比较分析Tenocyte-Derived Tenogenic基因表达的诱导多能干细胞和骨骨髓来源间充质干细胞对生化和生物力学刺激的反应

文摘

肌腱是非常容易受伤,过度使用或老年性变性人和马。自然愈合肌腱受伤差,和细胞治疗的治疗仍然是一个重要的临床挑战。在这项研究中,我们广泛调查tenogenic基因的表达在马骨髓间充质干细胞(bmsc)和tenocyte-derived诱导多能干细胞(teno-iPSCs)刺激生长因子(TGF -β3和BMP12)结合异位表达类似MKX tenogenic转录因子或循环单轴机械拉伸。免疫印迹显示TGF -β3和BMP12增加转录因子的表达类似MKX SCX和在这两种细胞,但tenocyte标记tenomodulin (TNMD)只发现在bmsc和调节通过诱导物。另一方面,实时定量PCR表明TGF -β3的表达增加EGR1,COL1A2,在你,过渡委员会在综合和SCX,COL1A2,宽带运,在你,过渡委员会在teno-iPSCs。BMP12治疗高SCX,类似MKX,宽带运,在你,过渡委员会在teno-iPSCs。类似MKX超表达的增加SCX,宽带运,在你,过渡委员会在综合和EGR1,COL1A2,宽带运,在你,过渡委员会在teno-iPSCs;TGF -β3进一步加强过渡委员会伴着。此外,机械拉伸增加SCX,EGR1,宽带运,民族解放军,过渡委员会在综合和SCX,类似MKX,EGR1,COL1A2,宽带运,在你,过渡委员会在teno-iPSCs;TGF -β3倾向于进一步提升SCX,民族解放军,过渡委员会在综合和SCX,类似MKX,COL1A2,宽带运,过渡委员会在teno-iPSCs BMP12进一步上升趋势的表达SCX和宽带运在综合和宽带运在teno-iPSCs。此外,上述tenogenic诱发监管机构也会影响信号的表达SMAD7,ETV4,SIRT1在综合和teno-iPSCs。综上所述,我们的数据表明,在尊重tenocyte-lineage-specific基因表达,bmsc, teno-iPSCs tenogenic刺激的反应是不一样的,这可能会影响到他们的应用程序的结果在肌腱修复或再生。

1。介绍

肌腱是hypovascular组织传播力从肌肉到骨头。受高受伤的风险从急性创伤,过度使用或老年性变性。自然愈合能力有限和穷人肌腱修复的功能结果正在寻找更有效的再生方法(1]。ESCs干细胞包括胚胎干细胞(),诱导多能干细胞(万能)和间充质干细胞(msc),拥有tenogenic分化能力和提出了肌腱修复和再生2]。例如,肌腱干细胞/祖细胞(TSPCs)显示高形成的肌腱组织的能力在体外和在活的有机体内(3,4并提出了一个更好的治疗肌腱细胞来源障碍比其他类型的干细胞(5]。然而,他们的应用程序是有限的,由于相对较低的数量在整个肌腱细胞群和表型的损失在体外扩张(6]。骨骨髓来源msc (bmsc)都已经被广泛地研究过了肌腱修复在人类和马,但临床实践的直接使用未分化的bmsc仍然是有争议的部分原因是异位骨形成的——或者cartilage-like结构在目标网站(7]。表现出极大的承诺作为一个新兴的细胞来源的细胞则对肌腱修复(8- - - - - -10),然而,潜在的致癌形成始终是一个需要关心和更广泛的研究在临床前翻译(11]。一个替代方法改善肌腱干细胞疗法,干细胞植入前,predirecting干细胞向tenogenic血统在体外通过使用生物(包括转录因子、生长因子和微环境)和生物力学的暗示。

转化生长因子β(TGF -β)总科的细胞因子,包括TGF -β亚科(TGF -β1、TGF -β2,TGF -β3)、骨形态发生蛋白/生长分化因子(BMP / gdf)和苯丙酸诺龙/抑制素,在肌腱发展中扮演至关重要的角色,体内平衡,发病机理(12- - - - - -15]。TGF -β2 -和/或TGF -β3-deficient小鼠胚胎,观察肌腱和韧带的损失在整个身体,加上没有tenocyte-related基因的检测信号SCX,TNMD,COL1A1(13]。针对删除的TGF -β2型受体(Tgfβr2) tenocytes没有扰乱肌腱分化功能和生长在胚胎发育阶段,但破坏了分化标记SCX,TNMD,COL1A1出生后不久,恢复突变细胞更progenitor-like状态(15]。此外,在体外研究表明,TGF -β2能够诱导SCX表达在胚胎成纤维细胞,间充质干细胞线C3H10T1/2,和鼠标肢芽器官文化(13]。TGF -β3据报道促进tenogenic基因表达在不同类型的干细胞(14,16,17),但它的使用则是非常有限的。只有一个实验室报告,TGF -β3刺激,马则有减少肌腱分化能力相比ESCs [18]。

尽管BMP / gdf最初命名诱导骨形成的能力,家庭成员BMP12 (GDF7) BMP13 (GDF6)和BMP14 (GDF5)被证明扮演重要角色在肌腱/韧带保养和维修(12]。与野生型的同胞相比,在BMP14肌腱^{- / -}和BMP13^{- / -}小鼠显示出类似的缺陷对胶原蛋白生产和机械性能19,20.]。BMP12-deficient老鼠,而纤维胶原蛋白的表达和腱蛋白聚糖没有影响,跟腱展出转向小直径纤维,导致一个小但显著减少意味着原纤维直径(21]。在在体外研究中,尽管BMP12诱导的表达TNMD和宽带运在马bmsc [22]和羊膜fluid-derived msc [23),的表达SCX和TNMD在犬类脂肪基质细胞(对asc) [24),的表达SCX和类似MKX在人类对asc [25),在万能中的应用尚未报道。

生物物理力和至少三个转录因子(SCX、类似MKX和EGR1)是已知肌腱的正常发展的必要条件。之前从我们的实验室和其他证明,机械负荷和/或异位表达的转录因子能够引起一些tenocyte-related基因的表达在msc和万能26- - - - - -29日]。然而,这在很大程度上仍是未知的细胞行为的情况下如何tenogenic刺激,和生物标记特定tenocyte血统也非常有限。因此有必要检查的活动大量tendon-related基因tenogenic分化细胞。在目前的研究中,我们旨在比较在体外tenogenic马tenocyte-derived万能干细胞分化能力(teno-iPSCs)和生物活性分子引起的bmsc TGF -β3和BMP12结合异位表达的莫霍克或循环单轴机械拉伸。tenogenic转录因子的表达(SCX,类似MKX,EGR1),腱细胞外基质基因(COL1A2decorin (宽带运)、弹性蛋白(民族解放军),fibromodulin (在你),tenascin C (过渡委员会)),信号监管机构(SMAD7,ETV4和Sirtuin1 (SIRT1))。我们的目标是提供有价值的信息,正在进行的和未来的干细胞再生治疗肌腱损伤。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

隔离和马bmsc的文化被描述在我们之前的研究28]。短暂,骨髓吸入物洗两次与PBS紧随其后的是两个洗基础培养基(DMEM / F12(英杰公司)与10% FCS(双子座)和1 x抗生素(Gibco)),然后resuspended BMSC生长培养基中培养(基础培养基+ 4 ng / mL bFGF)在37°C, 5%的公司₂。72小时后,细胞与PBS彻底洗干净,新鲜培养基添加每2 - 3天的变化。confluency达到80 - 90%,细胞(P0)分离trypsin-EDTA 0.25%和1 -密度进一步扩大 细胞/厘米²。bmsc在章节2 - 5被用于实验。特征的间充质干细胞是由流式细胞术用积极的表达CD29、CD44, CD90、CD105,和mhc i CD45的负面言论,CD79, mhc ii。证实了bmsc的multipotency在体外trilineage分化使用在我们以前的工作描述协议(28)(补充图1)。

生成和multilineage teno-iPSCs的分化也在我们以前的工作报告(28]。短暂,tenocytes感染pHAGE-STEMCCA慢病毒表达鼠标Oct3/4 SOX2, Klf4,和原癌基因在基础培养基30 h,然后转移到丝裂霉素C灭活MEF馈线的细胞在iPSC介质(DMEM包含10% FCS, 1×NEAA, 1×谷酰胺,1×丙酮酸钠,0.055毫米beta-mercaptoethanol, 1000 U /毫升的生活,和1×抗生素/抗真菌的解决方案)。媒介是每隔一天更换一次。大约10 - 15天,个别殖民地手工采摘,使胰蛋白酶化,进一步扩大。在章节3 - 5,细胞转向和维护在feeder-free StemFlex™介质(费舍尔科学)和特征multilineage分化能力。

2.2。慢病毒感染

GFP基因和马莫霍克subcloned进replication-defective慢病毒载体噬菌体中这两个基因由IRES(内部核糖体进入位点)元素。慢病毒表达GFP (lenti-GFP)单独或类似MKX和GFP (lenti-MKX)生产的293吨包装细胞,和上层清液含有病毒颗粒通过Millex-HV 0.45μm PVDF过滤器(微孔,爱尔兰)。细胞的35毫米文化板块的密度20000细胞/厘米²前一天被暴露于感染1:1稀释过滤病毒上清液的聚凝胺(8μg / mL) 8个小时,然后培养的新媒体48小时。感染效率是荧光显微镜下检查GFP的表达信号和qPCR(补充图2)。莫霍克的异位表达是由qPCR和免疫印迹。

2.3。生长因子治疗

伴着被播种在6 -或12-well板的密度 细胞/厘米²在BMSC生长介质融合了两天达到约90%。万能干细胞,细胞通道汽车被5毫米分裂EDTA和播种在6 -或12-well板的密度 细胞/厘米²BMSC基本媒介融合了两天达到约90%。之前在体外tenogenic分化,细胞被洗两次BMSC基础培养基,然后处理TGF -浓度表示β3或BMP12 (PeproTech Inc .,落基山,NJ)在同一媒介的另一个五天一个介质改变第一次治疗后两天。

2.4。小天狼星红染色(30.]

表示生长因子治疗后,细胞生长与PBS 12-well盘子都洗了两次,固定与70%乙醇室温下30分钟,然后用三次蒸馏的水冲在孵化前0.1%的苦味酸天狼星红饱和水溶液一小时。量化结节染色,染色可溶性0.2毫升的0.1%氢氧化钠和无水甲醇(1:1(卷/卷))在室温下30分钟。随着染色(0.06毫升)被转移到井的96孔板,在540 nm和吸光度测定。数据了 , 。

2.5。机械拉伸

如前所述(28),测试机械力的影响在teno-iPSCs tenogenic基因表达和bmsc,细胞被播种vitronectin-coated保利(ɛ-caprolactone) (80 kDa;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)nanofibrous支架3天,然后循环单轴受正弦力从一个定制的生物反应器。设备编程近似正弦波形相当于3%应变幅度(0% - -6%应变)18个小时1赫兹的频率。机械拉伸,年底样本细胞溶解为RNA提取试剂盒试剂。静态控制治疗相同但是没有循环机械载荷。

2.6。RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成,实时定量PCR(存在)

样本细胞溶解试剂盒中的试剂(表达载体),和总RNA提取根据制造商的指示。一微克的RNA当时对待RQ1 RNase-free DNase然后用于互补脱氧核糖核酸合成使用高容量cDNA逆转录工具包(热费希尔科学)。Equine-specific底漆对设计使用NCBI primer-blast或公布的数据18],引物序列的列表补充表中可以找到1。qPCR使用SYBR绿色PCR反应混合液(美国Biotool)应用生物系统公司7500实时PCR系统。所有pcr进行了一式三份。PCR循环参数为10分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15秒,15秒60°C, 72°C 15 s。的最后程序,融化曲线是由服用阅读每1°C,从65年到95°C。参考基因PSMB2被用于基因表达正常化,和相对褶皱变化计算使用2^−ΔΔCt方法。

2.7。免疫印迹

细胞被洗两次与PBS然后在冰冷的细胞溶解T-PER缓冲区(热费希尔科学)补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Miliporeσ)。进行了sds - page Bio-Rad使用minigel系统,和蛋白质被转移到PVDF膜。阻塞后TBST含有5%脱脂奶粉至少一小时在室温下,一夜之间,膜被孵化在4°C的主要抗体,其次是孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体一小时在室温下。彻底清洗后TBST缓冲区,在膜是一个增强的化学发光信号系统(皮尔斯)。抗体用于这项研究包括以下:scleraxis (Abcepta # AP21316b, 1: 1000), tenomodulin(圣克鲁斯技术# sc - 49325, 1: 1000),莫霍克(Abcam # ab179597, 1: 1000),α微管蛋白(细胞信号技术# 3873,1:1000),p-SMAD3(圣克鲁斯技术# sc - 517575, 1: 1000),和p-SMAD1/5(细胞信号技术# 9516 t, 1: 1000)。

2.8。统计数据

数据了 。统计分析是由方差分析单因素试验之间的基因表达的控制和治疗组。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。TGF -剂量的影响β3在bmsc和teno-iPSCs Tenogenic基因表达

评估TGF -的影响β3在tenogenic基因表达,bmsc和teno-iPSC (clone3 iPSC3)处理三种不同浓度的TGF -β3 5天,tenogenic转录因子的表达(SCX,类似MKX,EGR1),chondrogenic主转录因子SOX9,成骨的主人的转录因子RUNX2,tendon-related ECM基因(COL1A2,宽带运,民族解放军,在你,过渡委员会)是由qPCR决定。如图1的水平在你和过渡委员会bmsc的水平SCX,在你,过渡委员会在iPSC3增加剂量依赖性的方式。的表达EGR1,SOX9,COL1A2低浓度的bmsc倾向于增加TGF -β3 (4 ng / mL),但明显调节TGF -的浓度更高β3 (20 ng / mL 100 ng / mL)。的表达SCX,类似MKX,RUNX2,宽带运,民族解放军在bmsc与治疗趋势向上。在iPSC3 TGF -β3诱导显著增加EGR1,SOX9,RUNX2,COL1A2,民族解放军在更高浓度(20 ng / mL和/或100 ng / mL)但不是在低浓度。TGF -β3的表达也显著增加了宽带运在所有三个浓度进行了测试,但不是在剂量依赖性的方式(图1 (c)在这个范围内)。另外,我们之前的工作报道,父母的家族基因的保留也各不相同,teno-iPSC克隆,iPSC3显示tenogenic基因表达水平高于teno-iPSC克隆1 (iPSC1) [28]。比较同基因的分化能力不同iPSC克隆,iPSC1 tenogenic的刺激的反应也在这项研究评估。如补充图所示3iPSC1显示一个类似的模式iPSC3的表达SCX,SOX9,COL1A2TGF -β3治疗。此外,增加了EGR1,RUNX2,宽带运,民族解放军,过渡委员会发现在更高浓度的TGF -β3所示。综上所述,这些数据表明,TGF -β3-activated tenocyte-related基因不同于个体的细胞类型。

3.2。BMP12的剂量影响在bmsc和teno-iPSCs Tenogenic基因表达

评估的影响BMP12 bmsc的tenogenic分化潜能和teno-iPSCs细胞处理三种不同浓度的BMP12 5天,和基因表达被qPCR测量。如图2,的表达SCX,类似MKX,EGR1,SOX9,RUNX2,COL1A2,宽带运,民族解放军,在你,过渡委员会倾向于在bmsc的所有三个测试浓度增加。另一方面,BMP12治疗的表达增加宽带运和过渡委员会在iPSC3剂量依赖性的方式的表达SCX,类似MKX,COL1A2,民族解放军被BMP12更高浓度调节(20 ng / mL和/或100 ng / mL)。至于iPSC1,而表达SCX,类似MKX,EGR1,宽带运,RUNX2趋势向上,BMP12的表达明显增加SOX9,COL1A2,民族解放军在所有三个浓度(补充图4)。总的来说,这些数据表明,类似于TGF -β3,BMP12-induced tenocyte-related基因细胞类型之间也不尽相同。

3.3。TGF - - -的影响β3和BMP12的细胞形态和Tenogenic bmsc和teno-iPSCs蛋白表达

如前所述,TGF -β3和BMP12刺激许多tenogenesis-related基因在转录水平的表达在bmsc和teno-iPSCs。内在的分子含量的变化可能表明通过改变细胞形态。因为最高浓度(100 ng / mL)大大增加的表达SOX9和RUNX2生长因子在20 ng / mL被用于进一步的实验。相比,细胞治疗与BSA车辆中,bmsc, iPSC3更倾向于形成集群与TGF -治疗后β3 5天,在iPSC1并不明显(图3(一个))。形态差异明显的在所有的细胞暴露于BMP12时进行测试。

确定TGF -的影响β3和BMP12在bmsc tenogenic蛋白质的表达和teno-iPSCs,细胞治疗TGF -β3或者BMP12 5天,整个细胞溶解产物与类似MKX SCX抗体和免疫印迹。如图3 (b),TGF -β3和BMP12的表达明显增强SCX和类似MKX bmsc和两个teno-iPSC克隆。Tenomodulin被认为是成熟的标志tenocytes。我们没有测量TNMD通过rt - pcr(数据未显示)基因表达;然而,与TNMD抗体蛋白免疫印迹显示特定信号预期大小的细胞溶解产物bmsc,和信号极大地增强了TGF -β3和BMP12的刺激。令人惊讶的是,未发现TNMD信号在两个teno-iPSC克隆和治疗(图3 (b))。

此外,评估TGF -的影响β3和BMP12胶原沉积,细胞治疗与天狼星红染色。如补充图所示5,小天狼星红染色强度明显增加了TGF -β3在伴着。量化数据还显示轻微染色TGF -但显著增加β3-treated iPSC3 iPSC1。这种效应不显著BMP12治疗在任何类型的细胞。

3.4。TGF - - -的影响β3和BMP12 Tenogenic基因表达在MKX-Overexpressing bmsc teno-iPSCs

我们之前的研究表明,异位表达的莫霍克刺激tenogenic基因表达bmsc和teno-iPSCs [28]。符合这个概念,类似MKX控制GFP-expressing细胞相比,过度的表达增加SCX,EGR1,SOX9,宽带运,民族解放军,在你,过渡委员会在bmsc (MKX-BMSCs)COL1A2,宽带运,在你,过渡委员会在iPSC3 (MKX-iPSC3,图4并补充图6)和iPSC1 (MKX-iPSC1,补充图6&7)。确定强制表达类似MKX的协同效应与TGF -β3或者BMP12 tenogenic基因表达GFP -或MKX-expressing细胞暴露在TGF -β3、BMP12 5天,qPCR基因表达测定。如图4TGF -β3治疗进一步加强的表达EGR1和过渡委员会在MKX-BMSCs和趋势,进一步增加的表达SCX,SOX9,COL1A2,在你在MKX-iPSC3和SCX,SOX9,RUNX2,COL1A2,宽带运在MKX-iPSC1。另一方面,BMP12治疗趋于增加的表达过渡委员会在MKX-BMSCs,SCX,RUNX2,SOX9,COL1A2在MKX-iPSC3和RUNX2,COL1A2,宽带运,过渡委员会在MKX-iPSC1(补充图7)。

3.5。机械拉伸的影响在TGF - Tenogenic基因表达β3 -和BMP12-Treated bmsc teno-iPSCs

两个分子线索和机械加载肌腱发展和体内平衡中发挥重要作用。我们之前的研究报道,机械拉伸影响tenogenic bmsc基因表达和teno-iPSCs [28]。按照这种说法,与静态条件相比,循环单轴拉伸增加了表达SCX,EGR1,宽带运,民族解放军,过渡委员会在综合和SCX,类似MKX,EGR1,SOX9,COL1A2,宽带运,在你,过渡委员会在iPSC3。确定与TGF -机械拉伸的协同效应β3或BMP12 tenogenic基因表达、细胞使用TGF -β前3或BMP12循环单轴机械拉伸,tenocyte-related基因的表达是由qPCR决定。如图5TGF -β3的表达增加SCX,类似MKX,EGR1,SOX9,COL1A2,在你,民族解放军,过渡委员会在静态bmsc和SCX,COL1A2,宽带运,过渡委员会在静态iPSC3。接触TGF -β3细胞预处理机械拉伸的表达增加SCX,类似MKX,SOX9,COL1A2,民族解放军,过渡委员会在综合和SCX,类似MKX,RUNX2,COL1A2,宽带运,过渡委员会在iPSC3。另一方面,BMP12治疗的表达升高SCX,COL1A2,民族解放军,在你在静态bmsc和SCX和COL1A2在静态iPSC3。机械加载BMP12-pretreated细胞调节的水平EGR1,宽带运,过渡委员会在综合和EGR1和宽带运在iPSC3。综上所述,这些数据表明,机械拉伸和生长因子协同调节tenogenic基因表达在一个单元中泛型类型的方式。

3.6。与Tenogenic基因表达相关的潜在信号网络bmsc teno-iPSCs

TGF -β配体使磷酸化,激活转录因子receptor-regulated SMAD2/3或通过绑定SMAD1/5/8跨膜TGF -β受体(31日]。正如所料,在所有测试细胞TGF -β3和BMP12大大增强SMAD3的磷酸化形式,分别和SMAD1/5(数字6(一)和6 (b))。它也承认TGF -β总科调节细胞增殖和分化不仅规范化SMAD信号还SMAD-independent经典之中通路(32]。本着这种想法,mRNA水平SMAD7,一个抑制Smad TGF -消极的控制β和BMP-induced SMAD信号(33),被TGF -显著增加β3在更高浓度bmsc和teno-iPSCs(图6 (c))。这些现象没有观察到当细胞接受BMP12或类似MKX overexpressing(数字6 (d)和6 (e))。有趣的是,机械拉伸导致了明显的增加SMAD7bmsc的表达式,但不是在万能(图6 (f)),这表明监管TGF -β信号通过机械力可能依赖于细胞类型。此外,的表达ETV4,一个基因可以作为转录读出的ERK / MAPK活性[34),被TGF -高度调节β3在bmsc iPSC3但不是在iPSC1(图6 (c),补充图1)。与此同时,激活ETV4在bmsc还揭示了机械力(图6 (f)),但不是在细胞治疗BMP12或类似MKX的异位表达(数字6 (d)和6 (e)补充数据2和4),暗示激活ERK / MAPK信号依赖于细胞类型以及tenogenic诱导物。另一方面,理解一个表观遗传修饰符是否受到tenogenic抗病诱导剂,sirtuin-1的转录活动(SIRT1),其中一个NAD-dependent组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac),测定qPCR刺激细胞。结果表明,SIRT1表达在bmsc和iPSC1几乎没有受到任何刺激。然而,它的水平iPSC3略TGF -但显著升高β3在20 ng / mL,超表达类似MKX的单独或结合TGF -β3或BMP12和机械拉伸结合TGF -β3、BMP12(图6并补充图4),这表明激活的SIRT1基因通过tenogenic刺激依赖于细胞内的上下文。

4所示。讨论

广泛在这项研究中,我们审查的影响个人或组合tenogenic线索,包括TGF -β3 BMP12类似MKX的异位表达,和机械拉伸,在teno-iPSCs tenocyte-related基因的表达和综合。我们的数据显示,这些刺激影响tenogenic转录因子的活动,包括SCX,类似MKX,EGR1,tendon-related ECM基因的表达等COL1A2,宽带运,民族解放军,在你,过渡委员会。此外,还显示这些tenogenic诱发者高监管机构对信号的表达的影响SMAD7,ETV4,SIRT1在综合和teno-iPSCs。

4.1。Tenocyte-Associated转录因子调控

虽然确切的机制触发tenogenesis仍然是难以捉摸的,到目前为止,至少有三个转录因子,即。、SCX类似MKX,EGR1已报道,在肌腱发展发挥重要作用。损耗的基因造成明显的肌腱异常(35- - - - - -38]。换句话说,刺激这些基因可能推动干细胞命运tenocyte血统。作为第一个腱形成所需的转录因子发现,SCX是一个被广泛接受的tenogenic标记在体外研究。虽然还不完全了解SCX活动的监管在活的有机体内,真正的失去TGF - SCX信号β2^{- / -}——和TGF -β3^{- / -}有缺陷的小鼠胚胎表明TGF -β需要的信号SCX表达在发展中肌腱(13]。在我们的研究中,治疗TGF -β3、BMP12大幅增加SCX蛋白质水平的表达teno-iPSCs和bmsc,暗示TGF -β配体可以作为一种强有力的tenogenic诱导干细胞向tenocytes。此外,我们的研究还表明,循环机械载荷单独与0% - -6% (1.0 Hz正弦波的应变18小时)能够增强的表现SCXbmsc和teno-iPSCs。这是符合机械应力是一种诱导物的概念SCX表达式[39),尽管布朗等人的另一个研究报告说,它不是单独机械应力(1小时/天0.5赫兹的应变为1% 3天),但TGF -β2、TGF -β2结合机械应力增加SCX表达式在鼠标bmsc [40]。这种差异可能是由于不同的拉伸参数应用。然而,Maeda等人的早期研究表明,物理力量可以调节释放活性TGF -β从ECM,从而调整SCX表达式通过TGF -β/ SMAD2/3-mediated信号(41]。这也可能是TGF -的协同效应的原因β3、机械加载SCXbmsc和teno-iPSCs表达式。此外,我们的数据也证明了SCX表达式可以被强迫的表达类似MKX,尤其是在伴着。这是在协议与报告,类似MKX的异位表达水平显著增加SCX通过TGF - C3H10T1/2细胞β信号(42),但不符合其他研究类似MKX没有激活的表达SCX在人类bmsc [27),或鼠标牙周韧带(PDL)成纤维细胞43)或跟腱(44]。这种差异表明,类似MKX调节的能力SCX或其他目标可能不同物种之间和细胞类型。

另一方面,虽然类似MKX高度发展中肌腱和表达在tenogenic分化方面扮演重要角色,在其上游有非常有限的信息监管机构(s) (45]。BMP12据报道是一种生长因子能够激活类似Mkx在各种各样的间充质干细胞(27,46,47]。在我们的研究中,这种效应并不明显,qPCR分析;然而,免疫印迹结果显示明显更高水平的类似MKX BMP12——或者TGF -β3-treated bmsc, teno-iPSCs比车辆控制、TGF -暗示的作用β信号的控制类似MKX表达式。此外,类似MKX机械负荷引起的激活也可以大大提升在鼠膝tendon-derived细胞在接触机械拉伸(6小时monoaxial循环伸长4%)[37]。一个在活的有机体内来自Kayama等人的研究也显示增加的水平类似MKX在跑步机上鼠标跟腱45]。作者进一步报道,机械拉伸应变(0.25赫兹2% 6小时)诱导转录因子的核易位Gtf2ird1在鼠初级阿基里斯tenocytes,从而提振的表达类似MKX。在我们的研究中,对类似MKX表达、机械加载显示比bmsc teno-iPSCs更重要的影响。它将极大的兴趣知道Gtf2ird也在这些细胞介导的生物力学响应。

除了SCX和类似MKX,锌指转录因子EGR1似乎也扮演了一个重要的角色在控制肌腱发展,体内平衡,修复(29日,38,48]。众所周知,EGR1各组织由多个可以诱导细胞外刺激,如生长因子和机械信号。然而,目前尚不清楚如何去做EGR1是由在腱形成和生化信号在体外tenogenic分化。郭等人报道EGR1水平高度增强鼠TPSCs处理10 ng / mL TGF -β为10天(15阴等人),但研究显示减少的表达EGR1在鼠bmsc处理相同浓度的TGF -β1为3或7天(30.]。Guerquin等人的另一项研究显示没有变化EGR1表达C3H10T1/2细胞治疗20 ng / mL TGF -β2对1或24小时38]。在我们的研究中,增强的表现EGR1在马bmsc对待TGF -β3在20 ng / mL或100 ng / mL, teno-iPSCs 100 ng / mL TGF -对待β3所示。这些数据表明,感应的EGR1TGF -β可能是细胞类型和浓度依赖性。此外,BMP12能够诱导也报道了EGR1表达式在土耳其bmsc [49]。然而,在我们的研究中,BMP12只倾向于增加EGR1在bmsc和teno-iPSC3 teno-iPSC1但不是。这些结果部分与其他研究的结果EGR1表达鼠bmsc不会受到BMP12 [30.]。值得注意的是,如EGR1是一个著名的mechanosensitive基因,观察明显增加的EGR1bmsc和teno-iPSCs在机械负荷,可能覆盖效应导致另一个刺激。

同样值得注意的是,我们的研究中使用的tenogenic刺激chondrolineage-related转录因子的活动的影响SOX9和osteolineage-related转录因子RUNX2。例如,的水平SOX9在bmsc被TGF -剂量依赖性调节βBMP12 3和趋势向上,在teno-iPSC3,它是由高剂量的升高TGF -β3和/或机械拉伸。此外,的表达RUNX2在bmsc下降,teno-iPSC1类似MKX的异位表达,但在teno-iPSCs增加了高剂量的TGF -β3所示。这些结果并不令人感到意外,因为TGF -β信号、机械负荷和类似MKX也扮演着重要角色在调节软骨和骨形成37,50]。然而,我们的研究结果表明,迫使类似MKX的表达可能减弱的风险在肌腱修复骨形成某些类型的干细胞是由生长因子预编的。

4.2。条例Tendon-Related细胞外基质基因活动

精确的肌腱组织矩阵是由肌腱细胞合成主要由I型胶原蛋白,加上少量的其他类型的胶原蛋白和noncollagenous材料(51]。肌腱损伤通常是与中断相关结构和修理/愈合过程参与重建受伤组织正常功能。因此,尽管他们中的许多人并不肌腱具体,ECM-related基因的表达通常是用作参考评估肌腱干细胞治疗疾病的潜力。在这项研究中,我们确定杆菌亚基的水平COL1A2decorin (宽带运)、弹性蛋白(民族解放军),fibromodulin (在你)和tenascin-c (过渡委员会)bmsc与teno-iPSCs所激发的。我们的数据显示,COL1A2在所有的测试细胞调节治疗涉及TGF -β3所示。TGF -这是符合事实β刺激无处不在的转录因子的结合Sp1, SMAD3/4复杂,辅活化因子p300 / CBPCOL1A2启动子(52]。此外,在teno-iPSCs,COL1A2也激活了类似MKX的过度表达,类似MKX BMP12 /或机械拉伸。自从teno-iPSCs类似MKX的表达增强了机械加载,它是合理的假定的活动ColA2在类似MKX teno-iPSCs可以调节。事实上,以前的研究已经表明COL1A2水平降低类似MKX^{- / -}老鼠(43,44)和增加MKX-overexpressing PDL成纤维细胞(43]。我们的数据也表明,过度的类似MKX单独或结合TGF -β3、BMP12增加或增加的表达趋势COL1A2,宽带运,民族解放军,在你,过渡委员会在所有测试细胞,进一步支持,类似MKX扮演着重要的角色在调节ECM bmsc和teno-iPSCs基因活动。

Decorin(宽带),最丰富的noncollagenous基质蛋白在肌腱53),参与胶原原纤维组织,防止肝纤维化形成(54]。在目前的研究中,宽带运水平bmsc和teno-iPSCs增加了机械tensile-related诱导物。这是部分同意研究从Youngstrom等人,但矛盾的其他研究机械刺激减少宽带运表达在人类主要旋转肌成纤维细胞和C3H10T1/2细胞系(55- - - - - -57]。陈等人的另一项研究显示没有变化宽带运当人类ES-derived msc受到机械应力水平为24小时(26]。这些不一致可能是由于不同的拉伸参数应用。事实上,许等人报道宽带运表达增加了适度的跑步机上跑步但减少了强大的跑步机上跑步在大鼠跟腱58]。值得注意的是,我们的结果也表明了,治疗TGF -β3、BMP12导致显著的海拔宽带运在teno-iPSCs而不是bmsc,表明监管宽带运活动TGF -β信号是依赖于细胞类型的。

Fibromodulin报道是必不可少的肌腱干细胞利基市场的维护3],它的缺乏导致了结构和机械不正常肌腱表型(59]。许等人报道,循环拉伸应变诱导的表达在你在鼠TPSCs [60];然而,我们的数据表明,机械负荷的影响很小在你活动bmsc teno-iPSCs,表明监管作用表达式通过机械力对细胞类型也不同。此外,从棕褐色等人的研究表明,目标删除TGF -βr2的水平下降在你在鼠标tenocytes [15),这表明TGF -β信号是参与在你活动。事实上,在我们的研究中,水平调节TGF -β3-treated bmsc TGF -β3 -或BMP12-treated teno-iPSCs。

弹性蛋白是核心蛋白弹性纤维具有独特的能力来维持大变形(61年]。而打乱了弹性纤维与慢性病变的发展(62年),增加肌腱受伤的弹性蛋白的表达表明,它可能扮演一个角色在愈合过程38,63年]。在类似MKX^{- / -}鼠标跟腱,民族解放军水平远高于野生型,类似MKX指示可能抑制民族解放军基因活性(44]。然而,我们的数据有点矛盾,找到类似MKX的超表达水平的升高民族解放军在teno-iPSCs bmsc但不是,这表明转录因子类似MKX的目标(s)是依赖于细胞类型的。此外,虽然最小等。l报道,机械应变表达下调的表达民族解放军在人类子宫旁的韧带成纤维细胞(64年),我们的研究结果表明,机械tensile-related抗病诱导剂调节民族解放军伴着。这种不一致暗示的反应民族解放军基因生物物理力也依赖于细胞类型。

Tenascin C表达相对较低,在成熟的肌腱和建议扮演一个角色在适当的对齐和取向肌腱中的胶原原纤维(65年]。的显著增加过渡委员会在敏锐地屈肌腱受伤表明它也可能导致肌腱修复(66年]。以前的研究已经表明过渡委员会活动会受到生化和生物力学的影响因素(67年]。在我们的研究中,所有的测试刺激增强的表现过渡委员会teno-iPSCs,也获得了类似的调查结果从bmsc对待所有刺激BMP12除外。尽管这些数据不同意研究表明降低了过渡委员会在机械压力C3H10T1/2细胞(57),增加过渡委员会在BMP12-treated鼠bmsc [46,变量的表达过渡委员会TGF -βESCs 3-treated马和万能18),它们在协议与其他研究报告增加了过渡委员会在人类bmsc[机械紧张68年),在TGF -β3-treated马ADMSCs [69年]。

Tenomodulin的跨膜糖蛋白,广泛接受作为tenogenic分化的特定的标志,因为它主要是表现在肌腱和韧带。SCX是迄今为止唯一一转录因子直接transactivate发现TNMD通过E-boxes积极调节tenocyte分化和成熟70年]。在我们的研究中,但不知什么原因,qPCR几套引物未能发现TNMD在任何类型的RNA水平细胞在这项研究中,使用免疫印迹结果显示明显增加SCX和TNMD TGF -β3 -或BMP12——综合治疗。另一方面,Kayama等人表明,删除类似MKX调节的表达SCX但并不是说TNMD在鼠标跟腱45),这意味着激活SCX并不总是相关的表达吗TNMD。在当前的研究中,尽管SCX明显表达,没有检测到TNMD控制或刺激teno-iPSCs,表明代数余子式(s),可能不表达或teno-iPSCs不足,可能需要SCX-mediatedTNMD激活。

综上所述,我们的研究结果表明,tenogenic基因的激活不仅依赖于诱导细胞类型之间也不同。对成熟的表达tenocyte标记TNMD成骨基因表达的减少,激活TGF -β信号TGF -β3或BMP12结合转录因子莫霍克的异位表达可能适合bmsc tenocyte-lineage分化。然而,缺乏TNMD表达式teno-iPSCs需要进一步工作的优化条件tenogenic分化。

4.3。对潜在的信号因素调节

肌腱发展的潜在分子机制一般认为成人组织再生中扮演类似的角色。受伤后,各种生长因子和细胞因子释放的肌腱受伤和邻近组织(71年,不同的信号通路,包括TGF -β-SMAD2/3、BMP-SMAD1/5/8 ERK / MAPK mTOR和Wnt /β连环蛋白,据报道,与肌腱发展和修复(34,72年- - - - - -74年]。SMAD7是一个TGF -β诱导拮抗剂的TGF -β信号(33]。它也可以引起其他细胞因子和生长因子,如干扰素-γ肿瘤坏死因子-α、表皮生长因子(75年- - - - - -77年),这表明SMAD7有关在不同信号通路之间的串扰。在目前的研究中,TGF -β3刺激的表达SMAD7bmsc和teno-iPSCs,这意味着一个调节的作用SMAD7在负反馈循环。此外,由于机械负荷积极调节TGF -β信号,因此,毫不奇怪水平的增加SMAD7在拉伸bmsc。有趣的是,在teno-iPSCs并没有观察到这种效应。一个可能的原因是,生化信号转换从这项研究中使用的机械力刺激/维护的表达不足SMAD7在teno-iPSCs。

ETV4是ETS域转录因子家族的一员。其transactivation能力增强后的激活ERK -物- MAPK信号通路(78年),因此可以作为转录读出ERK / MAPK活性。在最近的研究中,ETV4调节了TGF -β3 bmsc和iPSC3,表明细胞ERK和TGF之间的串扰β信号通路。此外,机械拉伸可以诱导ERK1/2磷酸化在初级肌腱成纤维细胞(79年),我们的数据也显示增加了ETV4表达机械加载bmsc,表明ERK信号可以通过机械力被激活。另一方面,类似于发现ERK1/2并非由机械力在人类皮肤角化细胞细胞激活80年),stretch-induced表达ETV4在teno-iPSCs尚不明显,这意味着机械loading-mediated ERK活化可能依赖于细胞类型。进一步的工作需要了解的角色在干细胞分化tenogenic ERK信号通路。

Sirtuin-1 (SIRT1)是一种NAD⁺端依赖第三类HDAC针对两组蛋白和非组蛋白的蛋白质。它可以抑制细胞凋亡和炎症反应在人类tenocytes [81年)和调解免疫的激活/机械拉伸诱导防御基因的人类PDL细胞(82年]。有趣的是,尽管类I / II HDAC抑制剂trichostatin和丙戊酸促进SCX表达式在鼠标TSPCs [83年,过度的SIRT1同时调节SCX在鼠bmscSIRT1物/ SMAD1-PPARg信号通路是占BMP14-induced tenogenic分化(84年]。此外,SIRT1表达下调了TGF -β并确定为TGF -的重要调节器β/ SMAD信号在成纤维细胞激活和组织纤维化85年]。在我们的研究中,SIRT1bmsc teno-iPSC1并没有受到任何测试tenogenic刺激,但它在teno-iPSC3增强在某些情况下,包括过度的莫霍克,机械拉伸结合TGF -β3、BMP12,表明监管网络SIRT1基因活性细胞类型之间是不同的。需要更多的研究来揭示角色的hdac tenogenic基因表达的调控干细胞。

5。结论

总之,我们的研究结果强调bmsc和teno-iPSC举行重大tenogenic分化能力。然而,tenogenic基因的激活是高度依赖之间的诱导物和不同iPSC克隆以及细胞类型之间。因此,额外的评估需要tenocyte-related基因的表达来实现的目的使用predifferentiated干细胞肌腱修复和再生。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

FKY DWR研究构思,设计实验,分析数据,并写了手稿。FKY进行了实验。

确认

作者要感谢Drs。罗伯特·l·莫克和Su-chin Heo机械加载实验。这项工作是由詹姆斯•基金会Applestone农场,和部分由NIH / NIAMS (P30AR069619)。

补充材料

补充1。补充图1 Multilineage bmsc的分化能力。A、B在体外bmsc的成骨分化。钙沉积透露了茜素红染色。C, D在体外脂肪形成的bmsc的分化。被油红染色显示脂肪滴。E, F在体外teno-iPSCs chondrogenic分化。蛋白多糖蛋白质的生产被阿尔新蓝染色显示。

补充2。补充图2表达GFP的lentiviral-infected teno-iPSCs和综合。Teno-iPSCs (A)和bmsc (B)感染了慢病毒表达GFP类似MKX单独或和GFP 5天。GFP信号是在荧光显微镜成像。

补充3。TGF -图3补充剂量的影响β3在iPSC1 tenogenic基因表达。iPSC1处理车辆中(0)或不同浓度的TGF -β3 (4、20、100 ng / mL) 5天,和总RNA的互补脱氧核糖核酸合成。tenogenic转录因子的表达(A), chondrogenic转录因子Sox9、成骨的转录因子RUNX2 (B),和tenocyte-related ECM基因(C)由qPCR决定。相对褶皱变化计算每组相比之下汽车媒介集团,从3通道和数据进行了综述。数据比较BSA控制;^#数据相比4 ng / mL组;^美元数据比较20 ng / mL。

补充4。补充图4剂量BMP12在iPSC1 tenogenic基因表达的影响。细胞处理车辆介质浓度(0)或各种BMP12 (4、20、100 ng / mL) 5天,和总RNA的互补脱氧核糖核酸合成。tenogenic转录因子的表达(A)、SOX9, RUNX2 (B),和tenocyte-related ECM基因(C)由qPCR决定。相对褶皱变化计算每组相比之下汽车媒体集团,从3通道和数据进行了综述。数据比较BSA控制;^#数据相比4 ng / mL组;^美元数据相比20 ng / mL。

补充5。补充图5小天狼星红染色TGF -β3 -和BMP12-treated teno-iPSCs和综合。TGF -细胞治疗β3、BMP12 5天,然后用小天狼星红固定和染色。B定量天狼星红染色。 ; 。

补充6。补充图6超表达类似MKX的bmsc teno-iPSCs。bmsc, teno-iPSCs感染了慢病毒表达GFP (lenti-GFP)或马莫霍克和GFP (lenti-MKX) 5天,和整个细胞溶解产物类似MKX玷污了α微管蛋白。

补充7。补充TGF -图7的影响β3、BMP12 tenogenic基因表达在MKX-overexpressing iPSC1。细胞表达绿色荧光蛋白或马莫霍克处理车辆介质(GFP / BSA和类似MKX / BSA), TGF -β3 (20 ng / mL, GFP / TGF -β3和类似MKX / TGF -β3)或BMP12 (20 ng / mL, GFP / BMP12和类似MKX / BMP12)为5天。总RNA的互补脱氧核糖核酸合成,tenogenic转录因子的表达(A), SOX9、RUNX2 (B)和tenocyte-related ECM基因(C)由qPCR决定。相对褶皱变化计算每组相比之下GFP-CTRL组。数据与GFP / BSA组相比,和^#数据比较类似MKX / BSA组。

补充8。补充表1列出的引物对用于在这项研究中存在。

引用

1. 迪普雷g . Nourissat f·鲍姆,d,自己叙说“肌腱修复肌腱损伤:从生物学,”自然评论风湿病学,11卷,不。4、223 - 233年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. d·加斯帕k . Spanoudes c . Holladay a·潘迪特和d . Zeugolis“肌腱修复的细胞疗法的进展。”先进的药物输送的评论卷,84年,第256 - 240页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. y Bi, d . Ehirchiou t . m .撩起et al .,“识别肌腱干细胞/祖细胞和细胞外基质的角色在他们的利基市场,”自然医学,13卷,不。10日,1219 - 1227年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. 问:棕褐色,y . f .鲁伊·p·p·卢伊和y . m . Wong“比较潜能的干细胞分离肌肉骨骼组织工程肌腱和骨髓,“组织工程。部分,18卷,不。7 - 8,840 - 851年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. j·f·j .郭k . m . Chan, g·李,“自发tenogenic Tendon-derived干细胞分化,”实验细胞研究,卷341,不。1、1 - 7,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 美国韦伯,c . Gabrelow j .皮尔斯e·吉布和j·艾略特,“视黄酸受体信号保留了肌腱干细胞特征和防止体外自发分化,“干细胞研究与治疗,7卷,不。1,p。2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. m·t·哈里斯·d·l·巴特勒,g . p . Boivin j·b·福罗·e·j .注意力和r . j . Wenstrup“间充质干细胞用于兔肌腱修复可以形成异位骨和表达碱性磷酸酶活动构造,“骨科研究期刊》的研究,22卷,不。5,998 - 1003年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. w·徐y . Wang大肠刘et al .,“人类iPSC-derived神经嵴干细胞促进老鼠髌腱腱修复窗口缺陷模型,”组织工程。部分,19卷,不。21 - 22日举行,2439 - 2451年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 美国高,t . Satake a Goto et al .,“诱导多功能干细胞tenocyte-like细胞促进肌腱受伤的再生在老鼠中,“科学报告,10卷,不。1,p。3992年,2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 美国森林:贝茨,s l·邓恩,f . Serracino-Inglott t . e . Hardingham和s . j .金柏”代人为多能干细胞从前交叉韧带,”骨科研究期刊》的研究,38卷,第104 - 92页,2019年。视图:谷歌学术搜索
11. j . Gorecka诉Kostiuk a Fereydooni et al .,“诱导多能干细胞的潜力和限制达到伤口愈合,”干细胞研究与治疗,10卷,不。1,p。87年,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. n·m·多部电影,g·哈特斯利,k·考克斯et al .,“异位诱导大鼠肌腱和韧带的生长分化因子5,6,7,鉴定及基因家族的成员,“《临床研究杂志》上,卷100,不。2、321 - 330年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. b . a . Pryce s s华生,n . d . Murchison j . a . Staverosky n . Dunker和r·施韦策”招聘和维护TGFbeta肌腱祖细胞的信号对肌腱的形成至关重要,”发展,卷136,不。8,1351 - 1361年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. t . Barsby和d .客人”转化生长因子beta3促进肌腱马embryo-derived干细胞的分化,“组织工程。部分,19卷,不。月19日至20日,第2165 - 2156页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. g . k . Tan b . a . Pryce a Stabio et al .,“Tgfbeta信号肌腱细胞命运的维护至关重要,”eLife,9卷,2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. s . c . k . m . Chan傅,y . p . Wong w . c .回族y . c . Cheuk和m . w . Wong“转化生长因子β亚型的表达和他们的角色在肌腱愈合,”伤口修复和再生,16卷,不。3、399 - 407年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. z Kapacee, c . y . Yeung y, d .瑰柏翠d·f·霍姆斯和k . e . Kadler合成由人类骨髓基质/胚胎的肌腱组织的间充质干细胞需要三维环境和转化生长因子β3,“矩阵生物学卷,29号8,668 - 677年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. e . p .柴o . Smith, a·e·贝尔德l . c . Smith和d . j .客人,”马诱导多能干细胞有减少肌腱分化能力与胚胎干细胞相比,“兽医科学前沿,卷2,p . 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 成员,b . j .高涨,r·t·克拉克诉Gaschen和e·b·亨泽尔,“GDF-5老鼠缺乏改变了超微结构,力学性能和跟腱的成分,”骨科研究期刊》的研究,19卷,不。3、365 - 371年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. b .成员、k . Rossmeier和l . Bierwert“两性异形在小鼠肌腱GDF-6不足的影响,“骨科研究期刊》的研究,27卷,不。12日,第1611 - 1603页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. b .成员、l . Bierwert和d·祖文萃”GDF-7缺陷小鼠,跟腱描述”骨科研究期刊》的研究,24卷,不。4、831 - 841年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. s . Violini p . Ramelli l . f . Pisani c . Gorni p·马里安尼,”马骨髓间充质干细胞表达胚胎干细胞标记和显示的能力通过体外接触BMP-12 tenogenic分化,“BMC细胞生物学,10卷,不。1,p。29日,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. b . r . Gulati r·库马尔n .莫汉蒂·库马尔·r·k . Somasundaram和p . s . Yadav,“骨形成protein-12诱发tenogenic分化的间充质干细胞来源于马羊水,”细胞、组织、器官,卷198,不。5,377 - 389年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. h .沈r·h·Gelberman m·j·席尔瓦s e . Sakiyama-Elbert和s . Thomopoulos”BMP12诱发tenogenic脂肪基质细胞分化,“《公共科学图书馆•综合》,8卷,不。10篇文章e77613 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. w·Zarychta-Wisniewska a . Burdzinska a Kulesza et al .,“Bmp-12激活tenogenic通路在人类脂肪干细胞和影响他们的免疫调节和分泌特性,”BMC细胞生物学,18卷,不。1,p。13日,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. 陈x, z, j·l . Chen等人“Scleraxis-overexpressed人类胚胎干细胞间充质干细胞与针织silk-collagen肌腱组织工程支架,”组织工程。部分,20卷,不。11 - 12,1583 - 1592年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 长谷川k . Otabe h . Nakahara a . et al .,“转录因子莫霍克控制tenogenic分化的骨髓间充质干细胞在体外和体内,”骨科研究期刊》的研究,33卷,不。1,1 - 8,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. f·杨,张a和d·w·理查森,“监管马tenocyte-derived tenogenic基因表达的诱导多能干细胞通过机械负荷和莫霍克,”干细胞研究,39卷,p。101489年,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. l . Gaut n . Robert a . Delalande m·a . Bonnin c . Pichon迪普雷和d,自己叙说”EGR1调节转录机械的下游信号腱形成和治疗期间,“《公共科学图书馆•综合》,11卷,不。11篇文章e0166237 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. 吴z阴,j .郭t . y . et al .,“逐步分化的间充质干细胞增加肌腱组织形成和缺陷修复体内,”干细胞转化医学,5卷,不。8,1106 - 1116年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. a·范德·亚克j .曹TGF -李和x。β受体:内外TGF -β信号。”细胞信号52卷,第120 - 112页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. y . e .张“Non-Smad TGF -的信号通路β家庭,”冷泉港在生物学角度,9卷,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. a . Nakao m . Afrakhte a Moren et al .,“识别Smad7, TGFbeta-inducible拮抗剂及信号,”自然,卷389,不。6651年,第635 - 631页,1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. e . Havis m·a . Bonnin j .斯特维斯•德利马b·布思c .小米和迪普雷d,自己叙说”TGFβ和FGF促进肌腱祖命运和行为下游的肌肉收缩调节肌腱分化在小鸡肢体发展,”发展,卷143,不。20日,第3851 - 3839页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. n . d . Murchison b . a .价格d·a·康纳et al .,“监管的肌腱分化scleraxis force-transmitting肌腱有别于muscle-anchoring肌腱,”发展,卷134,不。14日,第2708 - 2697页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. s . s . w . Liu华生,y局域网et al .,“非典型homeodomain转录因子莫霍克控制肌腱形态发生,”分子和细胞生物学,30卷,不。20日,第4807 - 4797页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. 铃木h . y .伊藤m .筱原et al .,“转录因子的基因打靶莫霍克老鼠导致异位骨化的跟腱通过tenogenesis失败,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷113,不。28日,第7845 - 7840页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. m . j . Guerquin b·布思g . Nourissat et al .,“转录因子EGR1指导肌腱分化并促进肌腱修复,”《临床研究杂志》上,卷123,不。8,3564 - 3576年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. h·a·萨非r s Nagalingam, m . p . Czubryt“Scleraxis: force-responsive细胞表型的监管机构,”目前看来生理学1卷,第110 - 104页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. j·p·布朗诉g·芬利,c . k .郭”胚胎机械和可溶性信号调节肌腱祖细胞基因表达的发育阶段和解剖起源,”生物力学杂志卷,47号1,第222 - 214页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. Maeda t, t . Sakabe a Sunaga et al .,“机械力转化为TGF -β介导的生化信号。”当代生物学,21卷,不。11日,第941 - 933页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. h·刘,张c, s .朱镕基et al。”莫霍克促进间充质干细胞的tenogenesis TGF通过激活β信号通路。”干细胞,33卷,不。2、443 - 455年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. n .幸田来未t .佐藤m .筱原et al .,“转录因子的莫霍克牙周韧带的同源框调节体内平衡,”发展,卷144,不。2、313 - 320年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. y Ito n . Toriuchi t Yoshitaka et al .,“莫霍克同源框基因的关键调节器肌腱分化,“美国国家科学院院刊》上,卷107,不。23日,第10542 - 10538页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. t . Kayama m . Mori y Ito et al .,“Gtf2ird1-dependent莫霍克表达调节mechanosensing肌腱的性质,“分子和细胞生物学,36卷,不。8,1297 - 1309年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. j.y.李,周z, p . j .陶布et al .,“BMP-12治疗成人间充质干细胞体外增强的肌腱组织形成和缺陷修复体内,”《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。第三条e17531, 2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. z l .问:w . Wang Chen和y . r .朴”间充质干细胞分化成tenocytes通过骨形成蛋白(BMP) 12基因转移,”生物科学和生物工程杂志》上,卷100,不。4、418 - 422年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. 诉Lejard f . Blais m . j . Guerquin et al .,“EGR1, EGR2参与脊椎动物肌腱分化。”《生物化学》杂志上,卷286,不。7,5855 - 5867年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. 问:刘、朱y j . Qi et al .,“土耳其的隔离和表征骨骨髓来源间充质干细胞,”骨科研究期刊》的研究,37卷,不。6,1419 - 1428年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. n . Fahy m . Alini, m·j·斯托达特”机械刺激的间充质干细胞:影响软骨组织工程,“骨科研究期刊》的研究,36卷,不。1、52 - 63年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. h . r .屏幕,d·e·伯克,k . e . Kadler f·拉米雷斯和m . f .年轻,“肌腱功能细胞外基质,骨科研究期刊》的研究,33卷,不。6,793 - 799年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. f·拉米雷斯,s .田中,g . Bou-Gharios“转录调控人类alpha2 (I)胶原蛋白基因(COL1A2)、一个信息模型系统研究纤维化疾病,”矩阵生物学,25卷,不。6,365 - 372年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. c·t·索普h·l .桦木、p·d·克莱格和h r .屏幕,“non-collagenous矩阵在肌腱功能的角色,”国际实验病理学杂志》上,卷94,不。4、248 - 259年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. w·张,y通用电气、问:张先生,问:Cheng l .方和j .郑”Decorin是一个关键的效应细胞外基质与肿瘤微环境,”Oncotarget,9卷,不。4、5480 - 5491年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
55. d . w . Youngstrom j . e . LaDow和j·g·巴雷特,“Tenogenesis骨髓、脂肪、tendon-derived干细胞在动态生物反应器,”结缔组织的研究卷,57号6,454 - 465年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
56. b . Lohberger h .柯廷安n . Stuendl rin, a . Leithner和p . Sadoghi”循环机械刺激影响细胞外基质蛋白的表达在人类主要旋转肌成纤维细胞,”膝盖手术,运动创伤学,关节镜检查,24卷,不。12日,第3891 - 3884页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
57. a·e·c·尼科尔斯s . r . Werre, l·a·达利“瞬态scleraxis过度加上循环应变增强韧带细胞分化,“组织工程。部分,24卷,不。月19日至20日,第1455 - 1444页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
58. 郑胜耀徐、刘郑胜耀徐l . et al .,“响应decorin不同强度的跑步,”分子医学报告,17卷,不。6,7911 - 7917年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
59. l . Svensson a . Aszodi f p . Reinholt r . Fassler d . Heinegard和a . Oldberg”Fibromodulin-null小鼠胶原原纤维异常,组织机构,和改变lumican沉积在肌腱,”《生物化学》杂志上,卷274,不。14日,第9647 - 9636页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
60. y y,问:Wang d·李et al .,“循环拉伸应变诱发tenogenic tendon-derived干细胞的分化在生物反应器文化中,“生物医学研究的国际文章ID 790804卷,2015年,13页,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
61. t·m·格兰特,m . s . Thompson j .城市和j . Yu”弹性纤维广泛分布在肌腱和高度本地化tenocytes左右,“解剖学杂志,卷222,不。6,573 - 579年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
62. y . t . Wu w·r·苏·t·吴p c .沈和i . m .周素卿、“退化的弹性纤维和高弹性蛋白酶表达长腱子病变衰退的肱二头肌,“骨科研究期刊》的研究,35卷,不。9日,第1926 - 1919页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
63. d·塔迦尔·t·m·格兰特,o .哈基米和a·j·卡尔,“VI型胶原蛋白和弹性纤维的分布和表达在人类肩袖肌腱流泪,“结缔组织的研究,55卷,不。5 - 6,397 - 402年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
64. 刘j . Min b, c . et al .,“细胞外基质代谢障碍引起的机械应变对人类子宫旁的韧带成纤维细胞,”分子医学报告,15卷,不。5,3278 - 3284年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
65. e·j·麦基和美国拉姆齐的表达tenascin joint-associated组织在发展和产后增长,”解剖学杂志,第188卷,第1部分,157 - 165年,1996页。视图:谷歌学术搜索
66. s e·泰勒,a . Vaughan-Thomas d·n·克莱门茨et al .,“基因表达标记的肌腱成纤维细胞在正常和病变组织相比,单层、三维培养系统”BMC肌肉骨骼疾病,10卷,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
67. t·a·贾维l . Jozsa p Kannus et al .,“机械负荷调节tenascin-C myotendinous结和肌腱的表达但不引起骨骼肌的从头合成,“《细胞科学,卷116,不。5,857 - 866年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
68. y秋j . Lei t . j . Koob和j·s . Temenoff“环张力促进成纤维细胞的分化人类胶原纤维支架上培养的msc、”组织工程和再生医学杂志》上,10卷,不。12日,第999 - 989页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
69. s p·罗斯,w . Brehm c .总p·麦克尔s舒伯特和j·伯克,”转化生长因子β3-loaded脱细胞马为骨科组织工程肌腱矩阵,”国际分子科学杂志》上,20卷,不。21日,第5474页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
70. c . Shukunami a . Takimoto y Nishizaki et al .,“Scleraxis是一个调节的转录激活因子的表达tenomodulin,成熟的一个标志tenocytes ligamentocytes,”科学报告,8卷,不。1,p。3155年,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
71. t·莫雷y王,g .马雷尔”的角色在肌腱和韧带愈合生长因子,”运动医学,33卷,不。5,381 - 394年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
72. 江j . Lim e . Munivez m . m . et al .,“mTORC1产后肌腱发展的信号是一个重要的监管机构,”科学报告,7卷,不。1,p。17175年,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
73. x x, x s . Rao j . x林et al .,“激活AKT-mTOR信号指导tenogenesis间充质干细胞,”干细胞,36卷,不。4、527 - 539年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
74. 岸本y, b . Ohkawara Wnt / t .酒井法子et al。。β连环蛋白信号抑制的表情Scx,类似Mkx Tnmd tendon-derived细胞,”《公共科学图书馆•综合》,12卷,不。7篇文章e0182051 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
75. 梁m .比泽尔·g·冯·阻止,d . et al .,“抑制机理及/ nf -κB / RelA SMAD信号,”基因与发展,14卷,不。2、187 - 197年,2000页。视图:谷歌学术搜索
76. h·翁·r·莫顿a . m . Gressner和s Dooley”IFN-gamma废除profibrogenic及肝脏的信号定位的表达抑制性受体Smads,”肝脏病学杂志,46卷,不。2、295 - 303年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
77. 金,j .汉s . k . Lee et al .,“Smad7作为负调节的表皮生长因子(EGF)在乳腺癌细胞信号通路,”癌症的信,卷314,不。2、147 - 154年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
78. 欧哈根,r·c·r·g·泽·m·西蒙斯f·麦考密克和j·a . Hassell设计“Ets转录因子的活动PEA3是由两个截然不同的MAPK级联,”致癌基因,13卷,不。6,1323 - 1333年,1996页。视图:谷歌学术搜索
79. j . z .帕克斯顿·哈格蒂j . j . Andrick和k·巴尔,“优化断断续续拉伸模式使用ERK1/2磷酸化导致工程韧带胶原合成增加,”组织工程。部分,18卷,不。3 - 4、277 - 284年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
80. k .西村p·布鲁姆,s . Ohgi, b . e . Sumpio”不同频率的拉伸的效果对人类皮肤角化细胞增殖和生存,”外科杂志》的研究,卷155,不。1,第131 - 125页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
81. f·布希,a . Mobasheri·扎r . Stahlmann和m . Shakibaei”需要sirt - 1基因的抑制细胞凋亡和炎症反应在人类tenocytes”《生物化学》杂志上,卷287,不。31日,第25781 - 25770页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
82. s . i . Lee, k . h .公园,s . j . Kim y . g .康y . m . Lee和e·c·金,“机械压力激发了免疫反应通过Sirtuin蛋白1基因表达在人类牙周韧带细胞,”临床和实验免疫学,卷168,不。1,第124 - 113页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
83. 杨张c, e . l . et al .,“组蛋白脱乙酰酶抑制剂治疗细胞表从鼠标肌腱干细胞/祖细胞促进肌腱修复,”生物材料卷,172年,第82 - 66页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
84. d . Wang x江,a, m .你w·黄和p .黄”BMP14诱发tenogenic分化的骨髓间充质干细胞体外<我> < / i >,“实验和医学治疗,16卷,不。2、1165 - 1174年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
85. p . Zerr k . Palumbo-Zerr黄j . et al .,“Sirt1调节规范及信号控制纤维母细胞激活和组织纤维化,”风湿性疾病上卷,75年,第233 - 226页,2015年。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2021 Feikun杨和迪恩·w·理查森。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。