不同的神经源性潜力的Subnuclei产后鼠耳蜗神经核

文摘

在患有听力损失,减弱或消失的神经输入引起耳蜗核形态变化(CN)。神经干细胞最近被确定在第一个听觉继电器。传入神经信号及其内在影响神经干细胞和祖细胞已经侵犯在CN早期产后细胞的生存。这种听觉脑干核包含三种不同的subnuclei:前腹侧的耳蜗核(AVCN) posteroventral耳蜗核(PVCN)和背侧耳蜗核(宽带)。因为这些细分ontogenetically和生理上不同,问题出现的地区差异是否存在于神经性的利基。在断奶后九天CN Sprague-Dawley老鼠显微镜下解剖到subnuclei和体外培养自由浮动的细胞培养和包埋的机关文化。除了细胞量化,immunocytological immunohistological研究的细胞和器官准备进行传播。PVCN部分显示最高的有丝分裂潜力,而AVCN和宽带有类似的活动。特定干细胞标记和细胞能够分化成神经的血统被发现在所有三个隔间。目前的研究表明,在所有的老鼠subnuclei CN,产后神经干细胞利基,,然而,在其潜在有极大的差别。 The results can be explained by the origin from different regions in the rhombic lip, the species, and the various analysis techniques applied. In conclusion, the presented results provide further insight into the neurogenic potential of the CN, which may prove beneficial for the development of new regenerative strategies for hearing loss.

1。介绍

在患有听力损失,耳蜗毛细胞和连续的螺旋神经节神经元变性。这pathomechanism影响内耳的转导过程和提升中央听觉皮层听觉通路的传输。缺乏神经输入导致听觉脑干核形态变化,特别是在耳蜗核(CN) [1,2]。CN位于外侧的哺乳动物脑干和听觉上是第一个中继站派生从内耳神经输入。耳蜗神经之间的访问CN antero posteroventral部分(数据1(一)和1 (b))。神经纤维联系的所有三个部分CN [3]。从主要的听觉神经元连接,螺旋神经节细胞,tonotopically组织。CN,次级听觉神经元产生,传播声学信息在脑干水平较高,橄榄形的复杂,外侧丘系的核心,下丘。CN由不同的subnuclei:腹侧耳蜗核(VCN)和背侧耳蜗核(宽带)。VCN可以进一步分为posteroventral耳蜗核(PVCN)和前腹侧的耳蜗核(AVCN)。不同tonotopically组织纤维达到同样的CN组织螺旋神经节细胞。subnuclei,各种中枢听觉核团导致进一步预测,参与方面的信号处理(4]。subnuclei各有特定的电生理功能。某些地区的CN执行听觉输入的频率编码,时间的测量信号,声音定位(5,6]。

成年神经发生的功能方面讨论了自从他们第一次描述(7]。他们可能会促进内源性重构过程中神经可塑性或显式使用再生治疗的耳蜗螺旋神经节细胞和听觉通路8- - - - - -10]。在体外分析表明,神经元干细胞可以再生失去从螺旋神经节和CN神经元突触连接11]。诱导多能干细胞分化后,能够形成突触的去神经的耳蜗感觉上皮,再生轴突连接的损失在体外(12]。还称,除了减少或缺失的神经输入感音神经性听力损失,神经祖细胞(NPC)扮演一个角色在CN退化信号不足(13]。神经干细胞(nsc)最近被确认在产后CN。神经干细胞的细胞都基本特性,特别是有丝分裂自我更新的能力以及分化为神经祖细胞和神经系的所有细胞14]。除了神经发生的产后早期被描述在CN [15),先前的研究表明低神经性潜在产后40天(PND)。它持续到成年,neurosphere形成的持续能力所示,BrdU公司,检测特定的标记(nsc的16]。CN的nsc移植后能分化成神经组织在所有细胞的神经系17]。

虽然已经知道CN subnuclei发生在胚胎发育的音质特异性(18),有针对性病态存在于成年有机体(19- - - - - -24),它尚未澄清是否有产后神经源性潜在的隔间。出现的问题是否存在地区差异,这可能发挥作用在损伤后再生听觉通路。调查这个问题,subnuclei CN的解剖和分析他们的特定的神经源性潜力患产后抑郁症的9 Sprague-Dawley老鼠。车厢是immunohistologically分别检查。包埋的文化和自由漂浮细胞培养分离产生的准备。除了immunocytological分析和量化评估,进行细胞周期分析使用溴脱氧尿苷(BrdU)。

2。材料和方法

2.1。动物和组织准备工作

所有程序都遵循准则建立了实验方法进行德国法律(§8日德国动物保护法案)。产后一天9 Sprague-Dawley老鼠(查尔斯河®)安乐死颈椎错位和斩首。头骨被打开了矢,骨切除。经过仔细颅神经的解剖,大脑被抬出,转移到35毫米培养皿在5°C冷磷酸盐溶液(DPBS, 0.05 M, PAA实验室®)。使用立体显微镜(蔡司®,Stemi 508),大脑和小脑分离5倍放大,和脑干被释放从脑膜组织和血管。后确定CN,直言不讳地解剖# 5/45准备钳(。杜蒙®)。解剖后CN,立体显微镜从反射光模式转向了透射光高对比度模式,这样的结构边界subnuclei变得隐约可见。分离的隔间然后用手术刀没有进行。13在25 x放大。为主,减少了在中间,正交于纵轴,单独的腹侧和背侧部分。 Another cut followed this through the ventral part along the longitudinal axis in an extension of the inserting N.VIII (Figure1 (b))。随后,车厢被单独处理。

2.2。细胞培养和Neurosphere化验

执行神经组织具有的离解Accutase (Gibco®,热费希尔科学®)为30分钟37°C全能料理机®(股份®)。悬架是每10分钟500磨碎μl吸管。然后,离心机(1000 rpm, 5分钟)和颗粒悬浮在神经干细胞培养基(NSC介质),包含无血清Neurobasal®(热费希尔科学®),1% GlutaMAX补充(表达载体®),B27补充没有视黄酸(表达载体®),和1%的青霉素和链霉素(表达载体®)。重组小鼠生长因子EGF(10毫克/毫升)(PeproTech®)和bFGF / FGF-2 (10 ng / ml) (PeproTech®)被添加。细胞的数量在个人决心使用纽鲍尔血细胞计数器样本(ZK06, Hartenstein®)。至关重要的细胞与锥虫蓝染色测定(0.4%,# 93595,Sigma-Aldrich®)。自由浮动的细胞培养在疏水生成的细胞培养瓶(汽车、蜂星®过滤器,25厘米²,他一一Bio-One®) 37°C和5%有限公司₂。主球的数量确定在文化和4周后重新计算大约1000培养细胞。

仔细分析,neurospheres吸气从自由浮动的细胞培养5毫升autopipettes (accu-jet pro,品牌®)和镀在玻璃盖玻片(78.5毫米²预镀Hartenstein, poly-D-lysine (100μg / ml,美国赛瓦电泳®)和laminin-1 (10μg / ml, BD生物科学®))。球体培养在4菜(格林尼Bio-One®),每100人μl (NSC中每口井。镀领域的完整性和倒置的透射光显微镜检查(徕卡®DMI-8)。文化被37°C / 5%孵化有限公司₂的目的。媒介改变了每两天新鲜NSC介质经过仔细的愿望与巴斯德吸量管中使用。

2.3。电镀的单个细胞和诱导细胞分化

细胞培养用5毫升悬挂被accu-jet吸管(品牌®)自由浮动neurosphere文化然后离心机在1000转2分钟。从颗粒中浮层然后吸气,和100年μl Accutase (Gibco®,热费希尔科学®)是补充道。暂停是孵化15分钟37°C和500 rpm全能料理机®(股份®);悬架是每5分钟与200年磨碎μl吸管。样品在1000转2分钟,然后离心Accutase被吸掉了,细胞颗粒与细胞resuspended介质。单一细胞转移进入自由浮动的文化新通道或镀。

对于细胞分化,单个细胞在分化(DIF)镀介质组成的Neurobasal(热费希尔科学®),GlutaMAX(表达载体®),B27与视黄酸(表达载体®)。进行二维文化玻璃盖玻片覆盖laminin-1(1: 100年0.05 M D-PBS)和poly-D-lysine (PDL;1:100年0.05 D-PBS)密度100细胞/毫米²。4井的文化进行了共8天在37°C / 5%的股份有限公司₂。一个中等大小的变化是每两天进行。

2.4。固定和免疫细胞化学

实验完成后,单个细胞和球体固定4%多聚甲醛溶液(0.1米PBS PFA)为30分钟,最后在丙酮5分钟。非特异性结合位点被封锁了10%牛血清白蛋白溶液(BSA、A9418 Sigma-Aldrich®)在0.1 M PBS。免疫细胞化学,准备孵化了以下主要抗体在5°C 12 h在1% BSA溶液和0.1 M PBS:鼠标单克隆反对Atoh1 (1: 1000;Ab27667 Abcam),鼠标对BrdU单克隆(5-bromo-2 - - - - - -脱氧尿苷)(1:600;# 05 - 633微孔®),小鼠单克隆β微管蛋白(1:1000;# TS293 Sigma-Aldrich),鼠标单克隆β-III-tubulin (1: 1000;# Ab7751, Abcam®),兔多克隆β-III-tubulin (1: 2000;# Ab18207, Abcam®),兔多克隆对doublecortin(克莱斯勒)(1:1000;# Ab18723, Abcam®),鼠标单克隆对胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) (1: 1000;# MAB360,微孔®),兔多克隆对髓鞘碱性蛋白(MBP) (1: 800;# M3821, Sigma-Aldrich®),鼠标对巢蛋白单克隆(1:800;# MAB353,微孔®),兔多克隆对Sox-2 (1: 2000;# Ab97959, Abcam®)。与0.1 PBS溶液冲洗三次后,二级抗体被孵化,耦合Alexa萤石A488和A555 (# A11001 1: 1000年,# A11008,热费希尔)5μg / ml DAPI(1: 5000年,D9542 Sigma-Aldrich®) 1 h在1% BSA溶液在0.1 PBS。最后,三个清洗步骤进行了再次在0.1 PBS,和玻璃盖玻片嵌在玻璃幻灯片Mowiol (# 4 - 88, Sigma-Aldrich®)。存储发生在5°C轻防护文件夹。

2.5。包埋制备和BrdU化验

CN subnuclei准备和切片后,这些都经过精心挑选了弹簧钢镊子(100/8毫米,Ehlert &合作伙伴®),放在半多孔的(0.4μ米)膜(格林尼Bio-One®) 12-well菜(格林尼Bio-One®)。一滴细胞中添加上。NSC介质包含5-bromo-2 - - - - - -脱氧尿苷(BrdU) (10μ米)添加到膜的水平。孵化是在37°C / 5%的股份有限公司₂。组织固定,4% PFA的解决方案是首先添加到细胞培养基 比后48 h,然后删除。2 h的进一步固定进行了PFA的解决方案4% 0.1 PBS。组织固定后,被调到0.1米PBS溶液和储存在5°C或立即处理免疫组织化学。

2.6。组织学切片,免疫组织化学

固定后,组织孵化在30%蔗糖一夜之间,在Tissue-Tek cryoprotected O.C.T.(樱花®),并在液态氮冷冻。部分20μm是减少使用低温恒温器(徕卡®,CM3050年代),安装在superfrost幻灯片(Hartenstein®),和存储(-20°C),直到进一步分析。免疫荧光染色,部分后缀在PFA 4% 5分钟,冲洗三次TBS-T,阻止0.3% Triton x - 100年10% BSA (Sigma-Aldrich®) 1 h。主要抗体在1% BSA在孵化Triton x - 100 48 h 0.3%以下浓度:鼠标单克隆反对BrdU(1: 25)(微孔®),鼠标对巢蛋白单克隆(1:500年,微孔®),兔多克隆对Atoh1(1: 100年,圣克鲁斯®),兔多克隆对Sox-2(1: 100年,Abcam®),和兔多克隆doublecortin(克莱斯勒)(1:1000;# Ab18723, Abcam®)。部分被冲洗三次TBS-T和孵化1 h在1% BSA与山羊TBS-T anti-rabbit或山羊anti-mouse二级抗体耦合Alexa萤石A488和A555 (# A11001 1: 1000年,# A11008,热费希尔)和5μg / ml DAPI(1: 5000年,D9542 Sigma-Aldrich®)。与TBS-T洗涤三次后,部分被嵌入在玻片Mowiol (# 4 - 88, Sigma-Aldrich®)。

2.7。流式细胞术和细胞周期分析

细胞周期分析,1毫升的细胞悬液被每个测试在1000 rpm和离心5分钟。上层清液已经被吸入后,细胞悬液分离是利用Accutase®为15分钟37°C。离心后,颗粒在500年resuspendedμl PBS 0.1和1000μl 70%的乙醇添加透化作用2小时4°C(费舍尔Bioreagents®, # BP8201-1)。5分钟在1000转离心后,上清液吸掉,和颗粒resuspended于500年μl PBS(0.1米)在0.25% Triton x - 100在室温下15分钟。在500年后离心法和洗涤μl PBS, 100μl anti-phopho-histone-H3 (pHH3)抗体的解决方案是添加(1:1000年1 x PBS + 1% BSA;兔子马伯# 3377,细胞信号技术®)。孵化一夜之间在4°C。第二天,第一个抗体的解决方案是离心机在1000 rpm,颗粒resuspended于100年μl第二抗体解决方案:anti-rabbit Alexa 635(山羊anti-rabbit免疫球蛋白辅助antibody-Alexa萤石635(热费希尔科学®,# - 31577))。在黑暗中30分钟后在室温下孵化箱,稀释了1000粒μl PBS和上层清液离心之后。1000年μl(π/核糖核酸酶染色解决方案(BD生物科学®,# 550825)随后补充道,和颗粒是其中resuspended转入FACS-suitable圆底管(猎鹰™,热费舍尔科学®)。在黑暗中孕育时间15分钟后,进行了分析与BD FACSCanto®流式细胞分析仪。测量和数据评估与BD FACSDiva软件进行了V 5.0.3 (BD生物科学®)。

2.8。数字图像和图像分析

数字图像的细胞培养和准备与徕卡®DMI8荧光显微镜,徕卡应用程序套件X软件v3.0.1(徕卡®)。量化neurospheres的数量,培养瓶都是使用透射光扫描技术在瓷砖扫描模式。显微图像的数字图像导出直接从徕卡未压缩的TIFF格式的应用程序套件软件。最终的图像合成是用Adobe®InDesign CC 2020 v15.0.2软件。组织部分进行了分析与奥林巴斯®Fluoview FV3000共焦激光扫描显微镜和出口与斐济/ ImageJ V2.0.0软件(25]。

2.9。统计分析

所有数据被编译使用Microsoft Excel 2019 V16.34电子表格和统计分析与GraphPad®棱镜8.2.0软件。首先,列分析(D 'Agostino-Pearson综合正常测试)来决定是否执行高斯正态分布的数据。随后,数据分析了使用普通单向方差分析测试图基多重比较检验。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。可再生的结果从三个或三个以上样本。如果数据是高斯正态分布均值和标准平均误差(SEM)显示,而没有高斯正态分布,平均值和标准偏差(SD)显示。

3所示。结果

探讨神经性CN subnuclei潜力,是否相似或在所有地区明显不同,系统的体外分析完成。subnuclei被切割后,neurosphere化验。采用免疫细胞传播是检查。神经干细胞的基本标准的特点。比较neurosphere化验的结果与神经源性组织的潜在subnuclei,包埋器官文化进行和免疫组织化学检查。

3.1。CN Subnuclei Neurosphere分别显示出不同的能力的形成

分离细胞的前腹侧的部分CN (AVCN)形成的 neurospheres / 1000可行的细胞( )30天内。posteroventral部分(PVCN)形成的 neurospheres / 1000可行的细胞( ),和背部分(宽带)了 neurospheres / 1000可行的细胞( )。潜力高峰的形成neurospheres PVCN被发现(AVCN vs PVCN: ,PVCN与宽带: )。之间没有显著差异AVCN和宽带(图的细胞1 (c))。

除了neurospheres形成的速度,其直径也由光学显微镜在扩张阶段。AVCN细胞形成neurospheres直径 平均而言,超过30天。PVCN形成球体测量 ,和宽带领域平均直径 ( )。任何显著差异在个人subnuclei测定(图1 (d))。

3.2。Neurospheres的CN Subnuclei显示神经祖细胞标记

48小时后,扩展形成的球体表面的二维文化,和单个细胞离心地移民。这些结构被可视化β微管蛋白染色(图2(一)-2(左))。转录因子Atoh-1,推导的标志听觉通路的神经干细胞,采用免疫染色法检测(数字2(一)-2(c))。从所有CN Neurospheres subnuclei表示这个标记以及祖细胞标记Sox-2(数据2(d) -2(f))。此外,神经元迁移蛋白质doublecortin(克莱斯勒)(数据2(g) -2(我))和祖细胞标记巢蛋白在细胞中发现的neurospheres CN细分(数字2(j) -2(左))。

进一步量化形式祖细胞的能力,个人neurospheres细分被分离成单个细胞和镀。NSC中24小时后,祖细胞标记已经发现在neurospheres量化在单个细胞和绝对细胞数量的可行的细胞相比,染色β微管蛋白。Atoh-1 AVCN细胞染色积极 在PVCN细胞 ,和宽带细胞 ( ; )。CN subnuclei之间没有明显差异。Sox-2 AVCN细胞染色积极 ,在PVCN细胞 ,和宽带细胞 ( ; )。关于宽带与PVCN有显著差异( ),和最低比例的细胞PVCN Sox-2-positive。克莱斯勒在AVCN细胞染色阳性 ,在PVCN细胞 ,在宽带细胞 ( ; )。CN subnuclei之间没有明显差异。巢蛋白呈正AVCN细胞染色 ,在PVCN细胞 ,和宽带细胞 ( ; )。在PVCN与宽带有显著差异( )。最大的比例PVCN nestin-positive细胞检测。

3.3。CN所有Subnuclei可以分化的祖细胞

文化的所有三个CN subnuclei采用免疫分析中包含单个细胞祖细胞标记巢蛋白阳性(数字3(一)-3(c))。虽然这些多极细胞形态分化的迹象,他们从其他显著不同β-tubulin-labeled细胞,形成广泛的分支网络。

从形态上区分不同的细胞形式被发现在所有三个CN subnuclei的文化。神经元分化细胞纺锤状somata和双极或多极流程了β-III-tubulin(图3(d) -3(f))。星形支化细胞,突出从周围的双极神经元分化细胞形态清晰,GFAP表达(胶质原纤维酸性蛋白)。这些是确定为星形胶质细胞在文化的三个subnuclei(数字3(g) -3(我))。此外,tree-branched细胞被发现在所有三个subnuclei DIF文化,使外围接触neuron-differentiated细胞的分支机构。髓鞘形成的细胞的发病过程是oligodendrocyte-specific标记所示MBP(髓磷脂碱性蛋白)(数据3(j) -3(左))。

此外,它是检查是否subnuclei显示相关干细胞命运的相对差异。因此,量化了单个细胞分化标记细胞的绝对数量(β-tubulin-positive细胞)。AVCN发达的祖细胞 β-III-tubulin(+)神经元分化细胞后8天分化阶段。PVCN显示 β-III-tubulin(+)细胞,宽带 ( ; )。GFAP-positive胶质细胞AVCN中被发现 ,在PVCN ,和宽带运 ( ; )。MBP-positive胶质细胞,少突细胞形态学AVCN中被发现 ,在PVCN ,和宽带运 ( ; )(数据4(一)- - - - - -4 (c))。

调查的祖细胞的分化是否CN subnuclei显示个体内的或个人间的差异,这两种模式的统计分析是并列(数字4(一)- - - - - -4 (c)与数据4 (d)- - - - - -4 (f))。神经祖细胞分化能力的CN subnuclei证明没有显示任何重要的个人间的差异潜力(数字4(一)- - - - - -4 (c))。相比之下,个体内的分析表明,在AVCN PVCN,大部分细胞分化astrocytically,其次是神经细胞和少突胶质细胞紧随其后。这种趋势也明显在宽带(数字4 (d)和4 (e))。

3.4。神经干细胞标记物表达在CN Subnuclei的组织部分

自红衣主教干细胞标准所示所有CN细分到细胞培养试验,问题出现了,他们是否也可以检测到在CN组织本身。此外,有丝分裂活动应由BrdU公司检查。因此,解剖subnuclei被孵化包埋机关文化在Transwell®膜48小时。

神经源性转录因子Atoh-1和Sox-2检测部分的AVCN, PVCN和宽带(数字5(一)-5(f))。神经元迁移蛋白,doublecortin(克莱斯勒),也是所有细分(数据所示5(g) -5(我))。巢蛋白免疫组织化学染色在所有三个CN subnuclei(数字5(j) -5(左))。神经源性活动由S期可视化在所有subnuclei标记溴脱氧尿苷(BrdU)(数据5(一)-5(左))。

3.5。祖细胞的CN Subnuclei BrdU分析显示不同的有丝分裂活动

调查潜在的细胞分裂的干细胞特性,不同部分的CN作为包埋培养机关文化与BrdU 48 h。随后,BrdU量化的(+)细胞不同的部分进行。孵化后48 h, BrdU(+)细胞/ 10⁶μ米³( ; )被发现在AVCN整体准备的, BrdU(+)细胞/ 10⁶μ米³被发现在PVCN ( ; ),和3.1 BrdU(+)细胞/ 10⁶μ米³( ; )在宽带被发现。PVCN显示显著更高的增殖潜力相比AVCN和宽带。AVCN之间没有显著性差异是可衡量的和宽带(AVCN vs PVCN: ,PVCN与宽带: )(图6)。

3.6。流仪细胞周期分析显示不同比例的祖细胞分裂

为进一步验证neurosphere试验获得的结果,额外的流量仪分析进行了细胞周期和有丝分裂率基于phospho-histone-H3人口(图7)。

PVCN,为此,AVCN样品准备和宽带,20000事件的可行的细胞群进行了分析和量化为每个示例(图8)。碘化propidium分析显示在G0 / S1阶段 ( )在AVCN, ( )PVCN, ( )( ; )。subnuclei之间的差异是重要的( )。在S期,以下发现: ( )AVCN, 细胞( )PVCN, 细胞( )在宽带( ; )。CN nsc比例的S期subnuclei没有任何明显的差异。在G2 / M期,以下发现:2852.3±126细胞( )在AVCN, 细胞( )PVCN, 细胞( )在宽带( ; )。显著比例最高的G2 / M期细胞被发现在AVCN,宽带和最低的( )。为进一步分析,anti-phospho-histone-H3-positive的比例(α-pHH3 +)细胞G2 / M期数量确定。以下发现: 细胞( )AVCN, ( )PVCN, 细胞在宽带( )( ; )。明显大的比例α在PVCN -pHH3-positive细胞被发现( ),和最低AVCN ( )。

4所示。讨论

在听觉系统,中枢神经系统在其他领域,静止神经性领域已确定。CN,相当于其他地区,这是表明,神经源性潜力最大的可以在早期产后阶段但持续到成人年龄(16]。有一个关键时期出生后的外部因素,如听觉剥夺或受伤,有一个明显影响区域的神经源性发展(26]。然而,特定的塑料效果可以观察到,直到成年。

在这项研究中,人们发现在CN,第二个中继站的听觉通路,有神经性subnuclei利基。然而,神经性细分之间的潜在的显著不同。在实验中,可以分离神经干细胞从CN subnuclei患产后抑郁症的9 SD大鼠和传播自由浮动的细胞培养。生成neurospheres和neurosphere-derived单细胞细分显示典型的干细胞标准:mitotically分裂和自我更新的能力,开发神经祖细胞的能力,和multipotency neuroectodermal成熟(27- - - - - -29日]。体外实验对自组装、自我更新和分化进行了一连串的实验。包埋机关文化进行,除了神经干细胞标记,分析了有丝分裂BrdU。同时,标本分离和传播作为自由的文化。从这些文化,同时测试系列进行了neurospheres和并行单个细胞进行了分析。干细胞标记物的表达,有丝分裂分化,分析并行进行。

4.1。干细胞微环境

细胞培养系统特别适合神经干细胞和祖细胞用于实验。尽可能多的控制影响因素,采用无血清细胞培养(Neurobasal B-27补充,GlutaMAX)有丝分裂原EGF和bFGF (10 ng / ml)。这些扩散生长因子是至关重要的生存和传播的神经干细胞在体内和体外30.- - - - - -33]。他们导致胚胎发育和模式(34中枢神经系统和在成年神经发生是必不可少的35]。

撤出所有分化实验进行的这些生长因子(36]。类维生素a发挥重要作用在细胞分化和成熟的中枢神经系统37]。体外模拟这些过程,无血清培养基和B-27补充维甲酸被用于细胞分化。DIF介质描述已经成功地用于干细胞和分化研究协议的先例CN [14,16,17,38]。

包埋机关文化的体外系统聚酯膜(Transwell®系统)被选中。膜的粘附力允许检查anchoring-dependent细胞和组织和体内相似条件(39]。营养解决方案可以添加管基底不影响组织,机械和代谢终端产品也可以被删除。出于这个原因,Transwell®系统特别适合BrdU化验,因为短期介质变化不可能显著影响组织。后续浸固定的组织也可能很容易,分离后,转移到cryomedia。使用这种技术,调查机关文化的描述的实验进行了单细胞液体实验对应的文化。

4.2。有丝分裂和自我更新

调查有丝分裂和自我更新能力的干细胞标准,使用neurosphere试验,这是一个行之有效的方法来分析一个静止的干细胞体内潜在的神经组织(28,40- - - - - -44]。间接方法干细胞分析是必要的,因为没有明显的标记来识别他们(28,29日]。潜在的也有自我分裂和自我更新的CN细分分析实验系列。

在30天内自由浮动的文化,在所有CN subnuclei neurospheres发达,直径增加,直到时间的评估。平均而言, neurospheres每1000单个细胞AVCN文化中形成的。PVCN文化显示出最高的潜力, 球体。 neurospheres从宽带细胞生成。大约有0.9%的细胞与潜在的神经源性潜在AVCN, PVCN的1.8%,0.6%在宽带(关系: ; )(图1 (c))。

neurosphere试验进一步验证这些结果,包埋与BrdU机关文化公司在后续实验研究。BrdU试验已经建立了神经源性潜力的分析组织在体内和体外45]。这胸苷模拟标记细胞S期,因此可以表明神经元增殖和自我更新。包埋机关文化也显示在所有CN subnuclei(细胞分裂的人物5(一)-5(左))。量化,BrdU-labeled细胞与器官体积(图计算6)。增殖能力分布非常相似的neurosphere化验:PVCN vs AVCN BrdU-positive细胞的比例为180%,在PVCN和宽带是300%。同样,PVCN被认定为最高的CN细分增殖的潜力。

验证免疫组织化学结果,流仪分析三个subnuclei CN nsc的执行。细胞周期研究进行了使用propidium碘试验,展示不同的细胞周期分布阶段(图7)。确定增殖细胞群,磷酸化组蛋白H3是染色的,高度敏感的有丝分裂标志建立了分析神经性潜在体外(46]。磷酸化histone-H3具有较低的特性绑定能力相关的DNA由于双重否定,是转录的先决条件。BrdU分析结合pHH3检测是非常具体的关于沉默的有丝分裂检测神经干细胞的潜力(47]。分析表明,显著pHH3最大的比例⁺细胞中检测出的面积PVCN(图8 (b))。这证实了假设在neurosphere BrdU化验,PVCN神经性的最大潜力。

详细讨论这些结果时,他们必须与能力生成neurospheres哺乳动物大脑的其他地区。他们还必须考虑关于原点的subnuclei耳蜗神经核。此外,分析技术应用也必须加以考虑。

在整个耳蜗神经核,能力形成neurospheres约30球/ 1000细胞后三周的文化动物患产后抑郁症的9 (16),高于给出结果。在另一项研究中,一个类似的能力来生成neurospheres在鼠标CN,但年轻的动物患产后抑郁症3检查(13]。细胞形成的前腹侧的和posteroventral鼠标CN大约30球/ 1000可行的细胞,和那些来自约20球形成的背CN / 1000可行的细胞。所有这些数字都不同与其他地区相比在脑干,例如,第四脑室的成年老鼠 八天后neurospheres / 1000可行的细胞(48]。但是甚至更高的数字之前所描述的脑干(49]。这些差异在球商可以解释不同的神经源性能力的个体的大脑区域和不同的物种。例如,研究表明,rat-derived neurospheres较低增长潜力的老鼠相比(50]。神经源性潜能的差异可以解释为不同培养条件因为在一些研究中,DMEM / F-12细胞中使用。相比之下,在目前的实验中,Neurobasal介质与生长因子,也有重大的影响能力形成neurospheres [51]。

4.3。神经祖细胞的形成

进一步检查祖细胞的形成作为干细胞标准,采用CN neurospheres和包埋的文化研究进行。典型的祖细胞标记在细胞内发现neurospheres,而且在移民细胞。转录因子Atoh-1显示核染色和被发现在neurospheres以及组织部分的CN细分(数字2(一)-2(c))。Atoh-1负责听觉中脑的推导的菱形唇。如果Atoh-1淘汰,一个非功能形态学和缺失的神经元连接发生在CN和辅助听觉核(52]。这个因素是相似的耳蜗毛细胞发展重要性(53- - - - - -56]。因此,祖细胞标记是特别相关的听觉系统的发展中检测出所有CN subnuclei产后早期。进一步量化显示subnuclei之间没有明显差异的单个细胞传播CN。相当于,Atoh-1也发现老鼠下丘的祖细胞在产后早期阶段(57]。然而,阳性细胞的比例在neurosphere文化显著降低(CN:从新加坡。50 - 82%与IC:从新加坡。2.3%;图9(一个))。这可以解释为在产后早期有一个更大的潜在神经源性CN地区比其他脑干听觉通路的细胞核。

此外,祖细胞标记Sox-2 doublecortin(克莱斯勒),和巢蛋白检测在细胞CN neurospheres somata,相当于包埋切片(数字5(d) -5(左))。转录因子Sox-2有至关重要的作用在神经干细胞的自我更新和多潜能58]。Sox-2表达神经管和增殖发展的祖细胞。扩散在成熟阶段后,表情是表达下调。Sox-2-expressing神经细胞能够自我更新和成熟的形式neuroectodermal线(59,60]。这标志因此被认为是一个典型的神经干细胞和祖细胞的指标(59]。Sox-2中检测出的增殖neurospheres CN subnuclei和组织部分的核心区域。评价中分离单个细胞,Sox-2阳性细胞显著比例最大的决心在宽带和PVCN最小的百分比。这与神经祖细胞标记巢蛋白,在PVCN祖细胞通常是积极的。中间丝巢蛋白表达完全是由中枢神经系统发展的早期阶段神经上皮的细胞和神经干细胞(61年- - - - - -63年]。

Doublecortin是一种神经元迁移蛋白表达的神经前体细胞,不成熟的胚胎神经元,和成人神经干细胞(64年]。神经干细胞的分裂之后,他们表示克莱斯勒2 - 3周,然后表达下调(65年]。由于其相对特异性神经元对于不成熟的发展中,这个标记已被认为是神经发生指标与有丝分裂BrdU标记和经常检查。

总之,两个重要的干细胞标准的神经干细胞是所有三个CN subnuclei所示:一个潜在的扩散和self-renewal-which表示在neurospheres的形成和BrdU合并。此外,神经祖细胞的形成了基于特定的表达模式的自由浮动的文化和组织准备。

4.4。干细胞分化

神经干细胞的另一个基本属性是潜在的不对称分裂祖细胞和分化不成熟的神经元和胶质细胞(28]。单个细胞脱离文化的CN subnuclei分化的细胞类型neuroectodermal行下撤军生长因子在八天(图3)。四种不同的细胞类型分化在这些DIF的文化。多极较大细胞圆形somata甚至nestin-positive后8天。这些仍未分化的祖细胞阶段。

Bi -和多极细胞纺锤状,有时圆的somata细长细胞扩展被标签识别β-III-tubulin神经元分化细胞。这些细胞形成的小型网络彼此和神经胶质细胞。这种类型已被描述在NSC文化大鼠背侧迷走神经的复杂(49和其他实验文献中描述28,29日]。

Astrocytically分化细胞的星形接触其他双极细胞的扩展。Immunocytologically,这些显示染色胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。这中间丝状体识别astroglial细胞体外33,66年和体内67年]。

第四主族在DIF文化大somata spoke-shaped细胞分支。髓鞘碱性蛋白(MBP)检测采用免疫在这些胶质细胞的外围扩展,从而确定他们是少突胶质细胞(68年]。这些同样的邻居的神经细胞体内,它们形成的髓鞘轴突(69年]。

单细胞DIF实验的量化了可比的结果在这个领域的其他出版物:分化成astroglial行比例最大,其次是少突胶质细胞。分化的神经细胞组成的最小比例(数字3(d) -3(f))27,40,41]。如果一个情节量化的数据对个人CN subnuclei,由此可见,没有显著差异。总之,这表明祖细胞被孤立于CN subnuclei组织。存在很大差异细分的增殖能力。祖细胞每个细分的同样能够区分。因此,他们不成熟的效力不同。

4.5。时空的起源、迁徙途径和神经元的CN Subnuclei规范

不同的节的起源在开发过程中可以解释subnuclei之间的差异。耳蜗核来源于rhombomere r2-r5域(12]。PVCN起源于rhombomere 4,以及宽带程度较轻。此外,外侧丘系腹核和olivocochlear神经元也源于r4。神经元来自r4为抑制gaba ergic作出更大贡献和glycinergic神经元兴奋glutamatergic神经元比(70年]。PVCN还来自r3和r5的宽带,命运分析所示在鼠标71年]。相比之下,只有生成神经元的AVCN r3地区,这是Atoh-1-positive细胞(14]。Atoh-1是基本helix-loop-helix转录因子和发展是至关重要的细胞的外围和中部部分听觉系统(54]。另一个出版物描述了两个不同Atoh-1-dependent rhombic-lip迁徙流。颅的导致细胞外侧丘系和小脑核,尾一个耳蜗神经核和耳蜗颗粒神经元(55]。考虑到这方面的知识,它可以假定起源的差异来自不同的地区的菱形唇和表达重要的差异化因素的变化导致的不同产后神经源性潜在subnuclei耳蜗神经核。

4.6。研究的局限性

本研究中可能会有一些限制。结果对神经源性潜力CN得到基于免疫组织化学检查和体外细胞培养分析。影响分化转移或神经干细胞和祖细胞的表型调制不能在这样一个模型。进一步的分析基于血统追踪模型在未来可能是有用的。目前的研究主要集中在可能的神经源性效力在CN subnuclei一定年龄的动物模型。这个模型测试的目的和比较基本神经性的潜力在这特定的星座。此外,目前的结果检测使用一个特定的动物模型。进一步的知识在未来可以获得的分析不同的物种。额外的与年龄相关的影响的研究也将获得关键的见解的神经发生脑干核。

5。结论

总之,结果表明,所有细胞完整的红衣主教干细胞标准存在的subnuclei CN,它提供了进一步了解这种听觉脑干的神经源性潜力细胞核。这些知识可能有用的发展再生策略,因为这种治疗方法,神经性的潜力将是有益的替换受伤或退化的神经组织(72年]。例如,它可能是重要的再生过程或医源性神经源性重组后影响脑干植入物的植入等73年,74年]。对于这种方法,这是特别重要的,产后CN subnuclei神经性的潜力。因此,可以想象,CN的传入和传出结构可以影响一个潜在的再生方式,例如,通过体内应用物质。因此,所有功能单元(CN的传入和传出)因此能够接受特定的神经源性重组或再生过程。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果都包含在这篇文章。

伦理批准

所有适用的国际、国家和机构动物保健和使用指南。

的利益冲突

我们声明我们没有经济利益可能提交相关工作。

确认

作者请谢谢内耳生物学实验室的技术人员ENT维尔茨堡大学诊所的合作和支持。这项工作是慷慨地支持的“跨学科维尔茨堡临床研究中心”IZKF维尔茨堡(格兰特z二/ CSP-4)(德国维尔茨堡Beethovenstrasse 1, 97080https://www.med.uni-wuerzburg.de/izkf)。

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