1。介绍
肝移植是一个拯救生命的治疗终末期肝病患者;然而,器官短缺目前成功治疗的最大障碍,这直接导致死亡的每年成千上万的病人在等候名单(
1 ]。目前许多肝移植中心接受延长移植标准捐助者(ECD),其中很大一部分是捐助者循环死后(论证)。肝脏DCD计划的特点是,他们接受较长的比肝脏热缺血期脑死亡后,从捐助者(DBD)和更容易缺血再灌注损伤(IRI)。与肝实质细胞相比,胆道上皮细胞有较低的宽容IRI由于缺乏自我保护的抗氧化剂如过氧化氢酶和减少谷胱甘肽(
2 ]。胆道并发症是重要的影响因素肝移植的存活率和长期的结果。以便决定肝移植后胆道并发症的发生率在25 - 60%之间,而DBD肝移植是10 - 30%
3 ]。传统的静态冷藏可以降低细胞代谢和体面的保护影响移植标准准则捐助者(SCD);然而,它并不工作满意的保存ECD器官,包括肝脏(DCD计划
4 ]。因此,重要的是要探索新的策略来提高肝脏DCD计划的质量,减少术后胆道并发症,延长存活时间。
间充质干细胞(msc)已被证明有助于组织修复再生通过分泌细胞因子和细胞外囊泡(
5 - - - - - -
8 ]。然而,msc的“家”受伤的组织能力是有争议的,因为大多数msc实际上是被困在肺毛细血管后静脉管理(
5 ]。之前的研究表明,性常温机器灌注(NMP)可以促进骨髓间充质干细胞移植(BMMSCs)在肝脏,和血红素oxygenase-1 (HO-1)可以延长生存的BMMSCs受伤的网站(
9 ,
10 ]。因此,在目前的研究中,我们旨在注入HO-1-modified BMMSCs (HO-1 / BMMSCs)使用NMP进入肝脏。在
非原位 保存,NMP可以保持一个合理的正常代谢为肝脏提供氧气和营养,模拟生理环境
在体外 。与此同时,它还提高了BMMSCs的利用率。
Peribiliary腺体沿肝外(pbg)和大肝内胆管包含与多能干细胞和祖细胞属性,从而激活、增殖和分化修复受损胆管上皮细胞(
11 ,
12 ]。因此,我们旨在评估HO-1的修复效果/ BMMSCs结合在胆管IRI NMP以便肝移植,观察变化PBG细胞,进一步研究底层机制。
2。材料和方法
2.1。试剂
本研究利用杜尔贝科的修改鹰介质DMEM / F12培养基(Solarbio,北京);胎牛血清(擤鼻涕、卢瓦尔河谷、法国);BMMSC marker-related表面抗体(anti-rat集群分化34 - (CD34)异硫氰酸荧光素(FITC) anti-rat CD29——(整合素β亚基1 -)藻红蛋白(PE), anti-rat蛋白质酪氨酸磷酸酶受体C -型(CD45) PE、anti-rat CD90——(Thy-1细胞表面抗原)FITC anti-rat RT1A——(鼠MHC一级抗体)PE、和anti-rat RT1B——(鼠MHC II级抗体)FITC(美国BioLegend,圣地亚哥,CA));脂肪形成的和成骨分化培养基(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国);油红O (Dingguo昌盛生物技术,北京,中国;冯Kossa细胞染色装备(Genmed、上海、中国);老鼠的绿色荧光蛋白基因腺病毒(GFP-Adv GeneChem,中国上海);小鼠抗体识别囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)(美国圣克鲁斯、达拉斯、TX), SRY-box转录因子9 (SOX9) (Santa Cruz), Nanog (Santa Cruz)、增殖细胞核抗原(PCNA) (Santa Cruz),和Wnt3 (Santa Cruz);兔抗体识别
β 连环蛋白(Santa Cruz),血管内皮生长因子(VEGF) (Proteintech,武汉,中国),和occludin (Proteintech);紧密连接蛋白1 (TJP1,也称为ZO-1) (Proteintech,武汉,中国),caspase-3(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),和主动
β 连环蛋白(细胞信号技术);
β 肌动蛋白小鼠抗体(Beyotime、上海、中国);和xav - 939 (MedChemExpress蒙茅斯结,新泽西美国)。
2.2。动物
男性Sprague-Dawley (SD)老鼠从美国国立购买食品和药物控制(中国,北京)和标准实验室饲养的饮食和水。前不久闹老鼠(重约50克)是用来隔离BMMSCs和8-week-old老鼠(约220克)被用来创建原位肝移植(OLT)模型。二十个动物(
n
=
5
在每个实验组)被用于样品收集在OLT后第七天,24动物(
n
=
6
在每组)被用于存活率分析,20动物(
n
=
5
在虚假的组,
n
=
5
在每一个时间点(1 d, 7 d, 14 d)在NMP集团)用于生化分析、3动物被用于BMMSC冰冻切片跟踪,和3动物被用于BMMSC
在活的有机体内 跟踪。所有的动物实验是实验动物保健和使用指南,并经伦理委员会批准天津第一中心医院(许可证号码:2016 - 03 - a1)。
2.3。分离和鉴定HO-1 / BMMSCs
隔离、文化、识别、和基因转染BMMSCs如前所述[
9 ,
10 ]。骨髓内容提取大鼠股骨和胫骨和BMMSCs连续获得的附着力的方法(
13 ]。腺病毒载体是用来使转染BMMSCs与结构表达绿色荧光蛋白(GFP)和/或HO-1。HO-1 / BMMSCs被分化成骨、脂肪形成的识别
在体外 。
2.4。肝脏DCD计划采购
如前所述(执行肝脏DCD计划采购
14 ]。中线切口后,隔膜打开和胸主动脉是剪前肝素化后引起心脏骤停。经过30分钟的
原位 温暖的缺血,肝脏被冻得通红肝素化盐水通过门静脉切除和保留。门静脉插管灌注机连接。
根据不同的保存方法,肝脏、动物随机分为以下组:虚假的集团(虚假的操作),NMP组织(肝脏灌注NMP通过门静脉移植前4 h), BP集团(肝脏灌注NMP结合BMMSCs通过门静脉植入前4 h), 6组(肝脏灌注NMP结合HO-1 / BMMSCs通过门静脉植入前4 h),和XAV组(肝脏灌注是NMP结合HO-1 / BMMSCs通过门静脉移植前4 h,和腹腔内注射XAV - 939管理术后连续7天在5毫克/公斤/天)。xav Wnt / - 939是一种抑制剂
β 连环蛋白信号通路,降低
β 连环蛋白稳定轴蛋白。每组包括5个动物。
2.5。性常温机器灌注
NMP系统的组成是之前报道的一样
10 ,
14 (图。
S1 )。灌流液的总量是80毫升。组件如下:60毫升的DMEM / F 12中含20%胎牛血清和20毫升的老鼠血液(红细胞容积灌流液是10 - 15%)。下列药物补充道:青霉素4000 - 8000 U (50 - 8000 U /毫升),链霉素4000 - 8000
μ g(50 - 100人
μ g / mL),肝素钠200 - 400 U (2 - 5 U /毫升)、地塞米松80 - 200
μ g (1 - 2.5
μ g / mL),胰岛素40 - 80 U (0.5 1 U /毫升)。
从捐赠者去除后,肝脏被连接到NMP系统通过门静脉支架(单一循环灌注)。机器灌注进行10 - 15毫升/分钟的流量了4小时,和灌注压力维持在900 - 1400 Pa。氧张力在门静脉维持在75 - 90毫米汞柱(10000 - 12000 Pa)。灌流液是含氧使用膜氧合器和保持在37-38°C。胆管插管收集胆汁。BMMSC或HO-1 / BMMSC单个细胞悬浮液(包含
1
- - - - - -
3
×
10
7
细胞
)被注射器注入通过门静脉插管注入。
2.6。肝移植模型
老鼠nonarterialized原位肝移植手术使用two-cuff技术[
15 ]。suprahepatic下腔静脉是缝合的端到端。门静脉和infrahepatic腔静脉使用袖口被网状技术。通过支架胆管是网状的端到端。所有操作都是由相同的医生,和anhepatic时期
21
±
2
分钟
。
2.7。跟踪BMMSCs生活的老鼠
BMMSCs或HO-1 / BMMSCs与腺病毒载体转染表达绿色荧光蛋白(GFP /广告)通过NMP注入肝脏,然后追踪
在活的有机体内 在1圣 前一天,OLT使用小动物
在活的有机体内 成像系统(大师前体内荧光成像系统(剑桥研究与仪器有限公司(CRi)沃本,妈,美国))在肝移植后第一天。
2.8。生化检查
1动物牺牲圣 7th ,14th 肝移植后一天,血清样本收集下腔静脉的生化分析(
n
=
5
每组在每个时间点上)。水平的血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、gamma-glutamyl转肽酶(GGT)和总胆红素(治疗组)被发现使用一个自动生化分析仪(Cobas 800;罗氏诊断,瑞士巴塞尔)。
2.9。透射电子显微镜法
动物被牺牲在7th 天肝移植后样本集合。新鲜肝脏组织切成薄片
1
×
1
×
2
米
米
3
样品,固定在2.5%戊二醛,嵌入在环氧树脂,切成超薄部分。使用透射电子显微镜观察组织超微结构(HT7800、日立、东京、日本)。
2.10。组织学
动物(
n
=
5
每组)牺牲在7th 天肝移植后组织学检查。共同切除胆管分叉的左、右肝管的胆管吻合。肝脏组织切成薄片
2
×
2
×
1
c
米
3
样本。组织固定在10%福尔马林溶液,然后嵌入石蜡。连续3
μ 得到了部分和沾hematoxylin-eosin(他)。
2.11。免疫组织化学
动物被牺牲在7th 天肝移植后样本集合。部分deparaffinized使用二甲苯和水分梯度酒精系列。抗原检索是由微波加热在EDTA (pH值9.0)15分钟。组织幻灯片被孵化在H2 O2 30分钟阻断内源性过氧化物酶活性,进一步阻止5%正常山羊血清。一夜之间,幻灯片被孵化在4°C增殖细胞核抗原(1:300),主要抗体识别caspase-3 (1: 500), Nanog(1: 300),和SOX9 (1: 300)。之后,幻灯片被孵化与生物素化的二次抗体在室温下30分钟和streptavidin-horseradish过氧化物酶(合)在室温下30分钟。最后,幻灯片是沾diaminobenzidine (DAB)与苏木精复染色。阳性细胞的比例计算阳性细胞的百分比在空气层细胞的总数。所有组织学分析盲目手工计算在20个随机领域(放大10倍)。
2.12。免疫荧光分析
动物被牺牲在7th 天肝移植后样本集合。免疫荧光、幻灯片接受deparaffinization水合作用,抗原检索和阻塞的部分
2.11 。幻灯片在一夜之间被孵化在4°C主要抗体识别
β 连环蛋白(1:300),VEGF (1: 300), Nanog(1: 300),然后贴上isotype-specific二级抗体室温1小时。最后,幻灯片是复染色4
′
6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和荧光显微镜观察到。
2.13。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)
总RNA提取使用试剂盒试剂(豆类生物技术、志贺、日本),并使用cDNA逆转录互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类生物技术)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸被用作模板的实时定量PCR (qPCR)步骤使用的引物序列表中列出
S1 和结核病绿色预混料Taq交货(豆类生物技术)。
Actb (编码
β 肌动蛋白)作为参考来正确表达水平(
Δ
Ct
与基线相比)和(
Δ
Δ
Ct
)。结果随着褶皱的变化(
2
−
Δ
Δ
Ct
)[
16 ]。
2.14。西方墨点法
总蛋白提取使用radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区,和phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)添加到防止蛋白降解。总蛋白浓度是决定使用bicinchoninic酸测定(BCA)。分离后钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),蛋白质被转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和屏蔽5%脱脂奶1小时。膜被孵化一夜之间在4°C主要抗体识别VEGF(1: 1000),细胞核抗原(1:1000),caspase-3 (1: 1000), Nanog (1: 500), SOX9(1: 1000),雌性生殖道(1:500),
β 连环蛋白(1:3000),活跃
β 连环蛋白(1:500)
β 肌动蛋白(1:3000)。膜清洗了TBST缓冲区(三羟甲基氨基甲烷缓冲液与氯化钠和渐变20)和相应的标记辅助孵化抗体(1:2000)在室温1小时。ChemiDoc XRS +系统(美国Bio-Rad大力神,CA)是用于检测和ImageJ 7.0软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)是用于分析的灰色值和计算相对蛋白质表达水平。
2.15。统计分析
所有使用SPSS统计分析进行了23(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。正态分布数据的表示
的意思是
±
标准
偏差
并使用单向方差分析或评估学生的两个示例
t
测试。
P
<
0.05
被认为是具有统计学意义。GraphPad棱镜8 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)是用于数据的图形演示。
3所示。结果
3.1。识别BMMSCs和HO-1 / BMMSCs
HO-1 / BMMSCs shuttle-shaped外观排列在一个漩涡,与间充质干细胞(图的典型形态特征。
S2A )。在不同的诱导条件下,HO-1 / BMMSCs可以分化成脂肪细胞或成骨细胞(图。
S2 B, C ),这表明他们有多能的潜力。HO-1 / BMMSCs表达间充质干细胞的特定生物标志物,和流式细胞术显示,超过99%的细胞阳性CD29, CD90、RT1-A,但消极CD34、CD45、和RT1-B(无花果。
S2 D-F )。
转染后HO-1 /广告,BMMSCs显示没有改变他们的生物学特性,而HO-1显著增加(图的表达。
S2 G H,我 )。
3.2。HO-1结合NMP增加BMMSCs移植的移植肝脏
与正常肝脏,肝脏DCD计划(热缺血30分钟)是深紫色的瘀斑。NMP后,肝脏回到一个齐次黄色外观没有水肿(数字
1(一) - - - - - -
1 (c) )。几分钟后植入,肝脏血流量和恢复显示红色的外观(图
1 (d) )。HO-1 / BMMSCs转染GFP注入,NMP可以观察到
在活的有机体内 在肝移植后第一天(数字
1 (e) 和
1 (f) )。BMMSCs的存在可能会在肝脏中发现7天冻结部分植入后在荧光显微镜下,和比BMMSCs HO-1 / BMMSCs栽种的道(数字
1 (g) 和
1 (h) )。西方墨点法在植入后第七天表明HO-1 HBP组的表达显著高于其他组(数字
1(我) 和
1 (j) ),这表明HO-1转染可能提高生存率的BMMSCs植入肝脏。
图1
过程方法的肝移植和移植的骨髓间充质干细胞在移植肝脏。粉色(a)正常肝,均匀的外观。(b)热缺血30分钟后,肝脏与异构暗紫色区域拥挤。(c) NMP 4 h后,肝脏是黄棕没有堵塞。(d)肝脏的血流量是植入后,恢复肝脏的外观基本上恢复正常。
在活的有机体内 (e)和
在体外 BMMSCs (f)成像显示移植的肝脏。冻结部分显示的存活率HO-1 / BMMSCs (g)在肝脏高于BMMSCs (h)。西方墨点法(我)和PCR (j)显示高HO-1表达式HBP组肝移植术后7天(
n
=
3
)。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。以便决定:捐助者循环死后;NMP:性常温机器灌注;BMMSCs:骨髓间充质干细胞;HO-1:血红素oxygenase-1;6:HO-1 / BMMSCs + NMP。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
(g)
![]()
(h)
![]()
(我)
![]()
(j)
![]()
3.3。HO-1 / BMMSCs结合NMP长期的肝脏受者生存和改善肝功能
收件人NMP组的生存时间是最短的。HO-1 / BMMSCs结合NMP显著延长生存时间,效果更明显比BMMSCs结合NMP(图
2(一个) )。
图2
生存,肝功能及胆汁的肝移植受者小导管超微结构。(a)的肝移植受者存活曲线(
n
=
6
每组)。HO-1 / BMMSCs结合NMP提高受者的生存时间。平均存活时间的骗局,NMP、英国石油公司和家庭血压组> 60天,17.5天,42.5天,分别和> 60天。(b)的肝脏功能NMP集团1日7日和术后第14天(
n
=
5
)。ALT和AST值达到峰值在术后第一天和第七天治疗组。术后7天之后,所有索引逐渐趋于平稳。(c)术后第七天,透射电子显微镜(TEM)显示紧密连接的破坏(白色椭圆)较正常肝小叶肝移植术后胆管。西方墨点法(d)和PCR (e)表明,紧密连接蛋白的表达水平(HBP ZO-1和occludin)组高于BP和NMP组(
n
=
3
)。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。以便决定:捐助者循环死后;NMP:性常温机器灌注;BMMSCs:骨髓间充质干细胞;HO-1:血红素oxygenase-1;6:HO-1 / BMMSCs + NMP;英国石油公司:BMMSCs + NMP;ALT:丙氨酸转氨酶;AST:天冬氨酸转氨酶;治疗组:总胆红素。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
NMP组的肝功能指数(ALT、AST、GGT、和治疗组)术后第一天迅速增加,逐步减少术后7天之后(图
2 (b) )。紧密连接(通过ZO-1起诉和occludin水平)小叶显然是胆管破坏与移植前(图
2 (c) ),这是胆红素的解剖学基础渗漏到血液中。术后7天,HO-1 / BMMSCs可能大大保护紧密连接(通过ZO-1起诉和occludin水平)从毁灭(数据
2 (d) 和
2 (e) )。
组织学显示严重的组织损伤胆总管(CBD)和肝内胆管NMP集团(IHBD)不连续的胆管上皮,胆管上皮细胞的腔,间质壁坏死,炎症细胞浸润,和几个再生胆道细胞(图
3(一个) )。细胞角蛋白19 (CK19)免疫组织化学染色显示阻塞的IHBD腔(图
3(一个) )。相比之下,大多数的胆管上皮HBP组显示恢复连续性没有中断,和大量的再生细胞观察胆管腔,这是改进的价格相比英国石油集团(数字
3(一个) 和
3 (b) )。水平的血清ALT、AST、GGT、治疗组6组显著低于其他组(图
3 (c) ),这表明HO-1 / BMMSCs结合NMP可以有效改善肝移植后肝功能。
图3
胆管组织学和肝功能的变化。(a, b)他染色显示完整的胆管形态和连续的上皮假组,而胆管上皮的连续性被破坏(红色椭圆)和CK19免疫组织化学显示大型NMP组肝内胆管闭塞(黑色箭头)。英国石油公司和家庭血压组,大量的再生(蓝色椭圆)观察胆道细胞,和连续性胆管上皮细胞的恢复。每组(c)肝功能操作(后7天
n
=
5
)。ALT、AST、GGT、虚假的组和治疗组
38.96
±
5.09
U
/
l
,
44.16
±
7.67
U
/
l
,
2.50
±
0.70
U
/
l
,
1.28
±
0.77
μ
摩尔
/
l
分别,而NMP组显著增加(
248.80
±
36.78
U
/
l
,
375.30
±
66.91
U
/
l
,
82.56
±
11.34
U
/
l
,
9.10
±
1.90
μ
摩尔
/
l
分别)。与NMP组相比,肝脏功能的BP集团(
179.50
±
21.42
U
/
l
,
250.60
±
44.92
U
/
l
,
48.36
±
9.21
U
/
l
,
4.92
±
1.18
μ
摩尔
/
l
分别)和6组(
118.30
±
16.95
U
/
l
,
161.20
±
18.98
U
/
l
,
24.72
±
7.54
U
/
l
,
2.74
±
0.39
μ
摩尔
/
l
分别)显著改善。CBD:胆总管;IHBD:肝内胆管。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。他:苏木精和伊红;CK19:细胞角蛋白19;NMP:性常温机器灌注;6:HO-1 / BMMSCs + NMP;英国石油公司:BMMSCs + NMP;ALT:丙氨酸转氨酶;AST:天冬氨酸转氨酶;GGT: gamma-glutamyl转肽酶;治疗组:总胆红素。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.4。百事装瓶集团参与胆道细胞的再生和修复胆管损伤
组织学显示严重损害空气层,管腔内的上皮细胞的破坏,点状的胆道细胞坏死,和少量的再生NMP胆道细胞组(图
4(一) )。相比之下,使细胞相对完好,一些细胞死亡的迹象,BP和6组,与一些百事装瓶集团的扩张,大量的再生胆道细胞观察,迁移到胆管腔通过百事装瓶集团之间的连接管和胆管腔(图
4(一) )。
图4
百事装瓶集团从一个静态的表型转换一个活跃的表型。(a)虚假的组的空气层的形态是完好无损,和细胞与大轮和圆形细胞核位于细胞(白色椭圆)的中心。百事装瓶集团的形态NMP组被摧毁(红色椭圆),和连续性被打破,坏死细胞。百事装瓶集团相对完好的BP和HBP团体,扩大,大量增殖的细胞出现在百事装瓶集团之间的连接管和胆管的腔(蓝色椭圆)。(b)的相对蛋白质含量VEGF、PCNA、caspase-3,裂解caspase-3每组使用免疫印迹检测(
n
=
3
)。(c)免疫荧光染色显示,百事装瓶集团表示VEGFR1和VEGFR2。(d)的表达PCNA caspase-3每组中,免疫组织化学染色。而虚假的集团(
5.50
±
2.29
%
),PCNA-positive细胞的数量更高NMP组(
18.90
±
3.00
%
,
P
=
0.0002
)和更高的BP组(
37.10
±
4.64
%
,
P
<
0.0001
比NMP组)。增加家庭血压组最重要的(
53.50
±
4.24
%
,
P
<
0.0001
与BP集团)。而虚假的集团(
2.70
±
1.48
%
),数字caspase-3-positive细胞(
56.90
±
5.34
%
,
P
<
0.0001
NMP组)显著增加和减少的BP集团(
42.30
±
3.96
%
,
P
<
0.0001
与NMP集团),进一步降低了HBP组(
35.10
±
2.66
%
,
P
=
0.0306
与BP集团)。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。百事装瓶集团:peribiliary腺;NMP:性常温机器灌注;6:HO-1 / BMMSCs + NMP;英国石油公司:BMMSCs + NMP;VEGF:血管内皮生长因子;PCNA:增殖细胞核抗原;VEGFR1:血管内皮生长因子受体1;VEGFR2:血管内皮生长因子受体2。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
此外,PBG HBP组的细胞表达VEGF(图
4 (b) 肝移植后)。百事装瓶集团还对血管内皮生长因子受体1 (VEGFR1)和受体2 (VEGFR2)(图
4 (c) ),这表明VEGF分泌使促进胆汁的生长细胞通过自分泌和旁分泌途径。
Caspase-3表达式中检测出百事装瓶集团和周围的基质细胞在肝移植后,指示激活凋亡通路(图
4 (b) )。caspase-3-positive PBG细胞的数量的虚假的集团(
2.70
±
1.48
%
在NMP)明显低于集团(
56.90
±
5。3
%
)。相比之下,caspase-3-positive PBG细胞减少BP集团(
42.30
±
3.96
%
,
P
<
0.05
),而在HBP组下降更明显(
35.10
±
2.66
%
,
P
<
0.05
)(图
4 (d) )。激活caspase-3的比率(裂解caspase-3 (c-caspase-3)) caspase-3是最低的6组(图
4 (b) )。
免疫组织化学染色显示,
5.50
±
2.29
%
使细胞增殖细胞核抗原的表达虚假的集团,NMP组显著增加(
18.90
±
3.00
%
,
P
<
0.05
比虚假的组)。比例进一步提高BP集团(
37.10
±
4.64
%
,
P
<
0.05
与NMP集团),更重要的是增加HBP集团(
53.50
±
4.24
%
,
P
<
0.05
与BP集团)(图
4 (d) )。这些结果表明,肝移植的过程中造成了严重的损伤胆管上皮细胞以及PBG细胞和HO-1 / BMMSCs提升百事装瓶集团残余细胞的增殖。
3.5。百事装瓶集团转型的细胞在增殖成熟表型和再生
探讨增殖和迁移PBG细胞的成熟,我们评估的表达SOX9,蛋白质同源框Nanog,雌性生殖道。SOX9是干细胞的一个标志,Nanog是一个转录因子密切相关的未分化的干细胞的自我更新,和雌性生殖道是一个运输机胆道细胞表面上的成熟。虚假的组,使细胞的比例表达SOX9, Nanog
15.10
±
2.19
%
和
14.90
±
2.56
%
分别(图
5(一个) ),这表明内胚层祖细胞的表型。SOX9, Nanog-positive细胞的比例增加NMP组(
35.00
±
5.78
%
和
22.70
±
2.44
%
分别)(数据
5(一个) - - - - - -
5 (c) ),显示胆道祖细胞的增殖。NMP组相比,细胞表达Nanog SOX9的比例在BP集团(
45.20
±
4.44
%
和
35.10
±
3.32
%
分别)和6组(
58.40
±
4.88
%
和
47.70
±
4.60
%
)进一步增加,增加HBP组最重要的(数据
5(一个) - - - - - -
5 (c) )。Nanog和SOX9每组的表达与PCNA的一致,表明BMMSCs和HO-1 / BMMSCs提升百事装瓶集团的胆汁祖细胞的增殖。因此,表达式的雌性生殖道NMP组显著降低,表明大量成熟的胆管细胞被摧毁,而雌性生殖道的表达增加了英国石油公司和家庭血压组(数字
5 (b) 和
5 (c) ),这表明扩散胆汁从原始多能祖细胞分化成熟的胆道细胞表型,补充失去的胆道上皮细胞。
图5
增加具备干细胞和Wnt信号通路的激活空气层。(一)多能细胞标记- (Nanog和SOX9)阳性细胞在空气层被免疫组织化学标记(箭头所指)。Nanog骗局SOX9-positive细胞组
15.10
%
±
2.19
和
14.90
%
±
2.56
分别略增加NMP集团(
35.00
±
5.78
%
,
P
<
0.0001
与虚假的集团
22.70
±
2.44
%
,
P
=
0.0097
与虚假的组)和BP组显著增加(
45.20
±
4.44
%
,
P
=
0.00123
与NMP组和
35.10
±
3.32
%
,
P
=
0.0001
分别与NMP组)和6组(
58.40
±
4.88
%
,
P
=
0.0015
与BP集团和
47.70
±
4.60
%
,
P
=
0.0001
与BP集团)。的相对水平Nanog SOX9,每组雌性生殖道被免疫印迹检测(b)和PCR (c) (
n
=
3
)。(d)的免疫印迹分析Wnt3,总
β ——猫,活跃
β 猫没有统计学差异NMP组和虚假的群体,虽然表达Wnt3,总
β ——猫,活跃
β 猫在英国石油公司和家庭血压组(
n
=
3
)。(e)的相对水平
Wnt3 和
Ctnnb 1(总
β 猫)水平检测使用PCR (
n
=
3
)。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。百事装瓶集团:peribiliary腺;NMP:性常温机器灌注;6:HO-1 / BMMSCs + NMP;英国石油公司:BMMSCs + NMP;SOX9: SRY-box转录因子9;雌性生殖道:囊性纤维化跨膜电导调节;
β 猫:
β 连环蛋白。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
3.6。Wnt信号通路引起百事装瓶集团的增殖细胞和胆管损伤的修复
我们发现Wnt3 Wnt信号通路成员的表达,
β 连环蛋白和非
β 连环蛋白(活跃
β 连环蛋白)。结果表明,Wnt3的表达水平,
β 连环蛋白和活跃
β 连环蛋白在英国石油公司和家庭血压组明显高于那些虚假的和NMP组(数字
5 (d) 和
5 (e) )。
管理xav - 939 (Wnt信号通路的抑制剂)
在活的有机体内 明显的表达水平降低
β 连环蛋白和活跃
β 连环蛋白(图
6(一) 和
6 (b) )和抑制HO-1 / BMMSCs修复效果。的价格相比HBP集团,组织学显示胆道上皮损伤更严重,使细胞增殖减少XAV组(图
6 (c) );因此,肝功能(图
6 (d) )和紧密连接(数字
6 (e) 和
6 (f) )是更糟。XAV组VEGF和PCNA的表达水平下降,而那些caspase-3和c-caspase-3增加(图
7(一) )。Nanog的表达水平,SOX9,雌性生殖道也降低(数字
7 (b) 和
7 (c) )。免疫荧光染色显示xav - 939有效地退化
β 连环蛋白,从而抑制了古典Wnt信号通路和减少Nanog和VEGF的表达(数字
7 (d) 和
7 (e) ),即。,both the growth and stemness of PBG cells were inhibited. When the Wnt signaling pathway was inhibited, HO-1/BMMSCs could not fully play their role in damage repair, which suggested that HO-1/BMMSCs might promote the proliferation and differentiation of biliary progenitor cells by activating the Wnt signaling pathway (Fig.
S3 )。
图6
Wnt信号通路引起胆道祖细胞增殖修复胆管损伤。Wnt信号通路的激活水平每组被免疫印迹检测(a)和PCR (b) (
n
=
3
)。(c)后胆管和百事装瓶集团行政组织学变化xav - 939。(d)政府xav - 939后肝功能的变化。ALT、AST、GGT、治疗组6组
120.70
±
17.96
U
/
l
,
176.40
±
18.61
U
/
l
,
24.12
±
7.26
U
/
l
,
3.42
±
0.93
μ
摩尔
/
l
分别时更糟在xav - 939组(
207.40
±
20.41
U
/
l
,
273.8
±
24.11
U
/
l
,
56.92
±
7.32
U
/
l
,
6.58
±
1.26
μ
摩尔
/
l
分别)。紧密连接的相对水平(ZO-1和occludin)每组中发现了用免疫印迹(e)和PCR (f) (
n
=
3
)。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。百事装瓶集团:peribiliary腺;ALT:丙氨酸转氨酶;AST:天冬氨酸转氨酶;GGT: gamma-glutamyl转肽酶;治疗组:总胆红素;6:HO-1 / BMMSCs + NMP。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
图7
具备干细胞增殖活动和的变化使细胞在抑制Wnt信号通路。(一)相对的VEGF水平,PCNA, caspase-3,裂解caspase-3每组使用免疫印迹检测(
n
=
3
)。的相对水平Nanog SOX9,每组雌性生殖道被免疫印迹检测(b)和PCR (c) (
n
=
3
)。免疫荧光染色显示xav - 939有效地退化
β 连环蛋白表达下调表达,Nanog (d)和VEGF (e)在同一时间。
∗
P
<
0.05
,
∗
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
∗
P
<
0.001
。百事装瓶集团:peribiliary腺;VEGF:血管内皮生长因子;PCNA:增殖细胞核抗原;SOX9: SRY-box转录因子9;雌性生殖道:囊性纤维化跨膜电导调节。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
4所示。讨论
以便肝脏遭受严重的IRI。肝脏失去氧气和营养供应循环被捕后,导致ATP耗竭和大量代谢废物的积累。此外,氧气流入在再灌注导致活性氧的生产,广泛的炎症通路激活,细胞死亡。IRI是一个重要因素导致移植后胆管并发症(14),从而导致移植物功能障碍和需要再移植在严重的情况下。因此,在这个前提下,我们已经开发出一种新方法显示的潜力减少胆道缺血再灌注造成的损害的啮齿动物。
BMMSCs有免疫调节功能和组织修复,促使他们使用广泛的兴趣在器官移植领域(
17 ,
18 ]。然而,BMMSC应用程序仍然面临两个未解决的和不可避免的问题。首先,尽管BMMSCs可以迁移到受伤的网站指引下趋化因子,大量BMMSCs被困在肺毛细血管后静脉管理(
19 ,
20. ),导致细胞达到受伤的网站相对较少。第二,BMMSCs道在接受者在短时间内将被清除,通常不超过24小时(
21 ]。
为了解决这两个问题,我们优化BMMSC疗法在两个方面。首先,我们结合细胞疗法与NMP增加移植的BMMSCs肝脏。在我们之前的研究中,我们建立了一个NMP系统和验证,它保护肝脏移植从IRI相比静态冷藏和观察到由NMP系统没有添加额外的伤害(
13 ]。NMP模拟肝脏的生理环境,洗了代谢废物;补充氧气、营养物质和代谢底物;和维护正常的肝脏代谢在最大程度上(
22 ]。除了这对肝移植的保护作用,我们用NMP作为BMMSCs通过门静脉灌注的方法。与传统静脉管理相比,这种新策略增加了移植率BMMSCs在肝脏和改善肝脏DCD计划的质量
非原位 保存。其次,为了解决这个问题BMMSCs在宿主体内的存活时间短,我们中血红素oxygenase-1 BMMSCs (HO-1)。HO-1是病原反应酶催化血红素转换成胆绿素,具有抗氧化和抗炎功能(
23 ),可以作为一个cytoprotective分子(
24 ]。我们使用这个策略有效地延长生存时间的BMMSCs在肝脏。我们的研究表明,HO-1 / BMMSCs优于BMMSCs肝功能、组织学和接受者的生存时间。
我们建立了一个老鼠的肝移植模型中一个巨大的失去肝外胆道上皮和大肝内胆管发生因为严重的缺血再灌注损伤。HO-1 / BMMSCs管理后,胆汁祖细胞的增殖空气层和修复后的胆管IRI以便观察肝移植。使细胞被激活后胆管损伤修复受伤的胆道上皮细胞,这是符合导致胆管疾病的其他模型(
11 ,
25 ]。这些研究,目前的研究表明,百事装瓶集团作为保管人的胆汁祖细胞上皮损伤后再生。百事装瓶集团小角落分布沿肝内和肝外胆管,分泌粘液和酶维持胆道上皮细胞的生理功能(
26 ]。他们也作为利基胆汁的祖细胞,维护更新和再生的胆道上皮
27 ]。PBG受伤的程度成正比,肝移植术后胆管狭窄的发生率[
28 ),这表明百事装瓶集团是一个重要的结构和功能完整性保证胆管损伤的修复。我们的研究验证百事装瓶集团的核心作用严重胆管损伤的修复,并提供新的见解修复通路和肝移植后胆管损伤的机理。
我们发现HO-1 / BMMSCs提升百事装瓶集团的增殖和抑制细胞凋亡。通常情况下,使小腺泡安排在集群。IRI后肝移植模型,大多数百事装瓶集团都被摧毁,而且很少有扩张。百事装瓶集团提出了更完整的形状和显示政府HO-1 / BMMSCs后更明显扩张。百事装瓶集团扩张的现象可能是由于高水平的细胞增殖。HO-1 / BMMSCs管理后,使细胞表达高水平的VEGF,空气层也表达了VEGF受体。因此,VEGF分泌百事装瓶集团不仅促进邻近的血管内皮细胞的增殖,但百事装瓶集团还自分泌和旁分泌作用于细胞,增加他们的增殖和诱导从静态表型转换到一个活跃的表型。这一现象表明,生长因子VEGF还与核扩散有关胆道细胞(
29日 ]。我们发现HO-1 / BMMSCs与不仅使细胞的增殖,也多能细胞比例的增加百事装瓶集团。目前没有明确的证据证明这些变化是如何发生的;因此,还需要进一步的深入研究。
Wnt信号起着至关重要的作用在动物胚胎发育、组织再生等生理过程。Wnt是一种分泌蛋白,细胞之间传递信号。Wnt信号通路被激活时,
β 连环蛋白在细胞质中积累,然后进入细胞核作为转录因子(
30. ]。Wnt信号通路控制干细胞的生长和命运。Wnt通路的激活增加成人干细胞的数量,同时保留其分化潜力和维持自我更新(
31日 ]。Nanog是蛋白质的一个主要负责维护的多能性干细胞和只是表达多能细胞(
32 ]。在Wnt通路的激活,
β 连环蛋白作为转录因子上调
Nanog 表达式[
33 ,
34 ]。
VEGF 也是目标之一Wnt通路的基因,然后呢
β 连环蛋白调节其表达通过绑定到其启动子(
35 ,
36 ]。我们发现HO-1 / BMMSCs与Wnt通路的激活有关,对应于胆道祖细胞的增殖和多能性。增生性胆道祖细胞迁移到受伤的网站,从原始多能表型分化成熟胆道上皮细胞表型离开干细胞利基由Wnt维护后,由增加表达式验证后的雌性生殖道HO-1 / BMMSCs管理工作。
以前,人们认为间充质干细胞(msc)迁移到受伤的网站和分化成功能性细胞来修复受损组织(
37 ]。然而,一些msc道靶器官静脉注射后,这是不足以修复(
20. ),建议msc不执行通过分化组织修复功能。在1970年代,德克斯特et al。
38 )使用来源于附着的骨细胞成功地保持自我更新,造血干细胞的增殖和分化潜力。这些来源于附着的骨细胞,今天被称为BMMSCs,也被称为骨髓基质细胞。德克斯特等人的研究表明,BMMSCs提供必要的自我更新和分化的多能细胞微环境。BMMSCs可能改变组织微环境以旁分泌的方式。BMMSCs分泌大量的积极因素,促进增殖,刺激血管生成,抑制细胞凋亡和炎症(
39 ]。值得注意的是,这些因素也维持多能性和刺激内源性干细胞和祖细胞的增殖修复损伤(
40 ]。我们假设BMMSCs影响胆汁祖细胞的增殖和分化激活Wnt信号通路在胆汁微环境,支持上述观点。因此,BMMSCs分泌活性因子和细胞因子的能力来改变组织微环境可能是组织修复的一个重要机制。
BMMSCs可能提高两个百事装瓶集团干细胞性质的细胞通过Wnt信号:多能性,表现为积极Nanog表达,广泛和增殖的能力,观察肝移植模型胆汁祖细胞迅速增殖和分化恢复胆道上皮细胞。在这项研究中,我们提供了证据支持,优化BMMSCs推广扩散,迁移,和成熟的内源性胆祖细胞在百事装瓶集团通过激活Wnt通路修复胆管损伤后肝移植。这一发现为胆管损伤的病理生理学修复提供证据在肝移植DCD计划和建议一种新的方式来扩大安全的肝移植应用程序。然而,口译和笔译的临床结果应该仔细考虑。胆道并发症发生在人类通常几个月后移植后,但我们观察组织学手术后7天。尽管生存分析足够长,我们没有澄清的动物死亡的原因。需要更多的研究证明新策略是否有效地减少移植后胆道并发症的发生,改善肝脏DCD计划的质量,解决了捐赠资源短缺的问题。此外,这种啮齿动物模型的结果可能不是直接翻译人类和需要验证。总而言之,我们相信,我们的研究结果提供了一个新的见解在肝移植胆道损伤的病理生理学和现在的新机遇,扩大安全利用的肝脏移植。