牙髓采伐方法对成体牙髓源间充质干细胞分化能力的影响

摘要

客观的比较两种用于干细胞扩增的牙髓获取方法，即保守牙髓切断术和拔牙牙髓切除术。方法.从5名患者中选择10颗新鲜拔除的完好第三磨牙。对照组使用5颗，通过拔牙进行牙髓采集，其余牙齿用于试验组，通过保守的牙髓切断术（保留牙齿）采集牙髓这是一项裂口设计研究，其中一侧的第三颗磨牙被随机分配到试验组和对照组的对侧牙中。牙髓采集后，进行以下评估：细胞形态学、无菌试验、免疫表型、分化试验、首次通过活细胞计数、冷冻时间保留，以及第四遍结束时扩展单元格的总数。结果．形态学方面，两组细胞均呈成纤维细胞表型。所有样品均无菌。免疫表型显示CD105、CD90、CD73阳性表达，CD45阴性表达。两组的骨分化和软骨分化检测均为阳性。第一次传代活细胞计数，对照组活细胞总数占95.8%，试验组活细胞总数占91.2% ( ).两组的冷冻保存时间分别为51.6天和52.6天( ).第四代末细胞总数分别为5,286,782和5,736,862 ( ).结论．这些结果表明，从保守的牙髓切开术中获取成体干细胞与传统的拔牙方法一样有效。

1.介绍

牙髓干细胞(Dental pulp stem cells, DPSC)具有高增殖能力，并能分化为多种细胞类型。这些细胞表达CD29+、CD73+、CD90+、CD105+、CD166+等间充质干系特异性标志物，而对CD14-、CD34-、CD45-、HLA-DR-等造血标志物表达阴性。［1.–3.]。DPSCs通过生长因子和细胞因子的产生和释放，对受损组织再生和免疫活性起旁分泌调节作用，这使得它们成为细胞治疗中的一种重要治疗策略[4.–8.]。

最初，DPSCs从神经嵴分化为活性神经元，并分泌不同的神经生长因子，如GDNF、BDNF、CNTF等，发挥重要的免疫调节、神经保护和神经营养活性，如抑制创伤诱导的细胞凋亡、切断的轴突再生、以及丢失细胞的补充[1.,9–11]。当诱导成骨细胞分化时，可正确表达预期表型，IGFBP-5、Runx2、JunB、NURR1基因正调控，ALP、COL-I、OCN、OSP、VEGF等特征标志物表达[4.,12]。

在牙科学中，DPSCs被研究用于各种组织的再生，如骨、牙髓[8.]、牙骨质、牙周韧带及人类牙齿再生[10,13–21].旨在实现骨再生的生物材料和间充质干细胞的联合已证明在关键缺陷修复、更大的血管化骨密度和更高的骨植入物接触（BIC）水平方面优于牙槽骨，被证明是与发病率相关的自体骨采集的潜在替代方法[22–27]。

牙齿组织是一种很有前途且容易获得的干细胞来源，有报道称成功地从腐烂的牙齿中分离出干细胞[28],牙髓炎[29–31，第三臼齿[32]。即使从发炎的牙髓中分离出来，DPSCs也能表达MSC标记物，具有增殖和分化能力。已有两种收集牙髓用于分离和扩大成体间充质干细胞的方法报道:在受控的无菌环境中从拔除或脱落的牙齿中去除牙髓，或在不拔除牙齿的情况下去除牙髓。目前，从恒牙中提取人髓用于分离和扩大成人牙髓间充质干细胞的最有效方法尚未达成共识。

考虑到保守获取牙髓组织的可能性和低发病率，本研究旨在评估成体DPSC采集方法对牙髓细胞生存能力和分化能力的影响，并比较了在完好恒牙拔除和截髓的情况。

2.材料和方法

2.1. 纳入和排除标准

选择5例第三磨牙萌出且完好的患者。根据巴西坎皮纳斯圣利奥波多曼迪奇牙科学校研究伦理委员会（CAAE:55547916.0.0000.5374），所有参与者均同意参与本研究。从5名年龄在18至25岁之间的患者中各取2颗牙齿，共取10颗牙齿。

2．2.摘取牙髓组织

牙髓材料从两种不同的方法获得，拔牙后牙冠的G1切片（对照组） )g2冠状入路牙髓切开术(实验组) ).

样品在一个冷藏的冷盒(低于10°C)中运输，在锥形底部含有运输基础培养基(Gibco，美国)的Falcon试管中，富含1%的青霉素/链霉素(Sigma，美国)。

2.2.1。提取

G1拔牙后送实验室处理。在切割钳的帮助下，通过牙骨质珐琅质交界处的操作获得牙髓入口(图1（a）)用牙本质刮匙收集牙髓。

2.2.2。牙髓切除术

使用球形金刚石钻(KG Sorensen)，在恒定冷却和器械对牙齿的低压下高速进入牙髓，直到牙髓通过半透明可见。然后用牙本质刮匙破坏牙髓腔的顶部，然后用同样的工具去除牙髓(图)1（b）–1（d）).

2.3.间充质干细胞的分离和培养

所有的实验室程序都是在巴西坎皮纳斯的R-CrioCriogenia进行的，实验室分类为ISO7 (ISO 14644)。样品在含有100 U/mL青霉素/链霉素的溶液中冲洗(Sigma，美国)，然后用I型胶原酶1 mg/mL在37℃下酶解5分钟。添加低糖DMEM基础培养基(Sigma，美国)停止消化，178 G离心10分钟。弃上清，用1x PBS缓冲液洗涤，去除反应残渣，178 G离心10分钟。弃上清液，用添加10% ( )胎牛血清（美国西格玛-F2561类），1%( )l -谷氨酰胺(Sigma，美国:Cat 59202C)， 1.1% ( )青霉素/链霉素(Sigma，美国:Cat P4333)。将该内容物接种到25厘米高的地方^3.将细胞置于37°C和5% CO下孵育_2.(松下、MCO-19AIC紫外线)。每72 h更换一次新的培养液。当汇合到65 ~ 75%时，酶切回收细胞(胰蛋白酶)进行细胞传代。

２.４.细胞形态

在37°C和5%CO下培养后，通过光学显微镜（放大100倍）评估细胞形态_2.Stempro培养基(Gibco，美国)。

2.5. 流式细胞术

为了评估细胞表面抗原的表达，将第三代细胞与抗CD45-PE（585）的单克隆抗体孵育 nm）小鼠抗人，克隆HI30（BD Biosciences，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）；CD73-PE（585 nm）小鼠抗人，克隆AD2（BD Biosciences，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）；CD90-FITC（533 nm）小鼠抗人克隆5E10（BD Biosciences，加利福尼亚州圣地亚哥市，美国）；和CD105-FITC（533 nm）小鼠抗人，克隆266（BD Biosciences，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）。在Accuri C6流式细胞仪（BD Biosciences）上分离样本进行分析，包括1000个事件。

2.6。细胞分化

在12孔板中诱导成骨和成软骨分化，诱导培养基按照制造商的说明准备，每3天更换一次。28天后，细胞用茜素红(Sigma，美国)染色，软骨细胞用Alcian Blue (Sigma，美国)染色。

2.7。活细胞计数在第一通道

在光镜下，使用台盼蓝排斥法和Neubauer血细胞仪评估细胞计数。

2.8。统计分析

在这项研究中，Wilcoxon-Mann-Whitney该检验用于两组之间的比较，因为它是一种非参数检验，不假设数据正态性。显著性水平设置为5%。

3.结果

３．１．细胞形态学与无菌性

光镜下(100倍)观察细胞形态，两组细胞均为成纤维细胞形态，呈细长纺锤形，呈编织状分布，如图所示2.．所有样品均无真菌和细菌污染。

3.2.免疫表型

流式细胞术检测两组标本中CD73+、CD90+、CD105+标记物阳性表达，CD45-阴性表达，对比如图所示3.．

3.3. 分化试验

对照组和实验组的细胞均表现出成骨和成软骨分化的形态学特征(图)4.)，即钙化结节结构和蛋白多糖。

3．4．首次传代细胞计数

实验组(牙髓切开术)有91.2%的活细胞，对照组(拔牙术)有95.8%的活细胞( ,表格1.和图5.).

3．5．低温保存所需时间

试验组和对照组从分离到冷冻保存的总培养时间分别为52.6和51.6天，无统计学差异( )如表中所述，在两种方法之间发现1.和图5.．

3.6。在第四回合结束时，总细胞扩展

细胞扩增后，试验方法共产生5736862.20个冷冻保存细胞，对照组产生5286782.00个细胞。如表所示，两种方法之间未观察到统计上的显著差异1.和图5.．

4.讨论

干细胞具有自我复制和分化为多种菌株的能力[8.]这些细胞可以在体内的各种组织中找到，如骨髓、脂肪组织、滑膜、成人牙髓和乳牙牙髓[3.,9,33,34]。

旨在调查形成成牙本质的第三代牙本质起源的研究发现，具有高增殖能力和分化能力的克隆源性细胞群，证实了牙髓干细胞的存在[3.]。这一发现推动了对口腔其他部位干细胞的研究，如根尖乳头、牙滤泡、牙周韧带和乳牙[35]。

在牙髓中，干细胞位于牙髓的中心区域，尽管数量很少。由于乳牙自然脱落，而从恒牙中获取细胞可以无创且无发病率。虽然乳牙和恒牙来源的干细胞有许多共同的特征，但乳牙髓细胞的分化程度低于恒牙[4.]。

间充质干细胞具有显著的多能性，使其非常有希望用于组织再生。至少有两种分离和扩增这些细胞的收获方法已被报道：在无菌环境下从拔牙和脱落牙中取出牙髓，或在保存牙齿的同时取出牙髓组织，尽管没有缺点关于最有效的方法的文献中出现[3.,4.]。

本研究旨在评估两种获取成体牙髓干细胞的方法在细胞活力和分化能力方面的影响，比较对照方法(拔牙法)和试验方法(牙髓切开术)在完好的第三磨牙中的作用。这适用于临床情况下，如为正畸目的拔牙和疼痛。

显微镜评估显示收获细胞的成纤维细胞形态，这证实了Gronthos等人的发现以及Jiménez等人的最新报告。所发现的形态是确定干细胞特征的重要标准，如Sonoda等人所述[3.,5.,26]。

免疫分型显示作为干细胞标记物的表面分子的表达，即CD73、CD90和CD105作为阳性标记物，CD45作为阴性标记物，这是表征间充质干细胞的基础[2.,12,36]。

建立祖干细胞的一个重要标准是其分化为多个菌株的能力[8.]。chondrogenic因此,成骨的能力,观察和收集的脂肪形成的变异细胞,因为它是一个至关重要的特性在再生疗法的临床应用的临界骨缺损,Ikeda等人所描述和应用于动物和伊藤等人的人类朱利安尼et al。24,25,32]。成骨分化阳性，内可见钙化结节形成体外文化(3.,37]。糖胺聚糖的发现证实了软骨分化[33]脂肪细胞分化通过脂质空泡的证据进行评估[9,29]。

试验组（牙髓切开术）的活细胞计数占总细胞数的91.2%，而对照组（拔牙术）的活细胞数为95.8%，表明两种采集方法的细胞存活率存在显著差异( ).尽管最初两种方法在活细胞百分比方面存在显著差异，但本文提出的先锋牙齿保存替代方法在第四代时产生了相等的冷冻保存细胞总数( ),即对照组为5,286,782个细胞，试验组为5,736,862个细胞。

众所周知，在可能的情况下，保留牙齿的本体感觉比种植修复更可取。天然牙齿在低咬和咀嚼负荷时的触觉敏感度，是骨结合种植体所不能替代的[38]此外，从组织学上观察到，牙齿相对于种植体具有一些优势，例如牙周结缔组织的胶原纤维垂直附着在牙骨质上，但位于种植体表面，与基牙/种植体相关的胶原纤维在平行方向上有适应性，牙周膜明显缺失[39]。由于通过根管治疗来保存天然牙齿是一种“在大量病例中保存功能的可行、实用和经济的方法”，即使在预后有问题的情况下，在不需要拔牙的情况下获得牙髓组织进行细胞治疗是一种可行且有前途的选择[40,41]。

在进行重要牙髓根管治疗(例如，不可逆牙髓炎和/或修复目的)的恒牙进行牙髓切开术获得的牙髓组织可以隔离和扩大成牙髓间充质干细胞，即使在牙髓发炎(即牙髓炎)的情况下[29].乳牙也是如此[30.,31]，尽管它们会脱落，但它们的保养对恒齿长出和咬合很重要[42]综上所述，这些事实使人们注意到，如本研究所述，研究获取牙髓组织的保守方法的必要性。本文报告的研究结果强调了获得干细胞的保守方法的可行性。

5.结论

这项研究的结果表明，牙髓切开术可能是一种可行的保守的替代传统方法的牙髓收获从拔牙。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Victor Okada Vendramini和Sevda Pouraghaei是第一作者。

致谢

这项工作得到了巴西坎皮纳斯SP R-Crio干细胞的支持。这项研究部分是由CAPES，财务代码001资助的。

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