胃癌间充质干细胞通过mTOR信号通路抑制NK细胞功能促进肿瘤生长

摘要

自然杀伤（NK）细胞的功能障碍在恶性肿瘤中越来越多地报道，特别是在实体瘤中。间充质干细胞（MSCs）表现出包括介导免疫细胞耗尽的抗性函数，所述免疫细胞耗尽涉及癌症进展。然而，衍生自胃癌（胃癌间充质干细胞：GCMSCs）的MSCs与NK细胞功能障碍的关联仍然明显。在这项研究中，我们证明了GCMSCs通过释放可溶性因子有效地促进了NK细胞的耗尽。此外，NK细胞中抗肿瘤效应的钝化与其功能障碍状态密切相关。GCMSC条件培养基防止了渗透在携带肿瘤小鼠模型中的NK细胞的频率和效应功能，从而促进肿瘤生长。机械地，哺乳动物雷帕霉素（MTOR）信号传导的靶标，在用GCMSCs处理的NK细胞中抑制了介导免疫细胞功能的细胞代谢的临界调节剂。然而，检查点受体PD-1仍然存在于有或没有GCMSCs的最小水平。研究结果表明，GCMSCs至少部分地涉及的功能障碍NK细胞至少部分地涉及MTOR信号传导，表明基于NK细胞的癌症免疫疗法的潜在方向。

1.介绍

胃癌(GC)是世界上第五大最常见的癌症，也是第四大癌症死亡原因[1］．尽管外科手术和其他疗法取得了重大进展，但在大多数国家，胃癌的总体5年生存率仍低于30% [2］．胃癌的发展和进展受到肿瘤和宿主免疫系统之间的相互干扰的影响[3.］．针对免疫检查点的临床试验，如PD-1/PD-L1抑制轴，已经报道了对各种肿瘤的出色结果。然而，GC的客观缓解率仅为15% [4］．因此，深入了解GC发生发展过程中免疫逃逸的潜在机制至关重要。

自然杀伤(NK)细胞是一种有效的细胞毒性天然免疫细胞，在免疫监视肿瘤细胞和病毒感染中具有既定的作用[5］．许多肿瘤类型表现出主要组织相容性复合体(MHC)丢失的高发生率或低新抗原负荷[6]，渲染肿瘤细胞难以通过CD8识别⁺T细胞。与CD8⁺T细胞，NK细胞更喜欢介导非mhc限制的杀伤肿瘤细胞，这使得它们对癌症治疗有吸引力。人类癌症研究中越来越多的证据表明，NK细胞的频率、浸润和功能可以提高患者生存率[7- - - - - -9］．一项研究表明，胃肿瘤浸润NK细胞的百分比与肿瘤大小、浸润程度、总生存率、淋巴结和远处转移以及神经浸润状态呈负相关[10.］．另一份报告显示PD-1和PD-L1封锁的有效性依赖于NK细胞的抗肿瘤活性[11.］．此外，阻断检查点受体TIGIT可防止NK细胞衰竭，并引发有效的抗肿瘤免疫[12.］．

许多研究表明，在恶性肿瘤中渗透NK细胞，特别是在实体瘤中，显示出湿润的功能并改变了表型[13.，14.］．基于NK细胞的策略治疗实体肿瘤的疗效仍不令人满意[15.，表明NK细胞活性在免疫抑制肿瘤微环境(TME)中受到了临界限制。Bian等人证明，肿瘤细胞通过与T细胞竞争蛋氨酸而在代谢上损害T细胞功能和肿瘤免疫[16.］．肿瘤及肿瘤相关细胞产生和分泌多种免疫抑制因子来抑制NK细胞的活化，包括白介素(IL)-6、IL-10、转化生长因子-β（TGF-β)和前列腺素E2 (PGE2) [17.］．另一项研究表明，TME中的乳酸和低pH降低了NK细胞的细胞毒活性，导致肿瘤杀伤能力下降[18.］．越来越多的研究表明TME通过多种机制导致肿瘤浸润NK细胞功能障碍，导致肿瘤免疫逃逸。

间充质干细胞（MSCs）是TME的关键细胞组分之一[19.］．我们之前的研究表明，来自GC组织的MSCs (GCMSCs)上调了GC细胞中的PD-L1表达，导致肿瘤逃逸[20.］．此外，MSCs具有系统性免疫调节和免疫抑制特性，并直接或通过分泌可溶性分子影响适应性和先天性免疫反应[21.- - - - - -24.］．我们确定GCMSCs表现出免疫抑制的潜力，并增加了外周血单个核细胞(PBMCs)中调节性T细胞的比例[25.］．MSCs对NK细胞的作用也引起了研究者的广泛关注。一项实验证实，来自人类肺癌的间充质干细胞可通过PGE2引起NK细胞功能障碍[26.]，骨髓源性间充质干细胞增强了NK细胞的功能，增加了穿孔素和颗粒酶的释放[27.］．这一结果提示不同组织间充质干细胞可能具有不同的调节功能。

GC间充质干细胞对NK细胞的影响尚不清楚。为了弥补这一研究空白，我们全面、严谨地探索了GCMSCs对NK细胞活性的影响。我们发现GCMSCs治疗后NK细胞的效应功能分子和对肿瘤细胞的细胞毒性显著降低。此外，小鼠皮下肿瘤中NK细胞的浸润频率和它们的功能在体内均显著降低。我们的观察为GCMSCs对肿瘤生长的反应以及它们如何间接钝化NK细胞活性提供了见解。

2。材料和方法

２.１.老鼠

NOD / SHILTJGPT-PRKDCEM26CD52IL2RGEM26CD22 / GPT（NCG小鼠;年龄：4-8周）购自南京宝石迈尔马特科。所有小鼠均在江苏大学实验动物的指导方面进行了特殊的无理由设施。江苏大学动物护理和使用委员会批准所有实验。

2.2。细胞系和细胞培养

人GC细胞系HGC-27和MKN-45购自中国科学院类型培养收藏委员会细胞库(中国上海)，在RPMI-1640(生物工业)中与10%胎牛血清(FBS，生物工业)培养。NK92由山东滨州医学院赠予，在SuperCultureTM L-500 (SL51903, daakewe)培养液中加入10%胎牛血清和IL-2 (100iu /ml, PeproTech)培养。所有细胞在5% CO条件下维持在37°C₂孵化器。

从GC组织中分离出GCMSCs，该组织是从江苏大学附属人民医院进行行动的GC患者获得的（江苏，江苏，中国镇江）。该研究得到了江苏大学伦理委员会的批准。如前所述分离GCMSCs [28.]，并在添加10%胎牛血清的mema - alpha培养基(以色列生物工业公司)中培养。

２.３.间充质干细胞的多谱系分化潜能

用MSC培养基在12孔板中培养主要GCMSCs，其补充有10％FBS。为了诱导成骨和脂肪切征，培养GCMSC培养至达到80％汇合之后，用MSC骨染料试剂盒（C37C00150，Vivacell Biosciences）和MSC adipo染色试剂盒（C37A00150，Vivacell Biosciences）处理它们。在培养2周后，将细胞固定并用油红O（脂肪细胞）和茜素红S（骨细胞）染色。通过显微镜测定细胞中的钙沉积和脂质液滴形成。

２.４.动物模型

将NCG小鼠腹腔内移植 健康的人类PBMCs。7 d后，采用流式细胞术检测人CD45的比例⁺细胞在全血中淋巴细胞。超过25％HCD45的小鼠⁺选择血液中的细胞到淋巴细胞。然后这些老鼠被注射 皮下注射HGC-27细胞，然后在第二天注射GCMSC-CM。GCMSC-CM每隔一天给副肿瘤注射一次，连续14天。每隔一天用卡尺监测和测量肿瘤生长。肿瘤体积计算为 ．当肿瘤长到超过1000毫米时，小鼠被安乐死^3.．在Euthanasia之后，在RPMI-1640中将肿瘤被除去并机械地解离尺寸，如可能小的尺寸。通过将肿瘤组织在胶原酶IV（C1860，Solarbio）和DNase I（D8070，Solarbio）的存在下将肿瘤组织解离1小时来分离单细胞悬浮液。然后将悬浮液通过50 μm过滤器。收集的细胞用于流式细胞术。

2．5．NK细胞隔离

来自健康供体的PBMC通过Ficoll密度梯度离心分离。使用MAC珠（Miltenyi Biotec）从PBMC中分离富集的NK细胞，并且在磁场存在下通过柱分离标记的单核细胞的缀合的CD56抗体。新鲜分离的NK细胞立即在L500培养基中使用或培养。

2.6。流式细胞术和抗体

细胞在单细胞悬液中制备，用磷酸盐缓冲盐水冲洗。用FcR阻断试剂(miltenyi, 130-059-901)孵育10分钟后，在4°C下用荧光抗体染色30分钟。本研究使用了以下抗体(所有抗体均来自BioLegend，除非另有说明):fitc标记的人CD3抗体(300306)，CD56-PE (304606)， CD107a-APC (328620)， PD-1-APC (BD Pharmingen, 558694)， Perforin-APC (353311)， IFN-γ-apc（502512），cfse和pi（bd pharmingen）。通过使用CD19-FITC，CD29-PE，CD34-FITC，CD45-FITC，CD90-PE和CD105-PE抗体（来自埃比科的所有抗体）来评估所选标志物的膜表达的GCMSCs。对于细胞内细胞因子染色，用2℃刺激NK细胞5小时 μl/ml细胞刺激鸡尾酒(加蛋白质运输抑制剂)(eBioscience)，包含佛波12-肉豆素13-乙酸酯，离子霉素，brefeldin A和莫能菌素。然后，根据制造商的说明，用eBioscience FoxP3固定缓冲液对细胞进行表面标记、固定和渗透。然后用穿孔素、CD107a和IFN-对固定的细胞进行染色γ．

2.7。细胞毒性试验

在用GCMSC-cm处理后收集NK细胞。然后，将CFSE标记的靶细胞（HGC-27，MKN-45）通过在37°的不同效应子下用收集的NK细胞与靶比（1：1,5：1,10：1和20：1）一起获得聚集的NK细胞c在5％的co₂培养6小时。为了控制自发死亡，在相同条件下单独培养cfse标记的靶细胞。然后加入PI，裂解细胞(CFSE)⁺π⁺)，通过流式细胞术鉴定。

2.8。扩散分析

NK细胞接种( 细胞/孔)在96孔中。GCMSC-CM处理48 h后，在每口井中加入CCK-8溶液(Beyotime Biotechnology)。孵育2 h后，用自动酶标仪(BioTek, Winooski, VT, USA)在450 nm处测量实验孔和对照孔的吸光度。

2.9。细胞凋亡检测

用GCMSC-cm处理NK92细胞。在这一系列实验中，使用两个混合营养液（SuperCultureTM L-500和MEM-α培养基）以1：1的比例培养包括的对照。治疗后48小时评价凋亡率。按照制造商的建议（BD Pharmingen）， 在每个管中收集细胞，并加入1ml膜蛋白v结合缓冲液，然后彻底混合。随后，5 μ加入了annexinv-fitc。混合后，将管在4℃下在黑暗中温育15分钟，之后10 μ添加了pi。之后，进行流式细胞术分析（Beckman Coulter）。

2.10。西方墨点法

用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液(KeyGEN BioTECH)制备NK和GCMSC细胞的全细胞提取物。SDS-PAGE凝胶用于溶解细胞裂解物，凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜(Millipore，德国);然后用5%脱脂牛奶在室温下封闭1小时。用抗TGF-的一种抗体孵育膜β、S6/p-S6、GAPDH和β-Actin（来自Abcam的所有抗体）在4℃下过夜过夜。通过化学发光放射自显影开发蛋白质带。

2.11。统计分析

数据显示为 的意思。两组间的显著性使用双尾配对来确定测试Prism 7 (GraphPad)。其他统计数据见图例。一个配对检测GCMSC处理前后NK细胞功能的差异。一个未配对试验用于分析小鼠肿瘤中NK细胞浸润的差异。Kruskal-Wallis H测试用于分析体内肿瘤生长的差异。统计参数呈现在每个数字的图例中。 被认为是重要的。

结果

３.１.GC患者间充质干细胞的特征分析

验证了与离解的GC组织中分离的MSC的表型和功能特征。在第14天，在粘附在塑料表面的MSC上观察到长纺锤形成纤维细胞（图1(一))．在条件培养基中诱导后，GCMSCs在体外分化为骨细胞和脂肪细胞(图)1 (b))．抗体染色进行流式细胞术检测。GCMSCs CD105、CD90和CD29阳性，但CD19、CD34和CD45表达缺失(图)1 (c))．

３．２．GCMSCs能有效降低NK细胞体外脱粒能力

鉴于TME中MSCS的免疫抑制潜力，我们探讨了GCMSCS和NK细胞之间的关系。富含NK细胞（CD56⁺来自健康供体的外周血的细胞与GCMSCS共同用48小时，之后通过流式细胞术评估脱滴能力（CD107a表达）。结果表明，来自不同供体的NK细胞显示出类似但最小的CD107a表达水平，并且在GCMSCs存在下比对照（图2（a）- - - - - -2（d）)，提示GCMSCs削弱了NK细胞的脱颗粒功能。然后我们发现，MKN-45激活后，GCMSCs更强烈地抑制脱颗粒(图)2（e）)．另一种分析表明，GCMSCs抑制了长期以来的培养时间的脱粒，但不能在NK细胞中诱导更高的PD-1表达水平（图2 (f))．在NK92细胞中也证实了GCMSC的抑制作用(图)2 (g)- - - - - -2 (h))．为了进一步证实这一现象，NK92细胞分别与GCMSCs或HGC-27共培养或联合培养。GCMSCs有效地逆转了NK92被GC细胞激活(图)2(我))．这些结果表明，GCMSCs处理可降低NK细胞的脱颗粒能力。

３．3.GCMSCs间接诱导NK细胞衰竭状态

NK细胞用GCMSCs上清(GCMSC-CM)处理。与对照组相比，NK92细胞的脱颗粒能力(CD107a表达)显著降低(图)3（a）- - - - - -3（b）)，而来自健康供体的NK细胞表达略低(图3 (c))．考虑到动物实验的同源性和安全性，我们重点研究GCMSCs通过分泌可溶性因子对NK细胞的影响。我们发现GCMSC-CM不能有效促进或抑制NK92细胞的增殖潜能(图)3 (d))．此外，用annexin V和PI染色，流式细胞术检测GCMSC-CM处理的NK92细胞凋亡情况。结果显示，与对照组相比，GCMSC-CM不能显著诱导细胞凋亡(图)S1A-1B)．接下来，我们分析了与NK细胞脱颗粒和细胞因子产生相关的其他标志物。与之前的结果一致，穿孔素和IFN-的表达γ经GCMSC-CM处理后，NK细胞脱颗粒受损，细胞因子产生减少(图3 (e)- - - - - -3 (g))．这些结果表明GCMSCs间接诱导NK细胞的功能失调状态而不影响其增殖潜能。

为了进一步评估NK细胞的效应功能，我们检测了它们的细胞毒性。与MKN-45细胞共培养时，NK92细胞经GCMSC-CM处理后的细胞毒性较未处理细胞明显减弱(图)4(一)- - - - - -4 (b))．对于健康供体的PBMC中的NK细胞，注意到类似的结果（图4 (c)- - - - - -4 (d)），确认NK细胞的衰减细胞毒性。此外，我们发现已知的免疫抑制细胞因子TGF的表达β在GCMSC-CM处理后NK细胞增加(图4 (e))，这可能影响了其他免疫细胞的抗肿瘤潜能，并进一步削弱了TME的抗肿瘤免疫能力。这些结果综合表明，经GCMSC-CM处理的NK细胞对肿瘤的细胞毒性也降低。

3．4．gcmsc处理的NK细胞在体内抗肿瘤活性减弱

为了评估GCMSC-CM处理的NK细胞在体内的抗肿瘤潜力，我们在小鼠异种移植瘤模型中评估了它们杀死GC细胞的能力。小鼠(NCG)接种人PBMC细胞模拟人免疫系统。这些小鼠携带超过25%的人类CD45⁺取全血细胞至淋巴细胞，皮下注射HGC-27细胞;第二天皮下注射GCMSC-CM。每隔一天给药一次GCMSC-CM，连续14天影响NK细胞(图)5(一个)和5 (b))．每隔一天监测肿瘤生长情况。与GCMSC-CM组相比，PBMC表现出明显更高的抗肿瘤活性(图)5 (c))，提示PBMC免疫细胞的抗肿瘤功能受到抑制。我们还调查了侵入人NK细胞(hCD3)的频率和数量^-CD56⁺细胞)。流式细胞术证实NK细胞浸润的频率和脱颗粒能力(CD107a)明显减弱(图)5 (d)和5（e）)，提示上清对PBMCs免疫细胞抗肿瘤功能的抑制可能依赖于NK细胞。总之，这些结果证实了GCMSC-CM可以间接抑制NK细胞在体内的抗肿瘤潜能。

3.5。GCMSCs可能有助于耗尽人GC中的渗透NK细胞

为了研究人GC中NK细胞的功能和频率，使用oncomine数据库进行分析mRNA表达（http://www.oncomine.org)．CD56 mRNA在正常胃组织中的表达明显高于GC组织(图)S2A）[29.]，这与我们从有限的临床样本获得的结果一致（图开通)．根据胃癌的TNM分期，数据库数据显示NK细胞的比例随着肿瘤进展逐渐降低(图)S2C）[30.］．我们从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中收集了244份人胃癌样本，分析了胃癌患者CD56的总生存期;结果显示，CD56表达水平的提高并不意味着总生存率的提高或延长(图)S2D)．这些结果表明，人胃癌中NK细胞的耗竭和频率降低。为了探讨GCMSCs对人胃癌NK细胞的影响，我们进行了GCMSCs标记物与CD56之间的回归分析。TCGA数据库数据分析显示，GCMSC标记物与CD56具有直接的线性相关性(图)S2E)，进一步证实了人NK细胞与GCMSCs之间存在潜在的相互作用。这些结果表明，即使在肿瘤进展的人胃癌中，GCMSCs也可能导致NK细胞的功能障碍和浸润频率降低。

3.6。NK细胞效应减弱部分是由mTOR信号介导的

细胞代谢对免疫细胞的功能至关重要。我们研究了GCMSCs降低NK细胞功能是否依赖于mTOR信号，这是细胞代谢的关键调节因子。我们发现，在gcmsc - cm处理的NK92细胞中，mTOR信号活性下调，这表明磷酸化的S6 (p-S6;数字6(一))．此外，单独使用mTOR1抑制剂雷帕霉素(rapa)可显著降低NK92细胞的效应功能，这可以通过降低CD107a和穿孔素的水平来说明(图)6（b）- - - - - -6（d）)．为了进一步验证mTOR信号是否在GCMSCs处理的NK细胞衰竭中发挥关键作用，我们评估了GCMSCs - cm和/或rapa处理后的效应功能。我们观察到，无论是GCMSC-CM还是rapa都能有效下调效应分子，在GCMSC-CM和rapa联合处理下，脱粒能力进一步下降(图)6（c）)．提示GCMSCs至少部分通过mTOR信号通路减弱NK细胞功能。

TGF-β，是一种已知的NK细胞功能的免疫抑制因子，由GCMSCs产生。此外，与NK92细胞共培养时，GCMSCs表达高水平的TGF-β(图6 (e))．这些结果提示GCMSCs可能以多种方式影响NK细胞功能。

4.讨论

在人类中，渗透肿瘤中的NK细胞影响疾病进展和患者存活，并且较高的NK细胞频率通常表明整体存活率更好[31.］．然而，在实体肿瘤中，浸润肿瘤的NK细胞经常表现出功能失调状态[12.，32.，33.］．一项研究表明，肿瘤浸润NK细胞的百分比和数量处于功能损害状态，并在人GC中降低[10.］．通过流式分析，我们在人GC组织的单细胞悬液中获得了相同的结果(图)S2)．肿瘤细胞通过形成一种免疫抑制微环境来逃避NK细胞介导的监视，在这种微环境中，NK细胞与肿瘤、基质和免疫细胞之间的相互干扰导致了NK细胞功能障碍。

MSCs作为TME的重要组成部分，可有效促进多种类型肿瘤的起始和促进[34.］．MSCs参与TME的免疫调节，促进肿瘤免疫逃逸[19.］．也有报道称它们参与免疫调节并对T细胞发挥免疫抑制作用。我们质疑GCMSCs是否也参与了NK细胞的功能调节。Galland等人证明肺肿瘤来源的MSCs可有效降低NK细胞功能，并通过可溶性因子体外调节NK细胞表型[26.］．然而，考虑到各种类型肿瘤中TME的异质性，MSCs对NK细胞具有不同的影响。据我们所知，这是第一次调查GC衍生的MSCs对NK细胞的影响。

在本研究中，GCMSCs显著降低了健康供者外周血中分离的NK细胞的脱颗粒能力(CD107a)。此外，GCMSCs处理的NK92细胞表现出类似的受损状态。这些结果提示GCMSCs可能是TME中影响NK细胞功能障碍的关键因素。为了进一步证实这一现象，我们将肿瘤细胞与GCMSCs和NK细胞共培养，模拟TME，结果显示肿瘤细胞可以进一步激活NK细胞，但这种激活可以被GCMSCs逆转。提示GCMSCs能有效抑制NK细胞的体外抗肿瘤免疫功能。当GCMSC-CM处理时，脱颗粒和细胞因子(CD107a，穿孔素和IFN-)的产生γ)外周血NK细胞和NK92细胞均明显减弱。此外，经GCMSC-CM预处理的NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性显著降低，表明gcmsc可通过分泌可溶性因子抑制NK细胞功能。有研究报道TGF-表达升高β在TME中抑制免疫细胞功能的吲哚胺-2,3-二恶英酶和PGE2 [35.，36.］．GCMSCs的免疫抑制作用是否与这些因素有关还有待证实。

我们发现与NK细胞共培养的GCMSCs表达更高水平的TGF-β与单独GCMSCs比较，提示TGF-β可能是抑制NK细胞功能的关键因素。令人意外的是，我们发现GCMSCs也可以上调TGF-的水平β在NK细胞中，有助于形成全身免疫抑制微环境。此外，细胞代谢在调节免疫细胞功能中起着至关重要的作用[37.，38.]但是通过受损代谢抑制NK细胞活性的MSCs能力的数据是稀缺的。也意外地，NK细胞的MTOR信号传导在GCMSC-CM处理后显着抑制，同时，NK细胞在RAPA治疗后的效应功能显着削弱，这表明阻尼的NK细胞功能至少部分地部分是由于抑制mtor。然而，我们的结果表明，在RAPA抑制MTOR后，通过GCMSC-CM进一步损害NK细胞的脱盐能力（CD107a），表明MTOR不是GCMSCs影响NK细胞的唯一途径。考虑到MSCs通过配体受体以细胞接触依赖性方式结合的强免疫调节性能或通过各种可溶性因子的分泌[39.， GCMSCs通过多种机制减弱NK细胞的功能。针对PD-1/PD-L1抑制轴的免疫治疗在广泛的癌症中引发长期缓解[11.］．此外，最近报道了在几种癌症适应症（包括GC）中据报道人NK细胞上的PD-1表达。40- - - - - -42.］．然而，我们的结果表明，新鲜分离的外周血NK细胞的PD-1水平最小，表明募集到肿瘤中的NK细胞受到TME的教育。GCMSCs不能在体外上调NK细胞中的PD-1水平，这与在多种情况下的小鼠和人NK细胞中的最小PD-1表达一致[43.］．更深入地了解抑制标志物的表达对促进NK免疫治疗的临床应用至关重要。

最后，对于小鼠皮下肿瘤，我们选择了健康人PBMC细胞重组的小鼠免疫系统。我们的结果表明，GCMSC-CM显著降低了NK细胞的浸润频率，并减弱了它们的脱颗粒能力，这可能也有助于肿瘤的生长。此外，肿瘤浸润NK细胞的频率较低可能是NK细胞从外周血迁移能力下降或浸润肿瘤的NK细胞凋亡增强的结果。据报道，NK细胞对H₂O₂- 诱导的细胞凋亡[44.］．本研究结果表明，GCMSC-CM在体外不能诱导NK细胞增殖或凋亡。而GCMSC-CM处理组NK细胞浸润数量减少，说明gcmsc有效地影响了NK细胞的浸润。此外，有研究报道MSCs影响效应T细胞的功能。我们前期研究发现GCMSCs可上调肿瘤细胞PD-L1的表达，导致肿瘤细胞对CD8的耐药⁺T细胞细胞毒性[20.］．因此，GCMSCs还影响T细胞并导致肿瘤免疫逃逸仍然不清楚，这是我们研究的限制。本研究更多地关注抑制NK细胞参与免疫逃逸的关键作用。

5。结论

综上所述，我们的发现为理解GC中GCMSCs与NK细胞之间的关系提供了一个新的框架。在本研究中，GCMSCs降低了GC渗透NK细胞的频率和功能，导致GC细胞的免疫逃逸。迫切需要对GCMSCs影响NK细胞的靶点进行更深入的研究。总之，通过阻断NK细胞与GCMSCs之间的串话以及通过检查点阻断治疗来恢复NK细胞的功能可能是预防GC免疫逃逸的一种有效策略。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(批准号:20071010901)资助。江苏省重点研发计划(社会发展)项目(批准号:81972313,81972822);白求恩慈善基金会(批准号:BE2017694)项目编号:G-X-2019-0101-12);JX10413778)。

补充材料

补充图1:GCMSC-CM不能有效诱导NK92细胞凋亡。(a) GCMSC-CM对NK92细胞凋亡的影响。NK92细胞中指示分子的代表性FCM图。(b) (a)中凋亡细胞百分比的定量。补充图2:GCMSCs参与了人胃癌浸润NK细胞的衰竭。(a) GC组织和邻近正常胃组织的CD56 (NK细胞)表达(ONCOMINE数据库)。配对的双尾测试中, ．(b) NK细胞(CD3)的代表性FCM图^-CD56⁺）在胃癌组织（肿瘤内（IT）区域）和相应的相邻正常组织（Peritumoral（Pt））来自三种不同患者。（c）CD56表达与胃癌阶段（TNM）之间的相关性;T：肿瘤;n：节点（区域淋巴结）;M：转移。在更先进的阶段的患者倾向于表达较低的CD56表达（Oncomine数据库）。（d）生存在胃癌患者中CD56的低表达和高表达。Mantel-Cox测试。（e）GCMSC标志物（CD90和CD105）与GC组织中CD56表达的相关性分析（补充材料）。（补充材料）

参考文献

1. H. Sung, J. Ferlay, R. L. Siegel等，“2020年全球癌症统计:GLOBOCAN估计全球185个国家36种癌症的发病率和死亡率，”CA:临床医生的癌症杂志，卷。71，没有。3，pp。209-249,2021。视图:出版商网站|谷歌学者
2. C.Allemani，H.K.Weir，H.Carreira等，“全球癌症患者的监测1995-2009：25,676,887名患者的个别数据分析来自279名以67个国家（Concord-2），”《柳叶刀》(2002年第1期)9972, pp. 977-1010, 2015。视图:出版商网站|谷歌学者
3. L. Apetoh, M. J. Smyth, C. G. Drake等，“癌症中CD8(+) T细胞表型的共识命名法”，Oncoimmunology，第4卷，第4期。4、2015。视图:出版商网站|谷歌学者
4. 杨玲，董学忠，张磊，“抗pd -1/抗pd - l1抗体治疗晚期胃癌和胃食管交界处癌的疗效和安全性:meta分析”世界胃肠肿瘤学杂志，第12卷，第2期11，PP。1346-1363,2020。视图:出版商网站|谷歌学者
5. K. J. Malmberg, M. Carlsten, A. Björklund, E. Sohlberg, Y. T. Bryceson，和H. G. Ljunggren，“自然杀伤细胞介导的人类癌症免疫监测”，研讨会在免疫学，卷。31，pp。20-29,2017。视图:出版商网站|谷歌学者
6. N. Aptsiauri, T. Cabrera, A. Garcia-Lora, M. A. Lopez‐Nevot, F. Ruiz‐Cabello，和F. Garrido，“MHC I类抗原和转化细胞的免疫监测”，国际细胞学评论，卷。256，pp。139-189,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
7. M. Gil和K. E. Kim，“在皮肤皮肤黑色素瘤中，白介素-18是与CD8(+) T细胞和自然杀伤细胞浸润相关的预后生物标志物。”临床医学，第8卷，第2期第11页，1993,2019。视图:出版商网站|谷歌学者
8. B. Li, Y. Jiang, G. Li, G. A. Fisher Jr.，和R. Li，“自然杀伤细胞和间质丰度是独立的预后和预测胃癌化疗的好处，”江森自控的洞察力，第5卷，第5期。9日,2020年。视图:出版商网站|谷歌学者
9. J. Cursons, F. Souza-Fonseca-Guimaraes, M. Foroutan等人，“预测黑色素瘤患者自然杀手细胞浸润和提高生存率的基因特征，”癌症免疫学研究，第7卷，第5期7，页1162-1174,2019。视图:出版商网站|谷歌学者
10. “肿瘤相关单核细胞/巨噬细胞通过TGF损伤nk细胞功能β在人类胃癌中有1例，”癌症免疫学研究，第5卷，第5期。3，pp。248-256,2017。视图:出版商网站|谷歌学者
11. J. Hsu, J. J. Hodgins, M. Marathe等人，“NK细胞对PD-1/PD-L1阻断介导的免疫治疗的贡献”，临床研究杂志，卷。128，没有。10，pp。4654-4668,2018。视图:出版商网站|谷歌学者
12. Zhang Q.， Bi J.， Zheng X. et .，“阻断检查点受体TIGIT可防止NK细胞衰竭，并引发有效的抗肿瘤免疫”，自然免疫学第19卷第2期7，pp。723-732,2018。视图:出版商网站|谷歌学者
13. S. Platonova, J. Cherfils-Vicini, D. Damotte等，“肺癌中肿瘤内NK细胞表型和功能的深刻协调变化”，癌症研究，卷。71，没有。16，pp。5412-5422，2011。视图:出版商网站|谷歌学者
14. Y. Lavin, S. Kobayashi, A. Leader等，“配对单细胞分析在早期肺腺癌中的先天免疫景观，”细胞第169卷第1期4、750 - 765页。e17, 2017年。视图:出版商网站|谷歌学者
15. G. Nayyar，Y. Chu和M. S.开罗，“克服抗自然杀伤细胞的抗实际瘤免疫检查”，“在肿瘤领域，卷。9日，2019年。视图:出版商网站|谷歌学者
16. 卞燕，李伟，D. M. Kremer等，“癌症SLC43A2改变T细胞蛋氨酸代谢和组蛋白甲基化，”自然(第585卷)2 .第2页，第2 - 3页，2020。视图:出版商网站|谷歌学者
17. G. M. Konjević， A. M. Vuletić， K. M. Mirjačić Martinović， A. K. Larsen, V. B. Jurišić，“细胞因子在调节NK细胞在肿瘤环境中的作用”，细胞因子，卷。117，pp。30-40,2019。视图:出版商网站|谷歌学者
18. Z. Husain, Y. Huang, P. Seth, V. P. Sukhatme，“肿瘤来源的乳酸修饰抗肿瘤免疫反应:对骨髓来源的抑制细胞和NK细胞的影响”，免疫学杂志，卷。191年，没有。3，pp。1486-1495,2013。视图:出版商网站|谷歌学者
19. Y. Shi，L. du，L. Lin和Y. Wang，“肿瘤相关的间充质茎/基质细胞：新兴治疗目标”自然评论。药物发现，第16卷，第5期。1，第35-52页，2017。视图:出版商网站|谷歌学者
20. “IL-8通过STAT3/mTOR-c-Myc信号轴诱导胃癌细胞中PD-L1的表达，”细胞死亡和疾病，第9卷，第5期。第9页，2018年。视图:出版商网站|谷歌学者
21. M. Najar, G. Raicevic, E. Crompot等人，“间充质间质细胞的免疫调节潜力:一个调控网络的故事，”《免疫疗法第39卷第3期2，第45-59页，2016。视图:出版商网站|谷歌学者
22. P. Mattar和K. Bieback，“比较骨髓、脂肪组织和出生相关组织间充质基质细胞的免疫调节特性”，免疫学前沿， 2015年6月。视图:出版商网站|谷歌学者
23. S. Zhao，R.Wehner，M.Bornhäuser，R.Wassmuth，M.Bachmann和M. Schmitz，间充质基质细胞的免疫调节性质及其对免疫介导的疾病的治疗后果，“干细胞与发育第19卷第2期5, pp. 607-614, 2010。视图:出版商网站|谷歌学者
24. A. Greenbaum, Y. M. Hsu, R. B. Day等，“早期间充质祖细胞的CXCL12是造血干细胞维持所必需的”，自然，第495卷，第2期。7440, pp. 227-230, 2013。视图:出版商网站|谷歌学者
25. M. Wang，B. Chen，X. X. Sun等，“胃癌组织间充质干细胞通过破坏Treg / Th17平衡来促进外周血单核细胞以促进胃癌进展，”实验细胞研究，第361卷，第2期。1，页19-29,2017。视图:出版商网站|谷歌学者
26. S. Galland, J. Vuille, P. Martin等人，“肿瘤来源间充质干细胞使用独特的机制来阻止自然杀伤细胞亚群的活动，”细胞的报道，第20卷，第2期。12, pp. 2891-2905, 2017。视图:出版商网站|谷歌学者
27. M. Najar, M. Fayyad-Kazan, N. Meuleman, D. Bron, H. Fayyad-Kazan, L. Lagneaux，“骨髓间充质基质细胞和自然杀伤细胞:细胞相互作用和交叉调节，”J细胞通信信号，第12卷，第2期4, pp. 673-688, 2018。视图:出版商网站|谷歌学者
28. Xu X.， Xu X. Zhang, S. Wang et al.，“human gastric cancer and adjacent non-cancer tissues from mesenchymal stem-like cells from human gastric cancer and adjacent non-cancer tissues，”癌症研究与临床肿瘤学杂志第137卷第1期3, pp. 495-504, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
29. “胃癌中生物标志物识别的综合转录组学和计算分析，”核酸研究第39卷第3期4, pp. 1197-1207, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
30. C. H. Ooi, T. Ivanova, J. Wu等，“致癌通路组合预测胃癌的临床预后，”公共科学图书馆麝猫，第5卷，第5期。10日,2009年。视图:谷歌学者
31. K. Liu，K. Yang，B.Wu等，“肿瘤浸润的免疫细胞与胃癌预后有关”医学(巴尔的摩)，第94卷，第94期2015年39岁。视图:谷歌学者
32. Ni J.， X. Wang, A. Stojanovic等，“肿瘤浸润NK细胞的单细胞RNA测序揭示了转录因子HIF-1的抑制α释放NK细胞活性，”免疫，卷。52，不。6，PP。1075-1087.E8,2020。视图:出版商网站|谷歌学者
33. J.Cong，X. Wang，X. Zheng等人，“通过FBP1诱导的自然杀伤细胞功能障碍诱导肺癌进展期间的糖酵解抑制”细胞代谢第28卷第2期2，pp。243-255.E5,2018。视图:出版商网站|谷歌学者
34. S. J. Turley，V.Cremasco和J.L.Starita，“肿瘤微环境中基质细胞的免疫标志，”自然评论：免疫学，第15卷，第5期。11, pp. 669-682, 2015。视图:出版商网站|谷歌学者
35. M. Hasmim，Y.Messai，L. Ziani等，“肿瘤微环境在整形NK细胞功能中的关键作用：缺氧应力的含义，”免疫学前沿， 2015年6月。视图:出版商网站|谷歌学者
36. J. Baginska, E. Viry, J. Paggetti等人，“肿瘤微环境在形成自然杀伤细胞介导的抗肿瘤免疫中的关键作用，”免疫学前沿， 2013年第4期。视图:出版商网站|谷歌学者
37. K.L. o'brien和D.K.Pinlay，“免疫素质和自然杀手细胞反应”自然评论：免疫学第19卷第2期5，页282-290,2019。视图:出版商网站|谷歌学者
38. C. M. Gardiner， " NK细胞代谢"白细胞生物学杂志第105卷第1期6, pp. 1235-1242, 2019。视图:出版商网站|谷歌学者
39. C. D. Hu, Y. Kosaka, P. Marcus, I. Rashedi, A. Keating，“人骨髓源性间充质基质细胞对自然杀伤细胞的不同免疫调节作用”，干细胞与发育第28卷第2期14，第933-943页，2019。视图:出版商网站|谷歌学者
40. P. M. Lanuza, C. Pesini, M. A. Arias, C. Calvo, A. Ramirez-Labrada, and J. Pardo, “Recalling the biological significance of immune checkpoints on NK cells: a chance to overcome LAG3, PD1, and CTLA4 inhibitory pathways by adoptive NK cell transfer?”免疫学前沿， 2019年第10卷。视图:谷歌学者
41. F. Vari, D. Arpon, C. Keane等，“在霍奇金淋巴瘤中，NK细胞和单核细胞/巨噬细胞通过PD-1/PD-L1的免疫逃避比DLBCL更突出。”血，第131卷，第2期第16页，1809-1819页，2018。视图:出版商网站|谷歌学者
42. Y. Liu，Y. Cheng，Y.Xu等，“编程细胞死亡蛋白1对NK细胞的表达增加抑制NK细胞介导的抗肿瘤功能，表明消化癌症中的预后差”，“oncogene.第36卷第2期44, pp. 6143-6153, 2017。视图:出版商网站|谷歌学者
43. S. J. Judge, C. Dunai, E. G. Aguilar等，“不同条件下小鼠和人类NK细胞中PD-1的最低表达”，临床研究杂志号，第130卷。6，第3051-3068页，2020。视图:出版商网站|谷歌学者
44. S. Izawa, K. Kono, K. Mimura等，“胃癌和食管癌中肿瘤微环境中H₂O₂产量与n(dim) NK细胞浸润负相关:NK细胞功能障碍的可能机制，”癌症免疫学，免疫疗法，第60卷，第2期12，第1801-1810页，2011。视图:出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2021郭树伟等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。