SOX12通过上调JAGGED1促进干细胞样表型和骨肉瘤肿瘤生长

摘要

SOX12在某些肿瘤的生长中起着促进作用;然而，它在骨肉瘤中的作用尚不清楚。从基因表达omnibus (GEO)和与基因组驱动治疗(TARGET)相关的肿瘤改变数据库中，通过Kaplan-Meier分析，建立骨肉瘤患者中SOX12表达与骨肉瘤生存和复发之间的关系。我们还执行在体外和在活的有机体内测定SOX12在骨肉瘤病因学中的作用。SOX12在骨肉瘤中表达增加;SOX12高表达与患者预后不良和高复发有关。此外，SOX12在骨肉瘤细胞株中的表达增加，类似于骨肉瘤癌干细胞。我们还观察到，在裸鼠骨肉瘤细胞中，SOX12基因敲低抑制了干细胞标记物的球化和表达，并抑制了肿瘤的形成。此外，SOX12基因敲低可抑制JAGGED1和HES1的表达。同样，JAGGED1的敲除也抑制了裸鼠骨肉瘤肿瘤干细胞成球，降低了干细胞标记物的表达和肿瘤形成能力。最后，在SOX12基因下调过程中，JAGGED1过表达挽救了骨肉瘤细胞免于球化。SOX12通过上调JAGGED1促进干细胞样表型和骨肉瘤肿瘤生长。

1.介绍

骨肉瘤是青少年最常见的恶性肿瘤;无转移的骨肉瘤患者的5年生存率约为70%，但有转移的骨肉瘤患者的5年生存率为20% [1］．因此，对转移性骨肉瘤患者的治疗措施是迫切需要的。

近期研究报道SOX12在多种肿瘤中发挥重要作用，如SOX12促进肝癌转移[2］．此外，SOX12通过调节天冬酰胺合成促进结直肠癌细胞增殖转移[3.］．同样，SOX12促进胃癌细胞的转移[4］．同样，其他研究报道SOX12对结肠癌转移具有抑制功能[5］．然而，SOX12在骨肉瘤中的确切作用尚不清楚。

肿瘤干细胞存在于肿瘤的小切片中，具有细胞群的自我更新增殖和分化，是肿瘤转移、复发和耐药的重要原因[6］．癌症干细胞调控是通过几个关键的信号通路来实现的，如Wnt/β-catenin, Notch和Hedgehog [7］．JAGGED1是Notch配体，在肿瘤干细胞分化和转移中起关键作用;HES1是jagge1的下游分子[8，9］．例如，jagged1 - notch1部署的肿瘤血管周围生态位通过Jag1-Notch1-Zeb1-VEGFA信号促进乳腺癌干细胞表型[10］．JAGGED1在肺癌干细胞中也有重要作用;它促进干细胞表型和肺腺癌的肿瘤生长[11］．重要的是，JAGGED1在骨肉瘤干细胞中也有关键作用;它促进干细胞样表型和骨肉瘤肿瘤生长[12］．

在这项研究中，我们观察到SOX12通过上调JAGGED1促进干细胞样表型和骨肉瘤肿瘤的生长。我们的数据为临床治疗潜在骨肉瘤提供了新的见解。

2.材料和方法

2．1．质粒和试剂

SOX12-short hairpin (sh) RNA购自上海汉化生物科技有限公司。目的序列为CATGGCGGATTACCCGGACTA [2］．从中国广州RiboBio公司获得抗JAGGED1的小干扰(si) RNA。SOX12的Pc-cDNA购自IGE BIOTECHNOLOGY基因(中国广州)。JAGGED1的Pc-cDNA购自中国广州BOMING基因。MG63和143B骨肉瘤细胞系取自中国科学院细胞类型培养库(中国上海)。采用DMEM和胎牛血清(FBS, Gibco, Logan, USA)培养细胞。JAGGED1和β-actin抗体购自ab克隆(A12733，中国)。

2．2.临床标本

SOX12表达数据来源于基因表达综合数据库(GEO)中的GSE28424和GSE42352数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)．SOX12的预后数据来自GSE21257数据库。复发性SOX12数据来自于与基因组学驱动治疗(TARGET)数据库相关的肿瘤改变(https://ocg.cancer.gov/)．

2．3.细胞转染

将慢病毒颗粒直接加入六孔板的细胞中。48 h后加入嘌呤霉素，抽吸培养基和死亡细胞。然后添加了新的完全培养基。细胞一直生长到融合。将siRNA、pc-cDNA和骨肉瘤细胞接种到六孔板中。用Opti-MEM (Gibco)饥饿6 h。将Lipofectamine 3000 (Invitrogen公司，美国)与JAGGED1 siRNA和JAGGED1 pc-cDNA混合10 min，不同混合物培养细胞6 h。

2．4．实时定量聚合酶链反应

首先，用Trizol和200从细胞中提取细胞RNAμl氯仿补充道。将混合物在12,000 rpm的转速下摇匀并离心15分钟。然后加入等量的异丙醇，最终溶解在DEPC水中。采用PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa，中国大连)进行实时定量PCR (RT- qpcr)和cDNA合成。采用SYBR Green PCR Master mix kit (TaKaRa)和ABI Step-One系统进行3个重复的RT-qPCR。肌动蛋白作为内部控制。数据用2-ΔΔct方法。列出了RT-qPCR引物(表)1)．

2．5．免疫印迹分析

采用RIPA缓冲液提取蛋白质。将样品离心生成上清液，然后将上清液加到等分液中，煮沸10分钟。蛋白电泳2 h，转移到聚偏氟乙烯膜上。一抗与膜共温过夜，第二天加入二抗。然后在荧光显微镜下拍摄膜。

2．6．肿瘤领域分析

细胞播种于 细胞/孔在六孔超低附着板(Corning Inc.， Corning, NY, USA) DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA)中添加N2培养基(Invitrogen)、人EGF (10 ng/ml, Peprotech，美国)和人bFGF (10 ng/ml, Peprotech)。培养14 d后，统计球的总数。

2.7。动物研究

选用4周龄雌性BALA/c裸鼠(每组6只)，购自广东省动物医疗中心。我们注入了 用此公式计算皮下细胞及随后肿瘤体积 （ )．注射后40 d处死小鼠。分析肿瘤大小和数目。

2.8。统计分析

使用学生的结果进行比较 -测试。预后比较采用Kaplan-Meier法进行。生存曲线比较采用log-rank检验。所有统计数据使用SPSS 19.0 (IBM, Chicago, IL, USA)和GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA, USA)进行分析。

3.结果

3．1.SOX12在骨肉瘤中高表达;骨肉瘤患者SOX12高表达水平与不良预后和高复发率相关

为了探讨SOX12表达与骨肉瘤预后或复发之间的关系，我们分析了GSE21257数据库(表)2)，并观察到SOX12表达升高提示骨肉瘤患者预后不良(图1(一))．从TARGET数据库(表3.)， SOX12表达水平高的骨肉瘤患者的疾病复发率较高(图1 (b))．此外，在GSE42352数据库中，SOX12在骨肉瘤细胞株中的表达高于正常骨组织(图)1 (c))．同样，在GSE28424数据库中，SOX12在骨肉瘤患者中的表达高于非骨肉瘤患者(图)1 (d))．与人成骨细胞相比，骨肉瘤细胞株U2OS、SAOS2、143B和MG63中SOX12的表达被高度调节(hFOB)1 (e))．

３．２．SOX12在骨肉瘤干细胞中高表达

我们评估了SOX12在骨肉瘤干细胞中的表达。在没有血清的情况下，细胞被悬浮成球形[13，14］．在骨肉瘤干细胞培养条件下，这些细胞可在球形培养中富集;我们在球形培养条件下培养两种骨肉瘤细胞系143B和U2OS，富集CSCs，然后检测骨肉瘤干细胞和普通细胞中SOX12的表达。SOX12在骨肉瘤干细胞中的表达较高(图)2(一个)和2 (b))．U2OS细胞也是如此(图)2 (c)和2 (d))，提示SOX12的高表达对CSCs的维持至关重要。

3．3．慢病毒转染细胞SOX12表达降低

将表达绿色荧光蛋白的慢病毒转染细胞，经嘌呤霉素筛选后进行荧光成像。转染细胞显示荧光，未转染细胞无荧光(图3(一个))．与shRNA-NC相比，转染shRNA-SOX12的骨肉瘤细胞中SOX12表达下调(图)3 (b))．这也发生在U2OS单元格中(图)3 (c)和3 (d))．

3．4．SOX12下调抑制骨肉瘤细胞的干细胞样性质

shRNA-SOX12慢病毒转染骨肉瘤细胞后，骨肉瘤细胞形成球状体的能力降低，表现为敲破SOX12的骨肉瘤细胞形成球状体减少;球化实验中球的数量代表肿瘤细胞的干性;这意味着敲除SOX12可以抑制骨肉瘤干细胞的干性(图)4(一)和4 (c))．此外，茎干分子标记NANOG、SOX2、CD44和CD133也减少(图)4 (b)和4 (d))．从我们的在活的有机体内干细胞分析，我们注射 143B骨肉瘤细胞与100μl DMEM转染裸鼠后，40天后，SOX12基因敲除组中只有1个成功长出肿瘤，而NC组均有肿瘤(图)4 (e)- - - - - -4 (g))．

3．5.SOX12过表达促进骨肉瘤细胞的干细胞样性质

通过转染过表达SOX12的质粒，通过PCR验证转染143B细胞的效率(图)5(一个))．之后，我们进行了肿瘤干性相关分析，我们发现过表达SOX12的骨肉瘤细胞比对照组更能形成球体(图)5 (b)和5 (c)过表达SOX12的143B细胞的干性指标高于对照组(图)5 (d))．

3.6。SOX12基因敲除降低JAGGED1和HES1的表达

从文献中，我们观察到(补充表S3)过表达SOX12后的茎相关分子为JAGGED1 [2];因此，我们通过RT-qPCR和Western blotting研究了JAGGED1 mRNA和蛋白的表达。我们观察到，SOX12基因敲低后，JAGGED1的mRNA和蛋白表达受到抑制。同样，HES1的mRNA和蛋白也减少了(图)6(一)- - - - - -6 (c))．

3.7。JAGGED1抑制降低骨肉瘤细胞的干性能力

JAGGED1是促进癌症干细胞的关键因素[15］．我们观察到sirna介导的JAGGED1抑制降低了JAGGED1的表达(图)7(一))．我们的RT-qPCR数据显示，在jagged1沉默的骨肉瘤细胞中，干细胞相关标记如NANOG、SOX2、CD44和CD133的mRNA水平显著下调(图)7 (b)和7 (c))．此外，转染siRNA-JAGGED1的骨肉瘤干细胞的球化能力低于转染siRNA-NC的骨肉瘤干细胞(图)7 (d)和7 (e))．另外,我们的在活的有机体内40天后干性分析显示，其中一个JAGGED1敲低组成功长出2个肿瘤，而所有NC组均长出1个肿瘤(图)7 (f)- - - - - -7 (h))．

3.8。JAGGED1过表达部分挽救shRNA-SOX12转染骨肉瘤细胞的球化能力

我们研究了SOX12是否通过JAGGED1相互作用发挥作用。通过在shRNA-SOX12转染的细胞中过表达JAGGED1，与空质粒转染的细胞相比，JAGGED1过表达部分挽救了shRNA-SOX12转染的骨肉瘤细胞的球化能力(图)8(一个)和8 (b))．

4.讨论

SOX12是SOX基因家族成员，在肿瘤细胞分化、免疫等多种生物学过程中发挥重要作用[16- - - - - -19］．它还能抑制肝癌、胃癌和结直肠癌的发展[2- - - - - -4］．然而，它在骨肉瘤中的作用目前尚不清楚。在我们的研究中，我们观察到SOX12通过上调JAGGED1促进干细胞样表型和骨肉瘤肿瘤的生长。

美国癌症研究协会干细胞研讨会(American Association for Cancer Research Stem Cell Workshop)将癌症干细胞定义为肿瘤组织中具有干细胞特性的一小部分细胞;具有无限的自我更新能力，可产生与上一代相同的子代细胞，具有多种分化潜能和高生长繁殖能力，可形成由异质肿瘤细胞组成的肿瘤组织[20.］．许多研究人员认为，癌症干细胞来自正常组织干细胞的突变，有些人认为它们来自体细胞突变。肿瘤干细胞通常具有以下特点:自我更新能力、高致瘤性、分化潜能和耐药性[21，22］．肿瘤干细胞标志物还包括NANOG、ALDH1、SOX2、OCT4、LGR5、CD44、CD133;因此，可以通过这些标记物的表达来判断茎干程度[23］．

球形形成试验是一种常见的骨肉瘤干细胞分选方法[14］．在裸鼠中，骨肉瘤干细胞比普通骨肉瘤细胞更能形成肿瘤[24］．最重要的是，已有研究指出，骨肉瘤干细胞的存在是肿瘤转移、耐药、复发的重要原因。因此，开发肿瘤干细胞疗法已成为肿瘤治疗的重要目标[25］．

NOTCH信号通路促进癌症干细胞的发生和发展[26］．JAGGED1是notch配体，在癌症干细胞中起关键作用;HES1是jagge1的下游分子[11，27］．同样，JAGGED1在骨肉瘤干细胞中也发挥着重要作用，如microRNA;miR-26a通过靶向JAGGED1抑制干细胞样表型和骨肉瘤肿瘤生长[12］．因此，JAGGED1可能是肿瘤干细胞的重要靶点[28］．

SOX12在许多肿瘤中具有重要作用;一项先前的研究表明SOX12是急性髓系白血病的一个新的潜在靶点[29］．此外，它促进三阴性乳腺癌细胞的生长和转移潜能[30.］．研究也表明SOX12是肝癌干细胞的重要标志[31，32，而其他研究表明，它促进了胶质瘤细胞的干性[33］．因此，SOX12在许多肿瘤类型和某些肿瘤干细胞中发挥关键作用已被公认。

我们的研究中最重要的发现是SOX12在骨肉瘤中高表达，这种高表达与骨肉瘤患者的不良预后和高复发有关。与普通骨肉瘤细胞相比，骨肉瘤癌干细胞中SOX12表达增加。SOX12基因下调后，骨肉瘤细胞的球化能力下降。裸鼠干细胞标记物表达和致瘤能力也降低。同样，SOX12敲低后，JAGGED1和HES1的表达也降低。然后我们用siRNA敲除JAGGED1的表达，观察到裸鼠的球化能力、干分子标记的表达和致瘤能力下降。最后，通过敲除SOX12和过表达JAGGED1，恢复细胞的球化能力。

最后，我们证明了SOX12通过上调JAGGED1促进干细胞样表型和骨肉瘤肿瘤的生长。我们的数据表明，这些分子可以为骨肉瘤的治疗提供新的分子治疗方法。

5.结论

SOX12通过上调JAGGED1促进干细胞样表型和骨肉瘤肿瘤生长。我们的数据表明，这些分子可以为骨肉瘤的治疗提供新的分子治疗方法。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

HZ构思并设计了这项研究。WFZ、FY、JW和YEZ进行了实验。JJL和YHW撰写了手稿。DLW和TTQ对数据进行分析，并进行统计分析。所有作者阅读并批准了最终的手稿。张伟飞、余飞、翁建、郑翼恩等对这部作品都有贡献。

致谢

本研究由深圳市医学重点学科资助。深圳市“三明”医药工程资助项目(No. SZXK023);国家自然科学基金资助项目(No. 82001319)，广东省基础与应用基础研究基金资助项目(Nos. 2019A1515011290和2019A1515110983)，白求恩慈善基金和CSPC骨质疏松研究基金资助项目(No. 201612092);基金资助:国家自然科学基金资助项目(No. gx -2020-1107-21);SZXJ2018077)。

补充材料

补充表S3:使用人类EMT PCR阵列的Huh7-Sox12与huh7对照细胞中差异表达的基因列表。（补充材料）

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