SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2021/9989790 9989790 研究文章 胃癌间充质干细胞通过mTOR信号抑制NK细胞功能,促进肿瘤生长 郭 Shuwei 1 黄 曹国伟 1 汉 峰峰 1 程ydF4y2Ba 本 1 丁 应 1 赵 渊源 1 程ydF4y2Ba Zhihong 2 温 Shaodi 3 王 梅 1 沈 薄 3 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5237 - 1992 朱 魏 1 李 肖康 1 医学院的 江苏大学 镇江 江苏 中国 ujs.edu.cn 2 胃肠外科学系 江苏大学附属人民医院 镇江 江苏 中国 ujs.edu.cn 3 肿瘤学系 江苏南京医科大学附属肿瘤医院 南京 江苏 中国 njmu.edu.cn 2021年 30. 6 2021年 2021年 9 3 2021年 4 6 2021年 14 6 2021年 30. 6 2021年 2021年 版权©2021 Shuwei郭et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

自然杀伤(NK)细胞的功能障碍已被越来越多的报道在恶性肿瘤,特别是固体肿瘤。间充质干细胞(msc)具有多效性的功能,包括调节免疫细胞疲惫与癌症恶化。然而,msc来自协会的胃癌(胃癌间充质干细胞:GCMSCs)和NK细胞的功能障碍仍然知之甚少。在这项研究中,我们证明了GCMSCs有效地促成了疲惫的NK细胞通过释放可溶性的因素。此外,钝化NK细胞的抗肿瘤作用与功能失调状态密切相关。GCMSC-conditioned介质阻止渗透NK细胞的频率和效应功能tumour-bearing小鼠模型,从而促进肿瘤生长。从力学上看,哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)信号,细胞新陈代谢的关键调节器调节免疫细胞的功能,是抑制NK细胞GCMSCs对待。然而,检查点受体PD-1仍有或没有GCMSCs出席最小水平。研究结果显示,GCMSCs导致不正常的NK细胞参与至少部分抑制mTOR信号,暗示NK细胞癌症免疫疗法的潜在方向。

 江苏省研究生创新研究与实践项目 JX10413778 白求恩慈善基金会 g - x - 2019 - 0101 - 12所示 江苏省的重点科研项目和发展计划 BE2017694 中国国家自然科学基金 81972822 81972313 1。介绍

胃癌(GC)是第五位最常见的癌症诊断和全球癌症死亡的第四大原因 1]。尽管外科手术和其他治疗的重大进展,GC的总体5年生存率仍然不到30%在大多数国家( 2]。GC的开发和发展受到肿瘤之间的串扰和宿主的免疫系统( 3]。临床试验针对免疫检查点,比如PD-1 / PD-L1抑制轴,报道突出结果对各种肿瘤。然而,GC的客观缓解率仅为15% ( 4]。因此,开发一个深入了解潜在的免疫逃避机制在GC开发和发展是至关重要的。

自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性先天免疫细胞免疫监测建立角色对肿瘤细胞和病毒感染( 5]。许多肿瘤类型表现出高发病率的主要组织相容性复合体(MHC)损失或低neoantigen负担( 6),使肿瘤细胞耐火CD8识别+T细胞。与CD8+T细胞,NK细胞倾向于调解non-MHC-restricted杀死肿瘤细胞,这使得他们对癌症治疗的吸引力。人类癌症的研究越来越多的证据表明,NK细胞频率,渗透,改善病人生存函数( 7- - - - - - 9]。一项研究表明,胃tumour-infiltrating NK细胞的百分比与肿瘤大小负相关,入侵,整体生存,淋巴结和远处转移,神经入侵状态( 10]。另一份报告显示,PD-1的功效和PD-L1封锁依赖NK细胞的抗肿瘤活性 11]。此外,封锁的检查点TIGIT防止NK细胞受体疲惫和抒发强有力的抗肿瘤免疫( 12]。

大量研究表明,渗透NK细胞恶性肿瘤,特别是固体肿瘤,显示抑制功能和表型改变( 13, 14]。策略的有效性基于NK细胞治疗实体肿瘤仍不满意( 15),表明在免疫抑制NK细胞活性的关键限制肿瘤微环境(时差)。边等人表明,肿瘤细胞新陈代谢损害以超强的竞争力将T细胞对T细胞功能和肿瘤免疫蛋氨酸( 16]。肿瘤细胞和肿瘤细胞产生和分泌各种免疫抑制因素抑制NK细胞的激活,包括白介素(IL) 6、IL - 10,将生长因子- β(TGF - β)和前列腺素E2 (PGE2) [ 17]。另一项研究表明,乳酸和低pH值的时间减少了细胞毒性NK细胞的活性,从而降低肿瘤死亡的能力( 18]。越来越多的研究表明,时间通过多种机制导致tumour-infiltrating NK细胞功能障碍,导致肿瘤的免疫逃逸。

间充质干细胞(msc)是细胞的一个关键组件的时间( 19]。我们先前的研究已经表明,msc源自GC组织(GCMSCs)调节PD-L1表达式在GC细胞,导致肿瘤逃避( 20.]。此外,msc具有系统性免疫调节和免疫抑制特性和影响适应性和先天免疫反应直接或通过分泌可溶性分子( 21- - - - - - 24]。我们确定GCMSCs展出免疫抑制潜力和调节性T细胞的比例增加外周血单核细胞(PBMCs) [ 25]。研究人员还广泛关注msc对NK细胞的影响。一个实验证实,msc源自人类肺癌可以通过PGE2引起NK细胞功能障碍( 26),和骨骨髓来源msc增强NK细胞的功能和增加穿孔素的释放和granzymes [ 27]。这一结果表明,msc从不同的组织可能会表现出不同的监管职能。

msc在GC NK细胞的影响尚不清楚。为了解决这个研究缺口,我们全面、严格探讨了GCMSCs对NK细胞活性的影响。我们发现了一个显著的减少分子和细胞毒性效应的函数与GCMSCs治疗后的肿瘤细胞,NK细胞。此外,浸润NK细胞的频率被确定在小鼠皮下肿瘤及其体内功能均显著降低。我们的观察肿瘤生长提供洞察GCMSCs的反应,以及他们如何间接生硬的NK细胞活性。

 2。材料和方法 2.1。老鼠

点头/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22 Gpt (NCG老鼠;年龄:4 - 8周)从南京GemPharmatech购买。所有的老鼠都养在一个特殊的无菌设施使用根据江苏大学实验动物指南。所有实验动物保健和使用委员会批准江苏大学。

 2.2。细胞系,细胞培养

人类的GC细胞系HGC-27和MKN-45购买从中国科学院类型文化收藏委员会细胞库(上海,中国),培养rpmi - 1640年(生物产业)与10%胎牛血清(的边后卫,生物产业)。NK92被山东滨州医科大学的天赋和培养SuperCultureTM l - 500 (SL51903 DAKEWE) 10%的边后卫和2(100国际单位/毫升,PeproTech)。所有细胞都维持在37°C公司5%2孵化器。

GCMSCs GC中分离的组织,从GC病人操作获得江苏大学附属人民医院(镇江,江苏,中国)。这项研究是由江苏大学的伦理委员会批准。GCMSCs分离(如前所述)( 28]在MEM-ALPHA培养基培养,(生物产业、以色列)补充10%的边后卫。

 2.3。Multilineage msc分化潜能

主要GCMSCs是培养与MSC 12-well板块中补充10%的边后卫。诱导成骨、脂肪形成的差异化,GCMSCs培养直到80%汇合了,之后,他们对待MSC Osteo-Staining工具包(C37C00150 VivaCell生物科学)和MSC Adipo-Staining工具包(C37A00150 VivaCell生物科学)。经过2周的文化,这些细胞被固定和沾油红O(组织)和茜素红S(骨细胞)。钙沉积和脂滴形成的细胞通过显微镜测定。

 2.4。动物模型

NCG小鼠腹腔移植 1 × 10 7 健康的人类PBMCs。7天后,流式细胞术进行人类CD45的比例来确定+细胞在全血淋巴细胞。老鼠hCD45超过25%+细胞淋巴细胞在血液被选中。这些老鼠被注射 1 × 10 6 HGC-27细胞皮下注射,这是第二天注射GCMSC-CM紧随其后。GCMSC-CM是给paratumour每隔一天为14天。肿瘤生长监测和测量每隔一天使用卡尺。肿瘤体积计算 0.5 × 长度 × 宽度 × 宽度 。老鼠的安乐死当肿瘤增长到超过1000毫米3。安乐死后,肿瘤被删除和机械分离的尺寸尽可能小rpmi - 1640。孤立一个单细胞悬液分离肿瘤组织的胶原酶IV (C1860 Solarbio)和DNAse (D8070 Solarbio) 1 h。通过50暂停就紧张 μm过滤器。收集到的细胞用于流式细胞术。

 2.5。NK细胞隔离

PBMCs从健康的捐赠者通过聚蔗糖密度梯度离心分离。丰富NK细胞分离使用mac从PBMCs珠(Miltenyi研究),和共轭CD56抗体标记单核细胞与未标记的细胞通过列在一个磁场。新孤立NK细胞在L500立即使用或培养介质。

 2.6。流式细胞术和抗体

细胞准备单细胞悬液,用磷酸盐。孵化后货代阻塞试剂(miltenyi, 130-059-901) 10分钟,NK细胞与荧光抗体染色在4°C 30分钟。下面的抗体被用于这项研究(所有抗体从BioLegend除非另有说明):FITC-conjugated人类CD3抗体(300306),CD56-PE (304606), CD107a-APC (328620), PD-1-APC (BD Pharmingen, 558694), Perforin-APC(353311)、干扰素- γapc (502512)、CFSE和π(BD Pharmingen)。GCMSCs评估膜表达选择标记的使用CD19-FITC CD29-PE, CD34-FITC, CD45-FITC, CD90-PE, CD105-PE抗体(从eBioscience以上抗体)。细胞内细胞因子染色,NK细胞被刺激5 h, 2 μl /毫升细胞刺激鸡尾酒(加上蛋白质运输抑制剂)(eBioscience)包含佛波醇12-myristate 13-acetate, ionomycin brefeldin A,莫能菌素。然后,细胞表面标记染色,固定,permeabilised eBioscience FoxP3固定缓冲区根据制造商的指示。固定细胞被沾染了穿孔素,CD107a和干扰素- γ。

 2.7。细胞毒性试验

NK细胞收集GCMSC-CM治疗。然后,CFSE-labelled靶细胞(HGC-27 MKN-45) cocultured与收集到的NK细胞在不同效应目标比率(1:1,5:1,10:1,和20:1)在37°C公司5%2孵化器6 h。自然死亡的控制,CFSE-labelled靶细胞单独培养在相同条件下。然后,添加了π,细胞溶解细胞(CFSE+π+通过流式细胞仪)被确定。

 2.8。扩散分析

NK细胞被播种( 2 × 10 5 细胞/)在96年-。与GCMSC-CM治疗后48 h, CCK-8解决方案(Beyotime生物技术)被添加到每个。2 h孵化后,吸光度实验和控制井测量与自动标450海里(美国BioTek Winooski, VT)。

 2.9。细胞凋亡检测

与GCMSC-CM NK92细胞治疗。在这一系列的实验,包括控制使用两个混合营养培养方案(SuperCultureTM l - 500和MEM-ALPHA介质)的比率1:1。凋亡率进行评估治疗后48 h。按照制造商的建议(BD Pharmingen), 5 × 10 5 细胞被收集在每个管和1毫升的膜联蛋白V绑定缓冲了,紧随其后的是彻底的混合。随后,5 μl的膜联蛋白V-FITC是补充道。混合后,管在4°C在黑暗中孵化15分钟,之后10 μl(π是补充道。后,流式细胞仪分析(贝克曼库尔特)。

 2.10。西方墨点法

全细胞提取物NK和GCMSC细胞准备里帕缓冲区包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂(凯基生物生物技术)。sds - page凝胶被用来解决细胞溶解产物,和蛋白质在凝胶被转移到PVDF膜(微孔、德国);其次是封锁5%脱脂牛奶在室温下1 h。膜是孵化主要抗体TGF - β、S6 / p-S6 GAPDH和 β一夜之间从Abcam肌动蛋白(抗体)在4°C。蛋白质的乐队是通过化学发光放射自显影法。

 2.11。统计分析

给出的数据 的意思是 ± 标准 错误 的意思。两组之间的意义使用双尾成对的决心 t 测试在棱镜7 (GraphPad)。其他统计如图传说。一个配对 t 测试是用来分析NK细胞功能的差异有无GCMSC治疗。一个未配对 t 渗透测试是用来分析不同NK细胞在小鼠的肿瘤。克鲁斯卡尔-沃利斯H测试被用来分析体内肿瘤生长的差异。统计参数在每个图的传说。 P < 0.05 被认为是显著的。

 3所示。结果 3.1。描述从患者分离的msc的GC

msc隔绝的表型和功能特性的GC组织验证。14天,长纺锤形成纤维细胞的细胞观察msc坚持塑料表面(图 1(一))。在条件培养基诱导后,GCMSCs接受分化骨细胞和脂肪细胞体外(图 1 (b))。此外,抗体染色流式细胞术了。GCMSCs CD105是积极的,CD90、CD29但缺乏CD19的表达,CD34、CD45(图 1 (c))。

GCMSC的描述。(一)代表GCMSC的形象。(b)成骨分化(茜素红S、200 x)和脂肪形成的分化(油红O, 200 x)。(c) GCMSC标记(CD19、CD29、CD34、CD45、CD90、和CD105)通过流式细胞术分析。

 3.2。GCMSCs有效减毒脱粒NK细胞体外的能力

由于免疫抑制潜在的msc的时间,我们探索GCMSCs和NK细胞之间的关系。丰富NK细胞(CD56+从外周血细胞)健康的捐赠者与GCMSCs cocultured 48 h,之后脱粒能力(CD107a表达式)通过流式细胞术进行评估。结果显示,不同捐赠者的NK细胞显示相似但最低级别的CD107a表达式,以及减少在GCMSCs水平超过控制(数字 2(一个)- - - - - - 2 (d)),这表明GCMSCs削弱了脱粒NK细胞的功能。然后我们发现GCMSCs更强烈激活后抑制脱粒MKN-45(图 2 (e))。另一个分析显示,GCMSCs抑制长coculture脱粒时间,但不能诱导高PD-1 NK细胞(图中表达水平 2 (f))。类似的发现为抑制GCMSC也证实NK92细胞(数字 2 (g)- - - - - - 2 (h))。为了进一步证实这种现象,NK92细胞cocultured GCMSCs或HGC-27单独或合并使用。GCMSCs有效逆转由GC NK92细胞(图的激活 2(我))。这些结果显示,治疗GCMSCs减毒的脱粒NK细胞的能力。

GCMSCs直接减毒脱粒NK细胞的能力。(一)丰富NK细胞(CD56 FCM控制策略+从健康献血者外周血)。(b)代表直方图的CD107a新鲜孤立的NK细胞。(c) NK细胞与或没有GCMSCs cocultured 1: 1比48 h通过流式细胞术分析CD107a表达式。(d)量化CD107a表达式的NK细胞(c)所示,数据了 的意思是 ± 扫描电镜 。配对 t 测试中, ∗ P < 0.05 。(e) CD107a + NK细胞的分析。生产CD107a GCMSCs其次是刺激与MKN-45 5 h测量。(f)丰富NK细胞cocultured MKN-45细胞有或没有GCMSC 7天。代表CD107a和PD-1的直方图。(g) NK92细胞cocultured GCMSCs 48 h。代表CD107a显示直方图。(h)量化CD107a表达式。数据了 的意思是 ± 扫描电镜 。配对 t 测试中, ∗ ∗ P < 0.01 。(我)NK92细胞cocultured HGC-27和/或GCMSCs。代表直方图的CD107a NK92细胞所示。

 3.3。GCMSCs显著诱导一个疲惫状态NK细胞以一种间接的方式

NK细胞治疗与上层清液源自GCMSCs (GCMSC-CM)。脱粒能力(CD107a表达式)NK92细胞与对照组相比显著降低(数字 3(一个)- - - - - - 3 (b)从健康的捐赠者展出),而NK细胞(图略低表达 3 (c))。鉴于动物实验的同源性和安全性,我们专注于GCMSCs对NK细胞通过分泌可溶性因子。我们确定GCMSC-CM不能有效促进或抑制NK92细胞的增殖潜力(图 3 (d))。此外,NK92细胞接受GCMSC-CM沾膜联蛋白V和π通过流式细胞术对细胞凋亡测定。结果显示,GCMSC-CM不能显著诱导细胞凋亡与控制(图 S1A-1B)。接下来,其他标记与脱粒和NK细胞的细胞因子的生产特征。与以前的结果一致,穿孔素和干扰素的表达 γ与GCMSC-CM抑制治疗后,建议削弱脱粒、NK细胞的细胞因子产量下降(数据吗 3 (e)- - - - - - 3 (g))。这些结果表明,GCMSCs间接诱导在NK细胞功能失调的状态而不影响其增殖潜力。

GCMSC-CM有效诱导NK细胞的疲惫状态。(一)NK92细胞治疗GCMSC-CM 48 h CD107a通过流式细胞术分析。(b)的量化的阳性细胞百分比(a)所示。(c)分析CD107a表达式在NK细胞分离出健康的捐赠者培养有或没有GCMSC-CM通过流式细胞术。(d)的量化CCK8 GCMSC-CM对NK细胞增殖的影响。(e, f)代表FCM表示分子的情节与GCMSC-CM NK92细胞治疗。结果是代表三个独立的实验。(g)量化的百分比和平均荧光强度(MFI)表示分子所示(e, f)。(b、d和g)数据显示为 的意思是 ± 扫描电镜 。一个配对 t 测试是用于比较。 ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 。

为了进一步评估NK细胞的效应函数,检查其细胞毒性。当cocultured MKN-45细胞,NK92细胞治疗GCMSC-CM表现出显著减毒细胞毒性与未经处理的细胞(数字 4(一)- - - - - - 4 (b))。类似的结果还提到了NK细胞在健康的捐赠者PBMCs(数字 4 (c)- - - - - - 4 (d)),确认减毒NK细胞的细胞毒性。此外,我们发现已知的免疫抑制细胞因子的表达TGF - β增加在NK细胞治疗GCMSC-CM(图 4 (e)),这可能会影响其他潜在的抗肿瘤免疫细胞,进一步削弱了抗肿瘤免疫的时间。这些结果综合表明,NK细胞治疗GCMSC-CM也表现出了对肿瘤细胞毒性的能力减弱。

减毒由GCMSC-CM治疗后NK细胞的细胞毒性。由NK92细胞(a)细胞毒性对MKN-45目标之前有或没有GCMSC-CM治疗。代表FCM的π靶细胞中表达。(b)六小时NK92细胞的细胞毒性试验对MKN-45细胞。针对MKN-45 NK92细胞的细胞毒性表示比率(NK细胞/靶细胞)(左)。量化的细胞毒性试验的比例1:1(右)。(c)对HGC-27靶细胞的细胞毒性NK细胞来源于健康的捐赠者。代表FCM的π靶细胞中表达。(d)六个小时对HGC-27细胞NK细胞的细胞毒性与GCMSC-CM进行预处理。针对HGC-27 NK细胞的细胞毒性细胞在不同的比率(左)。 Quantification of the cytotoxicity assay at the indicated ratios (right). (e) NK 92 cells were treated with GCMSC-CM for 48 h, and TGF- β通过免疫印迹表达评估。

 3.4。GCMSC-Treated NK细胞表现出体内减毒抗肿瘤活性

评价抗肿瘤的潜力与GCMSC-CM体内NK细胞治疗,我们评估的能力杀死老鼠GC细胞异种移植肿瘤模型。老鼠与人类PBMC细胞(NCG)管理,模仿人类的免疫系统。老鼠与人类CD45的25%以上+细胞在全血淋巴细胞被选择和皮下注射HGC-27细胞;其次是第二天GCMSC-CM皮下注射。GCMSC-CM的剂量是每隔一天服用14天影响NK细胞(数字 5(一个)和 5 (b))。肿瘤生长监测每隔一天。PBMC与GCMSC-CM相比表现出显著提高抗肿瘤活性组(图 5 (c)),这表明PBMC的抗肿瘤免疫细胞功能抑制。我们也调查了频率和数量的人类NK细胞浸润(hCD3- - - - - -CD56+细胞)。的频率和脱粒能力(CD107a)浸润NK细胞明显减毒就是明证流式细胞术(数字 5 (d)和 5 (e)),这表明,抑制免疫细胞的抗肿瘤作用在PBMCs上层清液可能取决于NK细胞。在一起,这些结果确认GCMSC-CM可以抑制NK细胞的潜在抗肿瘤体内一种间接的方式。

GCMSC-treated NK细胞具有减毒体内抗肿瘤活性。(一)体内治疗方案。NCG老鼠注射 1 × 10 7 PBMCs从健康的捐赠者。成功构建小鼠模型被选中下列实验7天后。流式细胞术(b)代表人类CD45的阴谋+老鼠的数量由外周血细胞PBMC治疗后7天。(c)肿瘤卷( 的意思是 ± 扫描电镜 )在小鼠在不同时间点后所面临的挑战。克鲁斯卡尔-沃利斯 H 测试中, ∗ ∗ ∗ ∗ P < 0.0001 。流式细胞术(d)代表的浸润NK细胞(上)在肿瘤和直方图CD107a(底部)浸润NK细胞中表达。(e)量化浸润NK细胞的频率和在intratumoural CD107a NK细胞的表达。数据了 的意思是 ± 扫描电镜 。未配对的双尾 t 测试中, ∗ P < 0.05 。

 3.5。GCMSCs可能导致人类GC浸润NK细胞的疲惫

探讨NK细胞的功能和频率在人类GC, mRNA表达进行了分析使用ONCOMINE数据库( http://www.oncomine.org)。CD56的mRNA表达明显高于正常胃组织中比在GC组织(图 S2A)[ 29日),这是符合我们从有限的临床样本(图结果 开通)。根据GC的TNM分类阶段,数据库的数据显示,NK细胞的比例逐渐减少与肿瘤进展(图 S2C)[ 30.]。我们收集了244人类癌症基因组图谱的GC样本(TCGA)数据库和分析CD56 GC患者的总生存期;结果显示,高表达CD56并不意味着不再或更好的整体存活率(图 S2D)。这些结果暗示疲惫和NK细胞在人类GC的频率下降。探索人类GC GCMSCs对NK细胞的影响,我们进行了回归分析GCMSC标记和CD56之间。TCGA的分析数据从数据库显示,GCMSC标记有直接线性相关与CD56(图 S2E),这进一步验证了潜在的NK细胞之间的相互作用和人类GCMSCs。这些结果表明GCMSCs可能引起的功能障碍和降低浸润NK细胞即使在人类GC的频率与肿瘤进展。

 3.6。减毒效应在NK细胞功能在一定程度上是由mTOR信号

细胞新陈代谢至关重要的免疫细胞的功能。我们调查是否NK细胞功能的减少GCMSCs取决于mTOR信号、细胞代谢的主要监管机构。我们确定mTOR信号活动表达下调GCMSC-CM-treated NK92细胞,显示的磷酸化水平降低S6 (p-S6;图 6(一))。此外,雷帕霉素治疗(拉伯),mTOR1的抑制剂,显著减少的效应函数NK92细胞,所表示的水平降低CD107a和穿孔素(数字 6 (b)- - - - - - 6 (d))。进一步验证是否mTOR信号中起关键作用的疲惫与GCMSCs NK细胞治疗,治疗后我们评估效应函数GCMSC-CM和/或拉伯。我们观察到GCMSC-CM或拉伯有效地表达下调效应分子,而脱粒能力进一步降低了下治疗GCMSC-CM和拉伯(图的组合 6 (c))。这一结果表明,GCMSCs减弱NK细胞功能至少部分通过mTOR信号。

减毒效应在NK细胞功能在一定程度上是由mTOR信号。(一)免疫印迹分析mTOR下游激活(魔法石第六章)在GCMSC-CM NK92细胞培养48 h。(b)治疗后发现魔法石第六章NK92细胞中表达有或没有雷帕霉素(100 ng / ml) 48 h用免疫印迹。(c, d) NK92细胞与雷帕霉素和GCMSC-CM孵化。代表直方图表示CD107a和穿孔素分子。(e)间接Transwell cocultures GCMSCs和NK92之间TGF - β使用免疫印迹表达GCMSC进行评估。GCMSCs来自三个不同的病人。

TGF - βNK细胞功能,一个已知的免疫抑制因子,是由GCMSCs。此外,当cocultured NK92细胞,GCMSCs表达高水平的TGF - β(图 6 (e))。这些结果表明,GCMSCs可能影响NK细胞功能的方法不止一种。

 4所示。讨论

在人类中,渗透影响疾病进展和NK细胞在肿瘤病人的生存,和更高频率的NK细胞通常表明更好的生存 31日]。然而,在固体肿瘤,tumour-infiltrating NK细胞经常表现出一种不良的状态( 12, 32, 33]。一项研究表明,tumour-infiltrating NK细胞的百分比和数字功能损伤状态和减少人类GC [ 10]。我们获得相同的结果在一个单一的人类GC组织细胞悬液通过流分析(图 S2)。肿瘤细胞逃避NK细胞监测通过开发一个免疫抑制微环境中NK细胞功能障碍是由于NK细胞和肿瘤之间的串扰,基质和免疫细胞。

作为一个关键组件的时间,msc可以有效地促进多种肿瘤的启动和推广( 34]。msc参与免疫调制的时间和促进肿瘤的免疫逃逸 19]。他们也被报道参与免疫调节和发挥对T细胞免疫抑制的影响。我们质疑GCMSCs也参与NK细胞的功能调节。加兰德等人证明了肺部肿瘤提取msc有效降低NK细胞功能和调节NK表型通过体外溶性因素 26]。然而,考虑到时间在各种类型的肿瘤的异质性,msc对NK细胞可能有不同的影响。据我们所知,这是第一个调查GC-derived msc对NK细胞的影响。

在目前的研究中,GCMSCs显著减毒脱粒能力(CD107a)外周血NK细胞分离的健康的捐赠者。此外,NK92细胞治疗GCMSCs显示同样受损状态。这些结果表明,GCMSCs可能是一个关键因素影响NK细胞功能障碍的时间。进一步证实了这一现象,我们用GCMSCs cocultured肿瘤细胞和NK细胞模拟时间,结果显示,肿瘤细胞可以进一步激活NK细胞,但这激活GCMSCs可以抵消。这些结果表明,GCMSCs有效限制NK细胞体外的抗肿瘤免疫。GCMSC-CM处理时,脱粒和细胞因子的生产(CD107a、穿孔素和干扰素- γ)与对照组相比明显减毒在外周血NK细胞或NK92细胞。此外,NK细胞使用GCMSC-CM表现出显著降低对肿瘤细胞细胞毒性,这表明GCMSCs可以通过分泌可溶性因子抑制NK细胞的功能。有研究报道的高表达TGF - β,3-dioxygenase indoleamine-2 PGE2,抑制免疫细胞的功能,在时间( 35, 36]。是否GCMSCs导致的免疫抑制效应,这些因素还有待证实。

我们发现GCMSCs cocultured与NK细胞表达高水平的TGF - β与单独GCMSCs相比,表明TGF - β可能是一个关键因素抑制NK细胞的功能。出人意料地,我们发现GCMSCs也可以移植的TGF -水平 βNK细胞,导致系统性免疫抑制微环境的形成。此外,细胞的新陈代谢起着至关重要的作用在调节免疫细胞的功能( 37, 38),但数据msc抑制NK细胞活性的能力通过受损的代谢稀缺。也出乎意料,mTOR GCMSC-CM治疗后信号的NK细胞明显抑制,同时,拉伯治疗后NK细胞的效应功能明显减弱,这表明抑制NK细胞功能至少部分是由于mTOR的抑制。然而,我们的研究结果表明,抑制mTOR后拉伯,脱粒能力(CD107a)的NK细胞被GCMSC-CM进一步受损,建议到mTOR不是唯一途径,GCMSCs NK细胞的影响。考虑到msc的强大的免疫调节特性通过细胞contact-dependent方式中的绑定或各种可溶性因子的分泌( 39),GCMSCs减弱NK细胞功能通过各种机制。免疫疗法针对PD-1 / PD-L1抑制轴引起的长期缓解广泛的癌症( 11]。此外,PD-1表达人类NK细胞最近被报道在一些癌症的迹象,包括GC [ 40- - - - - - 42]。然而,我们的研究结果显示,PD-1在新鲜分离外周血NK细胞水平最低,表明NK细胞加入了肿瘤受教育的时间。GCMSCs不能移植PD-1水平NK细胞体外,这是符合最小PD-1表达式的发现在老鼠和人类NK细胞在多种条件下( 43]。更透彻地了解抑制性标记的表达是至关重要的促进NK免疫治疗的临床应用。

最后,对小鼠皮下肿瘤,我们选择了老鼠的免疫系统重建与健康的人类PBMC细胞。我们的研究结果表明,GCMSC-CM大幅减少渗透NK细胞的频率以及减毒脱粒能力,这也可能导致肿瘤生长。此外,低频率肿瘤浸润NK细胞可能的结果要么减少外周血NK细胞迁移的能力或增强NK细胞的细胞凋亡渗透肿瘤。NK细胞已报告敏感到H2O2全身的细胞凋亡( 44]。本研究的结果表明,GCMSC-CM不能诱导NK细胞在体外的增殖或凋亡。然而,GCMSC-CM治疗组表现出浸润NK细胞的数量,这意味着GCMSCs有效地影响了NK细胞的渗透。此外,有研究报道,msc影响效应T细胞的功能。我们先前的研究发现GCMSCs可以上调PD-L1表达在肿瘤细胞,使肿瘤细胞CD8的阻力+细胞毒性T细胞( 20.]。也因此,GCMSCs是否影响T细胞并导致肿瘤免疫逃避尚不清楚,这是我们研究的局限性。本研究更侧重于抑制NK细胞的关键作用参与免疫逃逸。

 5。结论

总之,我们的研究结果提供了新的框架理解GC GCMSCs和NK细胞之间的关系。在目前的研究中,GCMSCs GC-infiltrating NK细胞的频率和功能降低,导致GC细胞的免疫逃逸。更深入的调查的目标GCMSCs影响NK细胞是迫切需要的。总的来说,恢复NK细胞的功能通过阻断NK细胞之间的串扰和GCMSCs以及通过检查点封锁疗法可能是一个有用的策略防止GC免疫逃逸。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项研究是由美国国家科学基金会支持的中国(批准号:81972313和81972822),江苏的项目重点研究和发展计划(批准号(社会发展):BE2017694),白求恩慈善基金会(批准号:g - x - 2019 - 0101 - 12),江苏省和研究生研究和实践创新项目(没有。JX10413778)。

 补充材料

补充图1:GCMSC-CM不能有效地诱导NK92细胞凋亡。(一)GCMSC-CM对NK92细胞凋亡的影响。在NK92细胞代表FCM表示分子的阴谋。(b)量化的凋亡细胞的比例(a)所示。补充图2:GCMSCs参与人类胃癌浸润NK细胞的疲惫。(a)表达CD56 (NK细胞)的GC组织和邻近正常胃组织(ONCOMINE数据库)。配对的双尾 t 测试中, ∗ ∗ ∗ ∗ P < 0.0001 。(b)代表FCM NK细胞(CD3的阴谋- - - - - -CD56+)在胃癌组织中(瘤内(IT)地区)和相应的邻近正常组织(瘤旁(PT)地区)从三个不同的病人。(c) CD56表达与胃癌之间的相关性阶段(TNM);T:肿瘤;护士:节点(区域淋巴结);M:转移。患者在更高级的阶段往往表达低表达CD56 (ONCOMINE数据库)。(d)生存的低和高表达CD56的胃癌患者。Mantel-Cox测试。(e)之间的相关分析GCMSC标记(CD90和CD105)和CD56表达在GC组织(补充材料)。

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