NAT10促进间充质干细胞的成骨分化调节N4-Acetylcytidine小鬼1的修改

文摘

客观的。调查的功能在间充质干细胞(MSC) NAT10成骨分化和学习的机制NAT10影响MSC骨通过调解小鬼1 N4-acetylcytidine (ac⁴C)修改。方法。成骨分化的msc诱导,成骨的能力评估与茜素红S (ARS)和碱性磷酸酶(ALP)测定。NAT10表达水平在MSC骨是通过免疫印迹(WB)来衡量的。msc与慢病毒转染抑制(Sh-NAT10)或过表达NAT10 (Over-NAT10)和成骨分化能力评估ARS,高山,成骨基因标记化验。β连环蛋白,一种蛋白激酶,Smad信号通路组件激活水平进行评估,和关键Smad信号通路的表达水平分子是由PCR和白平衡。小鬼1 mRNA ac⁴使用RIP-PCR C水平进行了分析,Gremlin 1信使rna降解率决定。Sh-Gremlin 1转染进一步调查的角色NAT10 MSC骨生成和小鬼1。结果。在MSC骨生成,NAT10表达式,ARS染色,高山水平逐渐增加。减少NAT10表达抑制,并增加NAT10表达促进了MSC成骨分化。NAT10 BMP / Smad而不是一种蛋白激酶和影响β连环蛋白信号通路激活通过调节小鬼1表达。小鬼1 mRNA ac⁴正受NAT10 C水平,加速小鬼1退化。Sh-Gremlin 1废除了奖励的NAT10对MSC成骨分化的影响。结论。NAT10积极调控MSC成骨分化通过加速小鬼1信使rna降解增加ac⁴C的水平。这些结果可能会提供新的机械的见解MSC骨和骨代谢在活的有机体内。

1。介绍

间充质干细胞(msc),在1976年第一次为特征,与multipotency干细胞在活的有机体内(1]。除了强大的监管能力作为免疫系统的组件,msc具有trilineage分化的能力,即成骨分化,chondrogenic分化,分化脂肪形成的2,3]。成骨细胞的主要前体,msc大大有助于人体骨骼的新陈代谢(4]。此外,msc广泛应用于组织工程应用程序,尤其是骨修复(5]。以前,许多研究人员调查了MSC分化成骨的机制,,然而,仍不清楚。

msc的功能是由各种各样的RNA控制的修改(6]。最近,N⁴-acetylcytidine(交流⁴C)修改被发现广泛分布在人体细胞RNA (7]。信使核糖核酸(mrna)改性ac⁴C展览他们的稳定和降解率的差异,因此影响了基因的表达和随后的功能的细胞(8]。N-Acetyltransferase 10 (NAT10)是一个关键的RNA乙酰转移酶介导ac⁴C修改mRNA (9]。然而,NAT10是否会影响通过ac msc的成骨分化能力⁴C改性是未知的。

小鬼1,184高度保守的氨基酸蛋白质,是胱氨酸结总科的一员。骨形成蛋白(BMP)拮抗剂,Gremlin 1显示了一个能力强的抑制成骨分化的msc针对BMP2 BMP4,发挥重要作用在骨骼发育(10]。然而,Gremlin 1表达的上游调控机制从未被研究过。

在这项研究中,我们调查了NAT10在MSC骨生成的作用。我们的研究结果表明,NAT10增加了交流⁴C修改麻烦1 mRNA和加速其降解率,BMP / Smad激活信号通路,积极调节msc的成骨分化能力。这些结果强调NAT10-mediated交流的重要性⁴C改性msc及成骨分化的可能提供新的见解msc在骨组织工程的临床使用。

2。材料和方法

2.1。文化的人类骨骼msc

人类骨骨髓来源msc买来PromoCell(德国海德堡)和在生长培养基培养(低糖DMEM (Gibco)含10%胎牛血清(的边后卫;penicillin-streptomycin Gibco), 1%, 1%谷氨酰胺)在75厘米²文化的菜肴在37°C公司5%₂。培养基是改变每3天。所有实验都使用细胞通道执行3 - 5。

2.2。诱导成骨的分化

对成骨细胞的分化,msc在成骨细胞分化培养基培养(10%胎牛血清(Gibco;热费希尔科学,Inc .), 10 nM地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐,50μL-glucose g / ml抗坏血酸,1%,1% penicillin-streptomycin)从天0到14天。成骨诱导介质是每2天更换一次。

2.3。ARS染色

msc受到成骨分化为0 - 14天。中被丢弃,PBS的细胞被洗3次,4%多聚甲醛固定30分钟37°C在黑暗中,沾染了40毫米ARS (Sigma-Aldrich)在室温下15分钟。观察钙化结节和图片是使用一个倒置光学显微镜(放大,40 x)。

ARS量化,茜素红提取10%氯化十六烷吡啶一水(中国共产党,Meilunbio) 60分钟在室温下用颤抖的。提取上清液的吸光度测量在562海里。

2.4。高山染色和活动分析

高山染色根据制造商的指示执行从0到14天开始后的成骨的归纳。总之,细胞用PBS 3 * 5分钟洗净,和适量的BCIP /电视台染色的解决方案是补充道。样品在室温下孵化在黑暗中20分钟。细胞与蒸馏水洗两次终止反应。染色细胞在显微镜下获得的图像。

高山活动是衡量使用修改后的大逃亡SEAP化学发光测定(BD Clontech山景,CA)基于最初的分泌碱性磷酸酶(SEAP)酶记者分析,不需要细胞溶菌作用。msc与裂解缓冲细胞溶解,离心5分钟。然后,5μl细胞溶解产物上层清液和20μl的高山基质混合,在黑暗中孵化了60分钟。结果,日立7060 c自动生化分析仪。

2.5。免疫印迹分析

总蛋白提取与裂解缓冲msc (Beyotime、海门、中国)含有磷酸酯酶和蛋白酶抑制剂(罗氏,曼海姆,德国)。总共30μ克蛋白质电泳加载每车道。蛋白质分离提取10% sds - page凝胶。后被转移到PVDF膜的蛋白质(EMD微孔),膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下2 h。膜被孵化与初级抗体在一夜之间在4°C和二次抗体室温2 h。乐队和一个可视化增强化学发光(ECL)检测设备(Amersham;通用电气医疗集团)和分析ImageJ软件(版本1.38;美国国立卫生研究院)。以下使用抗体:兔单克隆anti-NAT10(1: 1000年,ab194297 Abcam),兔单克隆anti-GAPDH(1: 1000、2118、细胞信号技术),兔单克隆anti-phospho (p)β连环蛋白(Ser675) (1: 1000、4176、Abcam),兔多克隆抗β连环蛋白(1:1000年,ab16051 Abcam),兔多克隆anti-p-Akt (Thr308)(1: 1000年,ab38449 Abcam),兔单克隆anti-Akt(1: 1000、4685、细胞信号技术),兔单克隆anti-p-Smad1 (Ser463/465) / Smad5 (Ser463/465) / Smad9 (Ser465/467)(1: 1000、13820、细胞信号技术),兔单克隆anti-Smad1(1: 1000年,ab126761 Abcam),兔多克隆anti-Gremlin 1(1: 1000年,ab22138 Abcam),兔单克隆anti-ERK1/2(1: 1000年,ab184699 Abcam),兔单克隆anti-p-ERK1 (T202) / anti-p-ERK2 (T185)(1: 1000年,ab201015 Abcam),兔单克隆anti-Smad2/3(1: 1000年,ab202445 Abcam),兔多克隆p-Smad2/3 (T8)(1: 1000年,ab272332 Abcam),兔单克隆Jagged1 (Jag1)(1: 1000年,ab109536 Abcam),兔单克隆Notch1(1: 1000年,ab52627 Abcam),兔单克隆anti-Gli1(1: 1000年,134906年,Abcam),兔单克隆anti-Sonic刺猬(嘘)(1:1000年,ab53281 Abcam),和一只山羊二级抗体(1:3000年,7074年或7076年,细胞信号技术)。

2.6。慢病毒感染

首先,三个siRNAs针对NAT10和小鬼1设计,和最有效的siRNA被选代的慢病毒。序列用于NAT10击倒的是5 - - - - - -GGCCAAACAAGAACCCAAACA-3 ,序列用于小鬼1击倒的是5 - - - - - -GCATGTGACGGAGCGCAAATA-3 ,和序列用作击倒-控制5 - - - - - -TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3 。代超表达慢病毒,完整的合成NAT10核苷酸序列。击倒和超表达慢病毒是由GenePharma公司。慢病毒是孵化与msc和5μg / ml聚凝胺24 h的莫伊30。

2.7。实时定量PCR(存在)

从细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA数量和质量评估是NanoDrop分光光度计(热费希尔科学公司,奥斯汀,TX,美国)。然后,0.5毫克的RNA是反向转录cDNA使用高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司、纽约、美国)。目标基因检测中存在使用SYBR绿色主人试剂(f .罗氏公司AG)、巴塞尔、瑞士)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被用作衡量内部控制基因表达水平。目标基因的相对表达水平进行评估使用2^{- - - - - -ΔΔCT}方法。引物序列见表1。

2.8。交流⁴C RNA Immunoprecipitation-PCR (RIP-PCR)

交流⁴C撕裂试验进行了使用一个EZ-Magna RIP™rna结合蛋白免疫沉淀反应工具包(Sigma-Aldrich, 17 - 701)根据制造商的指示。总之,RNA提取,然后200或更少的核苷酸化学剪成了碎片。RNA片段与anti-ac孵化⁴C抗体或IgG-conjugated蛋白在4°C / G磁珠过夜。然后,磁珠收集和交流⁴C-modified RNA存在如上所述的分析筛选了。等量的RNA片段不受免疫沉淀反应被用作输入控制。

2.9。RNA的稳定性分析

msc被播种在12-well盘子和放线菌素D处理的浓度为20μ为0,0.5克/毫升,1和2 h。治疗后,立即提取RNA, PCR进行。目标的周转率和半衰期mRNA分析降解率计算。

2.10。统计分析

SPSS 21.0(美国纽约阿蒙克的IBM公司)是用于统计分析。测量数据与正态分布和均匀的方差表示为 值的三个独立的实验。一个未配对 - - - - - -采用测试分析实验两组之间的差异,而单向方差分析(方差分析)其次是图基的事后测试是用于比较数据在多个组。重复测量方差分析其次是Bonferroni事后测试被用来分析数据在多个组在不同时间点。一个值< 0.05被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。NAT10调节在成骨分化的msc

首先,我们进行成骨诱导msc分化和评估ARS的成骨分化能力在不同的时间点和高山化验。钙结节的数量可以由ARS染色后从第0天增加到第14天感应(数字1(一)和1 (c))。高山化验的结果是一致的与ARS染色(数字1 (b)和1 (d))。因此,蛋白质水平的NAT10增加msc接受成骨分化,及其表达模式相似,证明了农业研究所和高山化验(图1 (e))。

3.2。NAT10积极调控msc的成骨的能力

进一步探索NAT10在msc的成骨分化,我们构建慢病毒表达的shRNA NAT10击倒(Sh-NAT10)。下面的实验来研究NAT10在成骨分化的作用进行了归纳。14天后免疫印迹结果(WB)证实,该成分有效地抑制在msc NAT10(图的表达2(一个))。NAT10表达式后抑制,ARS染色水平和量化,在msc和高山活动和染色强度显著降低相比在诱导组和控制慢病毒组(数字2 (b)和2 (c))。RUNX2,OCN,OPN标记基因常用的监测MSC骨生成。所有这些标记的信使rna表达水平降低Sh-NAT10组(图2 (d))。这些结果表明,击倒NAT10抑制骨的msc。

我们进一步生成另一个慢病毒过度表现NAT10 (Over-NAT10)。世行的结果证实感染Over-NAT10慢病毒产生有效的超表达NAT10 msc(图2 (e))。此外,农业研究所和高山Over-NAT10组染色远远强于感应和控制慢病毒组(数字2 (f)和2 (g))。因此,的mRNA水平RUNX2,OCN,OPN有显著增加(图2 (h))。总之,我们确定NAT10积极监管msc的成骨能力。

3.3。NAT10监管Smad1/5/9信号通路的激活,通过交流小鬼1的表达⁴C修改

然后我们决定的激活水平β连环蛋白,一种蛋白激酶,Smad1/5/9 Smad2/3 FGF / ERK,‘诺金’,刺猬信号通路,据报道重要的骨生成的msc。尽管的激活水平β连环蛋白,一种蛋白激酶,Smad2/3、FGF / ERK‘诺金’,和刺猬通路保持不变在NAT10 msc击倒或过度后,Smad1/5/9信号通路的激活Sh-NAT10组明显减少,但增加Over-NAT10组(图3(一个)),这表明NAT10积极监管Smad1/5/9信号通路的激活。我国的Smad1/5/9信号通路被激活。因此,我们进一步探讨多个BMP的mRNA水平家庭成员和他们的对手。结果表明,mRNA水平的大多数BMP和BMP拮抗剂调制NAT10表达(图后保持稳定3 (b))。然而,小鬼的mRNA水平1拮抗剂BMP2和4,Sh-NAT10组显著增加,但减少Over-NAT10组(图3 (b))。此外,世行的结果表明,Gremlin 1的蛋白质含量与(图的mRNA水平是相一致的3 (c))。

先前的研究表明,NAT10介导ac⁴C修改然后影响基因表达。因此,我们测量了交流⁴C在小鬼1 mRNA水平。交流的结果⁴C RIP-PCR显示交流的水平⁴C在小鬼1 mRNA在MSC分化成骨的增加从0到天14(图3 (d))。此外,抑制NAT10表达交流减少⁴C水平小鬼1 mRNA在msc,过度的NAT10显著增加了交流⁴在小鬼1 mRNA(图C水平3 (e))。此外,抑制NAT10表达明显减少了小鬼的降解率1 mRNA(图3 (f))。相反,过度的NAT10 msc加速退化小鬼mRNA(图13 (g))。

3.4。NAT10抑制小鬼1的表达调节Smad1/5/9信号通路的激活和msc的成骨的能力

我们进一步构建慢病毒表达的shRNA小鬼1 (Sh-Gremlin 1)击倒。世行的结果表明,治疗Sh-Gremlin 1结合Sh-NAT10恢复的激活水平的价格相比Smad1/5/9 Sh-NAT10 msc(图4(一))。因此,ARS染色的结果和高山化验和骨生成标记的mRNA水平表明,治疗1 Sh-Gremlin结合Sh-NAT10获救msc的成骨的能力比Sh-NAT10 msc(图4 (b)和4 (c))。因此,我们得出结论,NAT10监管Smad1/5/9信号通路的激活调节小鬼1的表达。

4所示。讨论

msc,也称为多能基质细胞,骨形成和发展作出巨大贡献11]。成骨细胞的前体,msc进行成骨分化在特定的微环境和调节骨代谢的体内平衡在活的有机体内(12]。此外,由于其较低的免疫原性和比其他干细胞成骨的能力更强,msc作为种子细胞在组织工程和再生医学应用中,例如骨缺损修复(13,14]。此外,先前的研究已经表明,msc的成骨分化能力下降导致骨质疏松症和低骨量在其他类型的疾病15- - - - - -17]。因此,照明MSC成骨分化的详细机制不仅可以促进的综合临床使用MSC还促进调查骨疾病的发病机理。

RNA的修改,包括N⁶-methyladenosine N¹-methyladenosine 5-methylcytosine修改,监管机制是一个重要的蛋白表达和细胞功能18]。具体来说,N⁶-methyladenosine调停msc的功能中起着重要的作用,包括成骨分化(19]。最近,交流⁴C是被证明是守恒的,广泛分布在mrna,导致他们的转录和翻译7]。这一修改最终会影响各细胞的各种功能。NAT10 RNA乙酰转移酶,负责交流⁴C改性的RNA (20.]。然而,是否NAT10-mediated ac⁴C改性的RNA影响msc的成骨分化尚不清楚。深入研究这一问题,我们评估NAT10表达式在MSC的成骨分化,发现NAT10表达谱呈正相关,ARS染色和高山的水平,暗示NAT10在MSC骨生成的功能作用。此外,抑制NAT10表达抑制msc的成骨分化能力,和本构超表达NAT10 msc显著促进成骨分化能力。据我们所知,这些结果是第一个证明NAT10积极调节骨生成的msc。

第二个我们的研究的焦点是NAT10 MSC成骨分化影响的机理。先前的研究已经证明,MSC成骨分化是由各种各样的信号通路,比如WNT /β连环蛋白、BMP / Smad和Akt通路(21]。因此,我们首先确定哪些信号通路被NAT10调制。免疫印迹分析表明,只有BMP / Smad信号通路被NAT10积极调制msc在成骨分化。相比之下,WNT /的活动水平β连环蛋白和一种蛋白激酶信号通路保持不变,表明NAT10调控msc的成骨分化主要通过BMP / Smad信号通路。最佳管理,包括BMP2 BMP4, BMP7 BMP9,绑定到BMPR1或BMPR2然后使磷酸化激活Smad1/5/9下游,进而促进MSC骨(22]。BMP拮抗剂,包括‘诺金’和小鬼1,抑制每个位置的函数,然后压制MSC骨(23]。在我们的研究中,我们发现BMP2的表达水平,BMP4, BMP7, BMP9,大脑没有受到NAT10, Gremlin 1 mRNA和蛋白表达被NAT10负调控。小鬼,胱氨酸结总科的一员,是我国的天然拮抗剂(24]。最近的一项研究表明,抑制小鬼1表达促进成骨分化的msc (25]。此外,我们发现的奖励的效果NAT10 Sh-Gremlin 1 MSC骨被废除。因此,我们得出结论,Gremlin 1 NAT10的下游目标,NAT10提升MSC骨通过抑制小鬼1的表达。

进一步的问题是是否通过ac NAT10调节小鬼1的表达⁴C修改。一项研究表明,交流⁴C RNA修改影响的稳定目标mRNA (8]。在此,我们发现交流⁴C修改麻烦1 mRNA逐渐从第0天增加到第14天的成骨分化,交流⁴C水平呈正相关,NAT10表达式和MSC骨生成。此外,交流⁴C在小鬼1 mRNA水平下降后抑制NAT10表达式在msc和增加感染Over-NAT10慢病毒。这些结果表明,NAT10介导ac⁴C修改麻烦1 mRNA。此外,Gremlin 1信使rna的降解是慢Sh-NAT10组但快Over-NAT10组比对照组。因此,这些结果表明,NAT10促进了交流⁴C修改麻烦1信使rna,然后加速小鬼1信使rna降解,最终抑制其表达。然而,与我们的研究结果相反,293年的一项研究表明t细胞NAT10介导ac⁴C艾滋病毒修改成绩单通过增加mRNA稳定(26]。因此,我们建议NAT10-mediated ac⁴C修改可能施加不同的影响在不同的细胞或不同的基因在同一单元格中,可能需要进一步的研究。先前的研究已经表明,RNA修改可以促进信使RNA降解。例如,米⁶MYB修改,MYC mRNA 3UTR可能加速退化,促进白血病生成发展27]。然而,如何交流⁴C修改调节信使rna降解仍然是未知的。我们建议交流⁴C修改由NAT10也可能影响小鬼1信使rna降解通过目标3UTR网站,需要今后进一步研究。

5。结论

在这项研究中,我们表明,NAT10促进了msc的成骨分化。这种效果是由增加交流⁴C改性在小鬼1 mRNA水平,加速其降解,从而减少小鬼1在成骨分化的水平。这些结果可能会提供新的见解的MSC骨生成机制可能导致骨骨质疏松症等疾病的诊断和治疗。

数据可用性

数据支持这个手稿的发现可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者没有潜在的利益冲突声明。

作者的贡献

Zhenbiao朱镕基做实验和写了初稿的手稿。小薇兴,Shisi黄,圆圆你导致了概念性的想法,该研究的实验设计和编辑的手稿。

确认

本研究在经济上支持海南省卫生部门(ID号20 a200519)。

补充材料

补充图1:原始地带世行的手稿。(补充材料)

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