced修复软骨损伤。
4所示。讨论
hUCMSCs是多功能细胞具有自我更新属性能够分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨(14]。电动汽车被几乎所有的细胞类型,膜囊泡释放和hUCMSC-EVs承担巨大的责任在组织修复和再生15,16]。然而,这种现象的潜在机制有关的影响hUCMSC-EVs软骨损伤的修复是很少知道,这值得进一步分析和研究。在此,我们发现通过在体外和在活的有机体内化验,hUCMSC-EVs mir - 181 - c - 5 - p可能通过抑制SMAD7促进BMP2-induced修复软骨损伤。
从hUCMSCs隔离电动汽车后,我们首先确认bmsc hUCMSC-EVs的吸收。在我们的流式细胞术分析、CD151 CD73, CD44高度表达CD34和CD133表达很差。bmsc也阳性细胞表面标记CD13、CD44, CD73, CD90、CD105, CD151和消极CD34 (17]。此外,电动汽车从bmsc糖蛋白nonmelanoma对待克隆B可以被bmsc,这促进了bmsc的增殖和成骨分化(18),部分符合我们发现hUCMSC-EVs可以内化bmsc促进增殖、迁移,chondrogenic bmsc的分化潜能。此外,电动汽车从脂肪中提取msc显示最效率的软骨损伤的修复和骨再生(19]。另一项研究也表明,壳聚糖寡糖打包成大鼠脂肪MSC-derived电动汽车能促进软骨损伤修复和缓解骨关节炎(20.]。MSC-derived电动汽车可以通过调节缓解骨关节炎软骨细胞增殖,迁移和细胞凋亡21,22]。有趣的是,chondrogenic EVs拥有发展潜力在hUCMSCs加速chondrogenic分化和增殖,这可能有利于修复关节软骨的23]。这些证据支持的有利影响hUCMSC-EVs修复软骨损伤,导致我们执行功能机制研究。
此外,获得的数据表明,hUCMSC-EVs交付mir - 181 - c - 5 - p bmsc促进bmsc的软骨分化。电动汽车可以改变特定细胞的功能属性提供生物活性蛋白质和rna从原来的细胞24]。最近报道,EVs分泌调节细胞间的沟通和传递遗传信息的传递microrna [25]。同时,microrna的交付,电动汽车可以为骨关节炎临床应用治疗伴有软骨组织内稳态的损失(26]。mir - 181 c的异位表达能够限制synoviocyte的增殖和炎症因子的表达与骨关节炎的发病机制9]。此外,mir - 181 - c加速BMSC增殖和生存在氧化应激损伤(27]。然而,mir - 181 - c - 5 - p运作hUCMSC-EVs鲜为人知的是基于前面的分析。因此,我们进一步分析了下游机制mir - 181 - c - 5 - p,和SMAD7确认为其目标基因。mir - 181 - c - 5 - p是涉及胰腺家族承诺通过直接抑制SMAD7 [28]。同样,SMAD7函数作为mir - 181 c的一个重要目标基因在骨肉瘤细胞(29日]。Smad7 TGF -负监管机构β负面信号,由mir - 181 - c [30.]。此外,SMAD7也是一个细胞内的抑制剂的BMP信号,和SMAD7会影响软骨形成通过抑制BMP信号(31日]。BMP2 chondrogenic生长因子是有前途的软骨组织工程(11]。此外,BMP家族可以调节bmsc的增殖和分化影响关节软骨修复(32]。这些发现证实我们的结果,BMP2能够修复软骨的形成,而过度的SMAD7抑制BMP2的修复效果。超表达BMP2和mir - 181 - c - 5 - p进一步提升BMP2-induced软骨修复。
5。结论
总之,我们的研究表明,hUCMSC-EVs导致诱导增殖,迁移,chondrogenic bmsc的分化潜能。这种效应可能是由转移mir - 181 - c - 5 - p的bmsc抑制目标基因SMAD7表达式,最终提高BMP2-induced修复软骨损伤(图8)。此外,我们的研究结果提供新的见解bmsc和hUCMSC-EV-miRNAs之间的细胞间通讯。
数据可用性
生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
羌族,Le曹,Shanqi邹了同样工作。
补充材料
补充图1:隔离hUCMSCs和成骨的鉴定,chondrogenic, adipogenetic能力。补充表1 RT-qPCR引物。(补充材料)