血红素Oxygenase-1-Modified骨髓间充质干细胞结合性常温机器灌注修复胆管损伤的肝移植大鼠模型通过激活腺体Peribiliary Wnt通路

文摘

肝脏从捐赠者循环死后(以便)不可避免地暴露于延长热缺血期,这可能会增加术后胆管并发症的发生率。骨髓间充质干细胞(BMMSCs)组织修复特性。本研究旨在探讨血红素的修复效果oxygenase-1——(HO-1)修改BMMSCs (HO-1 / BMMSCs)结合性常温机器灌注(NMP)胆管损伤后肝移植和DCD计划揭示底层机制。大鼠肝脏受到原位热缺血30分钟;然后,NMP执行通过门静脉与BMMSCs 4 h, HO-1 / BMMSCs,或既不植入前。明显的胆管组织学损伤和术后观察肝脏功能损害。在HO-1治疗组/ BMMSCs结合NMP (HBP集团),肝脏功能和胆管组织学改善;与此同时,细胞凋亡减少,细胞增殖活跃。大量的再生细胞出现在受伤的网站,和有缺陷的胆管上皮恢复。扩张peribiliary腺体(PBG),扩散PBG细胞高表达血管内皮生长因子(VEGF)和增加的比例胆管与干细胞/祖细胞祖细胞生物标志物被观察到。阻塞Wnt信号显著抑制的修复效果HO-1 / BMMSCs胆管损伤。总之,HO-1 / BMMSCs结合NMP相关胆道祖细胞的激活在空气层中修复胆管损伤肝移植DCD计划通过Wnt信号通路。百事装瓶集团的增殖和分化细胞参与了受伤的胆道上皮细胞的更新。

1。介绍

肝移植是一个拯救生命的治疗终末期肝病患者;然而,器官短缺目前成功治疗的最大障碍,这直接导致死亡的每年成千上万的病人在等候名单(1]。目前许多肝移植中心接受延长移植标准捐助者(ECD),其中很大一部分是捐助者循环死后(论证)。肝脏DCD计划的特点是,他们接受较长的比肝脏热缺血期脑死亡后,从捐助者(DBD)和更容易缺血再灌注损伤(IRI)。与肝实质细胞相比,胆道上皮细胞有较低的宽容IRI由于缺乏自我保护的抗氧化剂如过氧化氢酶和减少谷胱甘肽(2]。胆道并发症是重要的影响因素肝移植的存活率和长期的结果。以便决定肝移植后胆道并发症的发生率在25 - 60%之间,而DBD肝移植是10 - 30%3]。传统的静态冷藏可以降低细胞代谢和体面的保护影响移植标准准则捐助者(SCD);然而,它并不工作满意的保存ECD器官,包括肝脏(DCD计划4]。因此,重要的是要探索新的策略来提高肝脏DCD计划的质量,减少术后胆道并发症,延长存活时间。

间充质干细胞(msc)已被证明有助于组织修复再生通过分泌细胞因子和细胞外囊泡(5- - - - - -8]。然而,msc的“家”受伤的组织能力是有争议的,因为大多数msc实际上是被困在肺毛细血管后静脉管理(5]。之前的研究表明,性常温机器灌注(NMP)可以促进骨髓间充质干细胞移植(BMMSCs)在肝脏,和血红素oxygenase-1 (HO-1)可以延长生存的BMMSCs受伤的网站(9,10]。因此,在目前的研究中,我们旨在注入HO-1-modified BMMSCs (HO-1 / BMMSCs)使用NMP进入肝脏。在非原位保存,NMP可以保持一个合理的正常代谢为肝脏提供氧气和营养,模拟生理环境在体外。与此同时,它还提高了BMMSCs的利用率。

Peribiliary腺体沿肝外(pbg)和大肝内胆管包含与多能干细胞和祖细胞属性,从而激活、增殖和分化修复受损胆管上皮细胞(11,12]。因此,我们旨在评估HO-1的修复效果/ BMMSCs结合在胆管IRI NMP以便肝移植,观察变化PBG细胞,进一步研究底层机制。

2。材料和方法

2.1。试剂

本研究利用杜尔贝科的修改鹰介质DMEM / F12培养基(Solarbio,北京);胎牛血清(擤鼻涕、卢瓦尔河谷、法国);BMMSC marker-related表面抗体(anti-rat集群分化34 - (CD34)异硫氰酸荧光素(FITC) anti-rat CD29——(整合素β亚基1 -)藻红蛋白(PE), anti-rat蛋白质酪氨酸磷酸酶受体C -型(CD45) PE、anti-rat CD90——(Thy-1细胞表面抗原)FITC anti-rat RT1A——(鼠MHC一级抗体)PE、和anti-rat RT1B——(鼠MHC II级抗体)FITC(美国BioLegend,圣地亚哥,CA));脂肪形成的和成骨分化培养基(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国);油红O (Dingguo昌盛生物技术,北京,中国;冯Kossa细胞染色装备(Genmed、上海、中国);老鼠的绿色荧光蛋白基因腺病毒(GFP-Adv GeneChem,中国上海);小鼠抗体识别囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)(美国圣克鲁斯、达拉斯、TX), SRY-box转录因子9 (SOX9) (Santa Cruz), Nanog (Santa Cruz)、增殖细胞核抗原(PCNA) (Santa Cruz),和Wnt3 (Santa Cruz);兔抗体识别β连环蛋白(Santa Cruz),血管内皮生长因子(VEGF) (Proteintech,武汉,中国),和occludin (Proteintech);紧密连接蛋白1 (TJP1,也称为ZO-1) (Proteintech,武汉,中国),caspase-3(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),和主动β连环蛋白(细胞信号技术);β肌动蛋白小鼠抗体(Beyotime、上海、中国);和xav - 939 (MedChemExpress蒙茅斯结,新泽西美国)。

2.2。动物

男性Sprague-Dawley (SD)老鼠从美国国立购买食品和药物控制(中国,北京)和标准实验室饲养的饮食和水。前不久闹老鼠(重约50克)是用来隔离BMMSCs和8-week-old老鼠(约220克)被用来创建原位肝移植(OLT)模型。二十个动物( 在每个实验组)被用于样品收集在OLT后第七天,24动物( 在每组)被用于存活率分析,20动物( 在虚假的组, 在每一个时间点(1 d, 7 d, 14 d)在NMP集团)用于生化分析、3动物被用于BMMSC冰冻切片跟踪,和3动物被用于BMMSC在活的有机体内跟踪。所有的动物实验是实验动物保健和使用指南,并经伦理委员会批准天津第一中心医院(许可证号码:2016 - 03 - a1)。

2.3。分离和鉴定HO-1 / BMMSCs

隔离、文化、识别、和基因转染BMMSCs如前所述[9,10]。骨髓内容提取大鼠股骨和胫骨和BMMSCs连续获得的附着力的方法(13]。腺病毒载体是用来使转染BMMSCs与结构表达绿色荧光蛋白(GFP)和/或HO-1。HO-1 / BMMSCs被分化成骨、脂肪形成的识别在体外。

2.4。肝脏DCD计划采购

如前所述(执行肝脏DCD计划采购14]。中线切口后,隔膜打开和胸主动脉是剪前肝素化后引起心脏骤停。经过30分钟的原位温暖的缺血,肝脏被冻得通红肝素化盐水通过门静脉切除和保留。门静脉插管灌注机连接。

根据不同的保存方法,肝脏、动物随机分为以下组:虚假的集团(虚假的操作),NMP组织(肝脏灌注NMP通过门静脉移植前4 h), BP集团(肝脏灌注NMP结合BMMSCs通过门静脉植入前4 h), 6组(肝脏灌注NMP结合HO-1 / BMMSCs通过门静脉植入前4 h),和XAV组(肝脏灌注是NMP结合HO-1 / BMMSCs通过门静脉移植前4 h,和腹腔内注射XAV - 939管理术后连续7天在5毫克/公斤/天)。xav Wnt / - 939是一种抑制剂β连环蛋白信号通路,降低β连环蛋白稳定轴蛋白。每组包括5个动物。

2.5。性常温机器灌注

NMP系统的组成是之前报道的一样10,14(图。S1)。灌流液的总量是80毫升。组件如下:60毫升的DMEM / F 12中含20%胎牛血清和20毫升的老鼠血液(红细胞容积灌流液是10 - 15%)。下列药物补充道:青霉素4000 - 8000 U (50 - 8000 U /毫升),链霉素4000 - 8000μg(50 - 100人μg / mL),肝素钠200 - 400 U (2 - 5 U /毫升)、地塞米松80 - 200μg (1 - 2.5μg / mL),胰岛素40 - 80 U (0.5 1 U /毫升)。

从捐赠者去除后,肝脏被连接到NMP系统通过门静脉支架(单一循环灌注)。机器灌注进行10 - 15毫升/分钟的流量了4小时,和灌注压力维持在900 - 1400 Pa。氧张力在门静脉维持在75 - 90毫米汞柱(10000 - 12000 Pa)。灌流液是含氧使用膜氧合器和保持在37-38°C。胆管插管收集胆汁。BMMSC或HO-1 / BMMSC单个细胞悬浮液(包含 )都被注射器注入通过门静脉插管。

2.6。肝移植模型

老鼠nonarterialized原位肝移植手术使用two-cuff技术[15]。suprahepatic下腔静脉是缝合的端到端。门静脉和infrahepatic腔静脉使用袖口被网状技术。通过支架胆管是网状的端到端。所有操作都是由相同的医生,和anhepatic时期 。

2.7。跟踪BMMSCs生活的老鼠

BMMSCs或HO-1 / BMMSCs与腺病毒载体转染表达绿色荧光蛋白(GFP /广告)通过NMP注入肝脏,然后追踪在活的有机体内在1^圣前一天,OLT使用小动物在活的有机体内成像系统(大师前体内荧光成像系统(剑桥研究与仪器有限公司(CRi)沃本,妈,美国))在肝移植后第一天。

2.8。生化检查

1动物牺牲^圣7^th,14^th肝移植后一天,血清样本收集下腔静脉的生化分析( 每组在每个时间点上)。水平的血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、gamma-glutamyl转肽酶(GGT)和总胆红素(治疗组)被发现使用一个自动生化分析仪(Cobas 800;罗氏诊断,瑞士巴塞尔)。

2.9。透射电子显微镜法

动物被牺牲在7^th天肝移植后样本集合。新鲜肝脏组织切成薄片 样品,固定在2.5%戊二醛,嵌入在环氧树脂,切成超薄部分。使用透射电子显微镜观察组织超微结构(HT7800、日立、东京、日本)。

2.10。组织学

动物( 每组)牺牲在7^th天肝移植后组织学检查。共同切除胆管分叉的左、右肝管的胆管吻合。肝脏组织切成薄片 样本。组织固定在10%福尔马林溶液,然后嵌入石蜡。连续3μ得到了部分和沾hematoxylin-eosin(他)。

2.11。免疫组织化学

动物被牺牲在7^th天肝移植后样本集合。部分deparaffinized使用二甲苯和水分梯度酒精系列。抗原检索是由微波加热在EDTA (pH值9.0)15分钟。组织幻灯片被孵化在H₂O₂30分钟阻断内源性过氧化物酶活性,进一步阻止5%正常山羊血清。一夜之间,幻灯片被孵化在4°C增殖细胞核抗原(1:300),主要抗体识别caspase-3 (1: 500), Nanog(1: 300),和SOX9 (1: 300)。之后,幻灯片被孵化与生物素化的二次抗体在室温下30分钟和streptavidin-horseradish过氧化物酶(合)在室温下30分钟。最后,幻灯片是沾diaminobenzidine (DAB)与苏木精复染色。阳性细胞的比例计算阳性细胞的百分比在空气层细胞的总数。所有组织学分析盲目手工计算在20个随机领域(放大10倍)。

2.12。免疫荧光分析

动物被牺牲在7^th天肝移植后样本集合。免疫荧光、幻灯片接受deparaffinization水合作用,抗原检索和阻塞的部分2.11。幻灯片在一夜之间被孵化在4°C主要抗体识别β连环蛋白(1:300),VEGF (1: 300), Nanog(1: 300),然后贴上isotype-specific二级抗体室温1小时。最后,幻灯片是复染色4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和荧光显微镜观察到。

2.13。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)

总RNA提取使用试剂盒试剂(豆类生物技术、志贺、日本),并使用cDNA逆转录互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类生物技术)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸被用作模板的实时定量PCR (qPCR)步骤使用的引物序列表中列出S1和结核病绿色预混料Taq交货(豆类生物技术)。Actb(编码β肌动蛋白)作为参考来正确表达水平( )并与基线( )。结果随着褶皱的变化( )(16]。

2.14。西方墨点法

总蛋白提取使用radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区,和phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)添加到防止蛋白降解。总蛋白浓度是决定使用bicinchoninic酸测定(BCA)。分离后钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),蛋白质被转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和屏蔽5%脱脂奶1小时。膜被孵化一夜之间在4°C主要抗体识别VEGF(1: 1000),细胞核抗原(1:1000),caspase-3 (1: 1000), Nanog (1: 500), SOX9(1: 1000),雌性生殖道(1:500),β连环蛋白(1:3000),活跃β连环蛋白(1:500)β肌动蛋白(1:3000)。膜清洗了TBST缓冲区(三羟甲基氨基甲烷缓冲液与氯化钠和渐变20)和相应的标记辅助孵化抗体(1:2000)在室温1小时。ChemiDoc XRS +系统(美国Bio-Rad大力神,CA)是用于检测和ImageJ 7.0软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)是用于分析的灰色值和计算相对蛋白质表达水平。

2.15。统计分析

所有使用SPSS统计分析进行了23(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。正态分布数据的表示 并使用单向方差分析或评估学生的两个示例测试。 被认为是具有统计学意义。GraphPad棱镜8 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)是用于数据的图形演示。

3所示。结果

3.1。识别BMMSCs和HO-1 / BMMSCs

HO-1 / BMMSCs shuttle-shaped外观排列在一个漩涡,与间充质干细胞(图的典型形态特征。S2A)。在不同的诱导条件下,HO-1 / BMMSCs可以分化成脂肪细胞或成骨细胞(图。S2 B, C),这表明他们有多能的潜力。HO-1 / BMMSCs表达间充质干细胞的特定生物标志物,和流式细胞术显示,超过99%的细胞阳性CD29, CD90、RT1-A,但消极CD34、CD45、和RT1-B(无花果。S2 D-F)。

转染后HO-1 /广告,BMMSCs显示没有改变他们的生物学特性,而HO-1显著增加(图的表达。S2 G H,我)。

3.2。HO-1结合NMP增加BMMSCs移植的移植肝脏

与正常肝脏,肝脏DCD计划(热缺血30分钟)是深紫色的瘀斑。NMP后,肝脏回到一个齐次黄色外观没有水肿(数字1(一)- - - - - -1 (c))。几分钟后植入,肝脏血流量和恢复显示红色的外观(图1 (d))。HO-1 / BMMSCs转染GFP注入,NMP可以观察到在活的有机体内在肝移植后第一天(数字1 (e)和1 (f))。BMMSCs的存在可能会在肝脏中发现7天冻结部分植入后在荧光显微镜下,和比BMMSCs HO-1 / BMMSCs栽种的道(数字1 (g)和1 (h))。西方墨点法在植入后第七天表明HO-1 HBP组的表达显著高于其他组(数字1(我)和1 (j)),这表明HO-1转染可能提高生存率的BMMSCs植入肝脏。

3.3。HO-1 / BMMSCs结合NMP长期的肝脏受者生存和改善肝功能

收件人NMP组的生存时间是最短的。HO-1 / BMMSCs结合NMP显著延长生存时间,效果更明显比BMMSCs结合NMP(图2(一个))。

NMP组的肝功能指数(ALT、AST、GGT、和治疗组)术后第一天迅速增加,逐步减少术后7天之后(图2 (b))。紧密连接(通过ZO-1起诉和occludin水平)小叶显然是胆管破坏与移植前(图2 (c)),这是胆红素的解剖学基础渗漏到血液中。术后7天,HO-1 / BMMSCs可能大大保护紧密连接(通过ZO-1起诉和occludin水平)从毁灭(数据2 (d)和2 (e))。

组织学显示严重的组织损伤胆总管(CBD)和肝内胆管NMP集团(IHBD)不连续的胆管上皮,胆管上皮细胞的腔,间质壁坏死,炎症细胞浸润,和几个再生胆道细胞(图3(一个))。细胞角蛋白19 (CK19)免疫组织化学染色显示阻塞的IHBD腔(图3(一个))。相比之下,大多数的胆管上皮HBP组显示恢复连续性没有中断,和大量的再生细胞观察胆管腔,这是改进的价格相比英国石油集团(数字3(一个)和3 (b))。水平的血清ALT、AST、GGT、治疗组6组显著低于其他组(图3 (c)),这表明HO-1 / BMMSCs结合NMP可以有效改善肝移植后肝功能。

3.4。百事装瓶集团参与胆道细胞的再生和修复胆管损伤

组织学显示严重损害空气层,管腔内的上皮细胞的破坏,点状的胆道细胞坏死,和少量的再生NMP胆道细胞组(图4(一))。相比之下,使细胞相对完好,一些细胞死亡的迹象,BP和6组,与一些百事装瓶集团的扩张,大量的再生胆道细胞观察,迁移到胆管腔通过百事装瓶集团之间的连接管和胆管腔(图4(一))。

此外,PBG HBP组的细胞表达VEGF(图4 (b)肝移植后)。百事装瓶集团还对血管内皮生长因子受体1 (VEGFR1)和受体2 (VEGFR2)(图4 (c)),这表明VEGF分泌使促进胆汁的生长细胞通过自分泌和旁分泌途径。

Caspase-3表达式中检测出百事装瓶集团和周围的基质细胞在肝移植后,指示激活凋亡通路(图4 (b))。caspase-3-positive PBG细胞的数量的虚假的集团( )明显低于在NMP集团( )。相比之下,caspase-3-positive PBG细胞减少BP集团( , ),虽然这6组下降更明显( , )(图4 (d))。激活caspase-3的比率(裂解caspase-3 (c-caspase-3)) caspase-3是最低的6组(图4 (b))。

免疫组织化学染色显示, 使细胞增殖细胞核抗原的表达虚假的集团,NMP组显著增加( , 比虚假的组)。比例进一步提高BP集团( , 与NMP集团),更重要的是增加HBP集团( , 与BP集团)(图4 (d))。这些结果表明,肝移植的过程中造成了严重的损伤胆管上皮细胞以及PBG细胞和HO-1 / BMMSCs提升百事装瓶集团残余细胞的增殖。

3.5。百事装瓶集团转型的细胞在增殖成熟表型和再生

探讨增殖和迁移PBG细胞的成熟,我们评估的表达SOX9,蛋白质同源框Nanog,雌性生殖道。SOX9是干细胞的一个标志,Nanog是一个转录因子密切相关的未分化的干细胞的自我更新,和雌性生殖道是一个运输机胆道细胞表面上的成熟。虚假的组,使细胞的比例表达SOX9, Nanog 和 ,分别(图5(一个)),这表明内胚层祖细胞的表型。SOX9, Nanog-positive细胞的比例增加NMP组( 和 ,)(图5(一个)- - - - - -5 (c)),显示胆道祖细胞的增殖。NMP组相比,细胞表达Nanog SOX9的比例在BP集团( 和 ,分别)和6组( 和 ,)进一步增加,增加HBP组最重要的(数据5(一个)- - - - - -5 (c))。Nanog和SOX9每组的表达与PCNA的一致,表明BMMSCs和HO-1 / BMMSCs提升百事装瓶集团的胆汁祖细胞的增殖。因此,表达式的雌性生殖道NMP组显著降低,表明大量成熟的胆管细胞被摧毁,而雌性生殖道的表达增加了英国石油公司和家庭血压组(数字5 (b)和5 (c)),这表明扩散胆汁从原始多能祖细胞分化成熟的胆道细胞表型,补充失去的胆道上皮细胞。

3.6。Wnt信号通路引起百事装瓶集团的增殖细胞和胆管损伤的修复

我们发现Wnt3 Wnt信号通路成员的表达,β连环蛋白和非β连环蛋白(活跃β连环蛋白)。结果表明,Wnt3的表达水平,β连环蛋白和活跃β连环蛋白在英国石油公司和家庭血压组明显高于那些虚假的和NMP组(数字5 (d)和5 (e))。

管理xav - 939 (Wnt信号通路的抑制剂)在活的有机体内明显的表达水平降低β连环蛋白和活跃β连环蛋白(图6(一)和6 (b))和抑制HO-1 / BMMSCs修复效果。的价格相比HBP集团,组织学显示胆道上皮损伤更严重,使细胞增殖减少XAV组(图6 (c));因此,肝功能(图6 (d))和紧密连接(数字6 (e)和6 (f))是更糟。XAV组VEGF和PCNA的表达水平下降,而那些caspase-3和c-caspase-3增加(图7(一))。Nanog的表达水平,SOX9,雌性生殖道也降低(数字7 (b)和7 (c))。免疫荧光染色显示xav - 939有效地退化β连环蛋白,从而抑制了古典Wnt信号通路和减少Nanog和VEGF的表达(数字7 (d)和7 (e)),即。,both the growth and stemness of PBG cells were inhibited. When the Wnt signaling pathway was inhibited, HO-1/BMMSCs could not fully play their role in damage repair, which suggested that HO-1/BMMSCs might promote the proliferation and differentiation of biliary progenitor cells by activating the Wnt signaling pathway (Fig.S3)。

4所示。讨论

以便肝脏遭受严重的IRI。肝脏失去氧气和营养供应循环被捕后,导致ATP耗竭和大量代谢废物的积累。此外,氧气流入在再灌注导致活性氧的生产,广泛的炎症通路激活,细胞死亡。IRI是一个重要因素导致移植后胆管并发症(14),从而导致移植物功能障碍和需要再移植在严重的情况下。因此,在这个前提下,我们已经开发出一种新方法显示的潜力减少胆道缺血再灌注造成的损害的啮齿动物。

BMMSCs有免疫调节功能和组织修复,促使他们使用广泛的兴趣在器官移植领域(17,18]。然而,BMMSC应用程序仍然面临两个未解决的和不可避免的问题。首先,尽管BMMSCs可以迁移到受伤的网站指引下趋化因子,大量BMMSCs被困在肺毛细血管后静脉管理(19,20.),导致细胞达到受伤的网站相对较少。第二,BMMSCs道在接受者在短时间内将被清除,通常不超过24小时(21]。

为了解决这两个问题,我们优化BMMSC疗法在两个方面。首先,我们结合细胞疗法与NMP增加移植的BMMSCs肝脏。在我们之前的研究中,我们建立了一个NMP系统和验证,它保护肝脏移植从IRI相比静态冷藏和观察到由NMP系统没有添加额外的伤害(13]。NMP模拟肝脏的生理环境,洗了代谢废物;补充氧气、营养物质和代谢底物;和维护正常的肝脏代谢在最大程度上(22]。除了这对肝移植的保护作用,我们用NMP作为BMMSCs通过门静脉灌注的方法。与传统静脉管理相比,这种新策略增加了移植率BMMSCs在肝脏和改善肝脏DCD计划的质量非原位保存。其次,为了解决这个问题BMMSCs在宿主体内的存活时间短,我们中血红素oxygenase-1 BMMSCs (HO-1)。HO-1是病原反应酶催化血红素转换成胆绿素,具有抗氧化和抗炎功能(23),可以作为一个cytoprotective分子(24]。我们使用这个策略有效地延长生存时间的BMMSCs在肝脏。我们的研究表明,HO-1 / BMMSCs优于BMMSCs肝功能、组织学和接受者的生存时间。

我们建立了一个老鼠的肝移植模型中一个巨大的失去肝外胆道上皮和大肝内胆管发生因为严重的缺血再灌注损伤。HO-1 / BMMSCs管理后,胆汁祖细胞的增殖空气层和修复后的胆管IRI以便观察肝移植。使细胞被激活后胆管损伤修复受伤的胆道上皮细胞,这是符合导致胆管疾病的其他模型(11,25]。这些研究,目前的研究表明,百事装瓶集团作为保管人的胆汁祖细胞上皮损伤后再生。百事装瓶集团小角落分布沿肝内和肝外胆管,分泌粘液和酶维持胆道上皮细胞的生理功能(26]。他们也作为利基胆汁的祖细胞,维护更新和再生的胆道上皮27]。PBG受伤的程度成正比,肝移植术后胆管狭窄的发生率[28),这表明百事装瓶集团是一个重要的结构和功能完整性保证胆管损伤的修复。我们的研究验证百事装瓶集团的核心作用严重胆管损伤的修复,并提供新的见解修复通路和肝移植后胆管损伤的机理。

我们发现HO-1 / BMMSCs提升百事装瓶集团的增殖和抑制细胞凋亡。通常情况下,使小腺泡安排在集群。IRI后肝移植模型,大多数百事装瓶集团都被摧毁,而且很少有扩张。百事装瓶集团提出了更完整的形状和显示政府HO-1 / BMMSCs后更明显扩张。百事装瓶集团扩张的现象可能是由于高水平的细胞增殖。HO-1 / BMMSCs管理后,使细胞表达高水平的VEGF,空气层也表达了VEGF受体。因此,VEGF分泌百事装瓶集团不仅促进邻近的血管内皮细胞的增殖,但百事装瓶集团还自分泌和旁分泌作用于细胞,增加他们的增殖和诱导从静态表型转换到一个活跃的表型。这一现象表明,生长因子VEGF还与核扩散有关胆道细胞(29日]。我们发现HO-1 / BMMSCs与不仅使细胞的增殖,也多能细胞比例的增加百事装瓶集团。目前没有明确的证据证明这些变化是如何发生的;因此,还需要进一步的深入研究。

Wnt信号起着至关重要的作用在动物胚胎发育、组织再生等生理过程。Wnt是一种分泌蛋白,细胞之间传递信号。Wnt信号通路被激活时,β连环蛋白在细胞质中积累,然后进入细胞核作为转录因子(30.]。Wnt信号通路控制干细胞的生长和命运。Wnt通路的激活增加成人干细胞的数量,同时保留其分化潜力和维持自我更新(31日]。Nanog是蛋白质的一个主要负责维护的多能性干细胞和只是表达多能细胞(32]。在Wnt通路的激活,β连环蛋白作为转录因子上调Nanog表达式[33,34]。VEGF也是目标之一Wnt通路的基因,然后呢β连环蛋白调节其表达通过绑定到其启动子(35,36]。我们发现HO-1 / BMMSCs与Wnt通路的激活有关,对应于胆道祖细胞的增殖和多能性。增生性胆道祖细胞迁移到受伤的网站,从原始多能表型分化成熟胆道上皮细胞表型离开干细胞利基由Wnt维护后,由增加表达式验证后的雌性生殖道HO-1 / BMMSCs管理工作。

以前,人们认为间充质干细胞(msc)迁移到受伤的网站和分化成功能性细胞来修复受损组织(37]。然而,一些msc道靶器官静脉注射后,这是不足以修复(20.),建议msc不执行通过分化组织修复功能。在1970年代,德克斯特et al。38)使用来源于附着的骨细胞成功地保持自我更新,造血干细胞的增殖和分化潜力。这些来源于附着的骨细胞,今天被称为BMMSCs,也被称为骨髓基质细胞。德克斯特等人的研究表明,BMMSCs提供必要的自我更新和分化的多能细胞微环境。BMMSCs可能改变组织微环境以旁分泌的方式。BMMSCs分泌大量的积极因素,促进增殖,刺激血管生成,抑制细胞凋亡和炎症(39]。值得注意的是,这些因素也维持多能性和刺激内源性干细胞和祖细胞的增殖修复损伤(40]。我们假设BMMSCs影响胆汁祖细胞的增殖和分化激活Wnt信号通路在胆汁微环境,支持上述观点。因此,BMMSCs分泌活性因子和细胞因子的能力来改变组织微环境可能是组织修复的一个重要机制。

BMMSCs可能提高两个百事装瓶集团干细胞性质的细胞通过Wnt信号:多能性,表现为积极Nanog表达,广泛和增殖的能力,观察肝移植模型胆汁祖细胞迅速增殖和分化恢复胆道上皮细胞。在这项研究中,我们提供了证据支持,优化BMMSCs推广扩散,迁移,和成熟的内源性胆祖细胞在百事装瓶集团通过激活Wnt通路修复胆管损伤后肝移植。这一发现为胆管损伤的病理生理学修复提供证据在肝移植DCD计划和建议一种新的方式来扩大安全的肝移植应用程序。然而,口译和笔译的临床结果应该仔细考虑。胆道并发症发生在人类通常几个月后移植后,但我们观察组织学手术后7天。尽管生存分析足够长,我们没有澄清的动物死亡的原因。需要更多的研究证明新策略是否有效地减少移植后胆道并发症的发生,改善肝脏DCD计划的质量,解决了捐赠资源短缺的问题。此外,这种啮齿动物模型的结果可能不是直接翻译人类和需要验证。总而言之,我们相信,我们的研究结果提供了一个新的见解在肝移植胆道损伤的病理生理学和现在的新机遇,扩大安全利用的肝脏移植。

5。结论

我们成功地建立了一种改进方法,干细胞疗法结合机械灌注保存器官。NMP增加BMMSCs的移植肝脏,和转染基因编码HO-1 BMMSCs延长了生存时间的接受者。HO-1 / BMMSCs结合NMP显示潜在的修复胆管IRI和大鼠肝移植模型DCD计划改善预后。机制可能是HO-1 / BMMSCs激活Wnt通路保持胆汁祖细胞多能性的空气层,增殖,迁移,和成熟。这项研究提供了有价值的实验依据,提高肝脏DCD计划的质量,减少术后胆道并发症,提高长期生存率。

缩写

ALT:	丙氨酸转氨酶
AST:	天冬氨酸转氨酶
BMMSCs:	骨髓间充质干细胞
英国石油公司:	BMMSCs + NMP
β猫:	β连环蛋白
雌性生殖道:	囊性纤维化跨膜电导调节
以便:	捐助者循环死后
GGT:	Gamma-glutamyl转肽酶
HO-1:	血红素oxygenase-1
6:	HO-1 / BMMSCs + NMP
NMP:	性常温机器灌注
百事装瓶集团:	Peribiliary腺
PCNA:	增殖细胞核抗原
SOX9:	SRY-box转录因子9
治疗组:	总胆红素
VEGF:	血管内皮生长因子
VEGFR1:	血管内皮生长因子受体1
VEGFR2:	血管内皮生长因子受体2。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

H.S. Z.S.的构思和设计实验,他们的贡献同样工作;X.T.,H.C., L. W, W.Z., M.Y., H.S., and Z.S. conducted the experiments and obtained the results; X.T., H.S., and Z.S. sorted and analyzed the results; X.T. and H.S. wrote the draft; X.T., H.S., and Z.S. extensively revised, formatted, and submitted versions of the manuscript. All authors participated in data discussions and have seen and approved the submitted version of the manuscript.

确认

支持的工作是由中国国家自然科学基金(82070639,81670574,81670574,81270528)。

补充材料

表S1:引物存在。图S1: NMP图。图S2: HO-1 / BMMSCs的形态和特征。(一)HO-1 / BMMSCs细胞附着长梭形。(B) HO-1 / BMMSCs可以分化成成骨细胞在体外。(C) HO-1 / BMMSCs可以分化成脂肪细胞在体外。(D-F) HO-1 / bmsc CD29阳性,CD90、RT1-A和消极的对CD34、CD45 RT1-B使用流式细胞仪。(G, H)免疫印迹和PCR证实HO-1 HO-1 / BMMSCs超表达。(我)HO-1 / BMMSCs与腺病毒载体转染表达绿色荧光蛋白的荧光。图S3:原理图的机制HO-1 / BMMSCs调制PBG细胞修复损伤。(补充材料)

引用

1. k . Jayant Reccia, f .圈养,a·m·j·夏皮罗”的角色性常温灌注在肝移植(交通研究):系统回顾的初步研究”HPB手术ID 6360423条,卷。2018年,14页,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. Noack k . s . f . Bronk a加藤,和g·j·戈尔的脆弱性越大胆管细胞缺氧复氧损伤比。影响肝移植术后胆道狭窄的发病机理,“移植卷,56号3、495 - 499年,1993页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. d·p·弗利·l·a·费尔南德斯·g·Leverson et al .,“肝移植术后胆道并发症后从捐赠心脏死亡捐赠者:风险因素的分析和长期的结果从一个中心,”年报的手术,卷253,不。4、817 - 825年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. op穴干,n . Karimian a.c. Westerkamp et al .,“性常温机器灌注降低胆管损伤和改善胆道上皮功能在大鼠供体肝脏,”肝移植,22卷,不。7,994 - 1005年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. b .基督,美国布鲁克纳,s·温克勒”承诺的间充质干细胞治疗肝脏修复,”分子医学的趋势,21卷,不。11日,第686 - 673页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. b . Li烹调的菜肴,j . Chen等人”的MSC-derived exosomal lncRNA段H19促进伤口愈合在糖尿病足溃疡上调PTEN通过微rna - 152 - 3 - p,”摩尔其他核酸,19卷,第826 - 814页,2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. p .耿,y, h . Zhang et al .,“HGF-modified牙髓干细胞减轻炎症和纤维化该文就近年来关于百草枯所致急性呼吸窘迫综合征,发生反应”干细胞国际卷,2021篇文章ID 6662831, 15页,2021年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. r·d·铪锆石m . v . Branquinho a·c·苏萨et al .,”结合使用壳聚糖和嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞促进周围神经再生的体内,“干细胞国际ID 6613029条,卷。2021年,32页,2021年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. d .阳光、曹h . l .杨et al。”米尔- 200 b在血红素oxygenase-1-modified骨髓间充质干细胞——导出液减轻炎症损伤的肠道上皮细胞通过瞄准高机动组框3”细胞死亡和疾病,11卷,不。6,480年,页2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 曹h . l .杨b .侯et al .,“血红素oxygenase-1-modified骨髓间充质干细胞结合性常温机器灌注保护循环死后捐献肝脏移植,”干细胞研究与治疗,11卷,不。1,p。218年,2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. g . Carpino l .痣d Overi et al .,“Peribiliary腺利基胆道参与再生在老鼠和人类原发性硬化性胆管炎,“肝脏病学,卷71,不。3、972 - 989年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. g . Carpino诉Cardinale, p . Onori et al .,“干/祖细胞腺的肝外胆道和intraheptic胆管解剖原位研究的成熟血统的证据,”解剖学杂志,卷220,不。2、186 - 199年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. l .杨·h·曹,d .太阳et al .,“性常温机器灌注结合骨髓间充质干细胞改善大鼠氧化应激反应和线粒体功能循环死后捐献肝脏,”干细胞与发展卷,29号13日,835 - 852年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. l .杨·h·曹,d .太阳et al .,“骨髓间充质干细胞结合性常温机器灌注改善大鼠供肝质量重要作用的肝微循环循环死后捐赠,”细胞和组织的研究,卷381,不。2、239 - 254年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. n Kamada和r . y . Calne”,在大鼠原位肝移植。技术使用袖口门静脉吻合胆道引流,”移植,28卷,不。1,47-50,1979页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. k . j . Livak和t . d . Schmittgen相对基因表达数据的分析利用实时定量PCR和2^−ΔΔC_T方法。”方法,25卷,不。4、402 - 408年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. n的歌,m . Scholtemeijer和k·沙阿,“间充质干细胞免疫调节:机制和治疗的潜力,”药理科学趋势第41卷。。9日,第664 - 653页,2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. m . Vandermeulen p . Erpicum l . Weekers et al .,”在实体器官移植间充质基质细胞移植,卷104,不。5,923 - 936年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 诉Sordi”,间充质干细胞归巢能力。”移植,卷87,不。9,S42-S45, 2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. r·h·李,a . a . Pulin m . j . Seo et al .,“静脉hMSCs提高小鼠的心肌梗死,因为细胞在肺栓塞是分泌抗炎蛋白TSG-6激活,“细胞干细胞,5卷,不。1,54 - 63年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. e . Eggenhofer诉Benseler, a .获得et al .,“间充质干细胞是短暂的,不迁移在肺部静脉输液后,“免疫学前沿,3卷,297页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. d . Detelich和j·f·Markmann肝脏灌注机的黎明。”目前看来在器官移植,23卷,不。2、151 - 161年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. m·d·玛蒂”,血红素加氧酶系统:第二信使气体的监管机构,”药理学和毒理学的年度审查,37卷,不。1,第554 - 517页,1997。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. r . Hinkel·兰格b·彼得森et al .,“血红素Oxygenase-1心脏保护通过基因治疗提供了缺血后炎症的控制:一个临床前猪模型的试验研究,“美国心脏病学会杂志》上,卷66,不。2、154 - 165年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. 即m·德容a . p . m . Matton j·b·范Praagh et al .,“Peribiliary腺体是人类胆道上皮再生的关键严重胆管损伤后,“肝脏病学,卷69,不。4、1719 - 1734年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. t .松原,k . Kozaka o .松井et al .,“Peribiliary腺:开发、功能障碍、相关条件和影像学表现,”Abdom Radiol(纽约),45卷,不。2、416 - 436年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. g . Lanzoni诉Cardinale, g . Carpino“肝、胆道和胰腺干细胞/祖细胞在人类领域:网络新参考系疾病和再生,”肝脏病学,卷64,不。1,第286 - 277页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. 美国op穴干,a·c·Westerkamp n Karimian et al .,“受伤peribiliary腺体和血管丛肝移植前预测non-anastomotic胆道狭窄的形成,“肝脏病学杂志,60卷,不。6,1172 - 1179年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. e·高迪奥b·巴巴罗d Alvaro et al .,“血管内皮生长因子刺激老鼠cholangiocyte扩散通过自分泌机制,“胃肠病学,卷130,不。4、1270 - 1282年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. h .聪明和r . Nusse Wnt /β连环蛋白信号和疾病。”细胞,卷149,不。6,1192 - 1205年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. Wnt / r . Nusse和h聪明。β连环蛋白信号、疾病、和新兴的治疗方法,”细胞,卷169,不。6,985 - 999年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. g .锅和j·a·汤姆森Nanog在胚胎干细胞多能性和转录网络,”细胞研究,17卷,不。1,42-49,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. j·雷,t . Kalkan就“同名同姓,s Gomez-Lopez et al .,“抑制糖原合成酶激酶3缓解Tcf3镇压的多能性网络和胚胎干细胞分化阻力增加,”自然细胞生物学,13卷,不。7,838 - 845年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. 佐藤n, l·梅耶尔l . Skaltsounis·格林加德和a . h . Brivanlou”维护人类和小鼠胚胎干细胞多能性的通过激活Wnt信号的药理GSK-3-specific抑制剂,”自然医学,10卷,不。1,55 - 63、2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. x张j.p.,加斯帕德和特区涌,“调控血管内皮生长因子的Wnt和k - ras基因通路在结肠肿瘤,”癌症研究,卷61,不。16,6050 - 6054年,2001页。视图:谷歌学术搜索
36. 诉终极,s h·李,l .英奇et al .,“β-连环蛋白调节血管内皮生长因子表达在结肠癌,”癌症研究,卷63,不。12日,第3153 - 3145页,2003年。视图:谷歌学术搜索
37. j·l·spe r·h·李和c·a·格雷戈里,“间充质干细胞/基质细胞功能的机制”,干细胞研究与治疗,7卷,不。1,p。125年,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. t·m·德克斯特·m·a·摩尔,a·p·谢里丹”维持造血干细胞的分化后代和生产同种异体和semiallogeneic骨髓体外嵌合体,”《实验医学杂志》上,卷145,不。6,1612 - 1616年,1977页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. t . Schinkothe、w·布洛赫和a·施密特”人类间充质干细胞体外分泌的,”干细胞与发展,17卷,不。1,第206 - 199页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. d . g . Phinney和d . j . Prockop”,简洁的评论:间充质干/多功能基质细胞:分化转移的状态和组织修复模式,当前视图”干细胞,25卷,不。11日,第2902 - 2896页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2021年宣田等。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。