蝾螈尾部组织细胞组蛋白H3修饰的免疫组化分析

抽象的

背景。蝾螈具有令人印象深刻的再生能力，但仍然尚不清楚表观遗传调控在再生过程中的作用。在截肢后，我们在本文中研究了Newt尾部组织细胞中的组蛋白修饰。方法和结果。IBERIAN RIBBED MEODEWTS（6-8个月大）遭遇约1.5厘米的尾部截肢，用于启动再生过程，3天后收集尾部组织的残留树桩。与完整尾部的组织细胞相比，C-kit阳性干细胞和PCNA阳性增殖细胞的尾巴遭受截肢（ )．截肢还显着地诱导了截肢细胞中H3K9，H3K14和H3K27的乙酰化（ ），但没有显着改变H3K27的甲基化（ )．结论。这些结果表明，在截肢后，表观遗传调节可能涉及纽特尾再生。

1.介绍

组织再生能力在许多生物中具有重要意义;然而，不同的生物具有不同的组织再生能力[1］.与哺乳动物不同，两栖动物仍然是显着的再生能力[2］.例如，纽特斯可以在截肢后完全重新生成尾部和肢体。

再生是一种非常复杂的方法，包括组织细胞的增殖，迁移，去生和转化细胞，以及驻留组织茎/祖细胞的增殖，分化和成熟。尚未理解蝾螈中的再生过程的分子机制仍然很差[3.那4.]但尤其是组蛋白和染色质的表观遗传修饰的作用。

表观遗传修饰包括乙酰化，甲基化，磷酸化，泛醌和平等。组蛋白乙酰化是最受欢迎的表观遗传事件之一，已被证明涉及不同的生物过程，包括受伤组织的再生[5.］.组蛋白H3是五个主要组蛋白中最广泛修饰的组蛋白之一。在大多数物种中，组蛋白H3主要在赖氨酸9（H3K9），14（H3K14）和27（H3K27）时乙酰化。据报道，乙酰化H3K9，H3K14和H3K27在转录开始点附近富集[6.］.在主动转录的启动子中观察到乙酰化H3K9，其与活性转录相关[7.］.乙酰化H3K27也被定义为核重新编程期间活性增强剂[8.］.然而，据报道，镜片再生期间乙酰化H3K9在蝾螈中的表达减少[4.］.因此，组蛋白修饰在蝾螈再生过程中的实际作用和潜在作用尚不清楚。

使用尾部截肢模型用于启动再生过程，在此研究了成人蝾螈组织细胞中的组蛋白修饰。在截肢后3天，我们在尾部组织细胞中确认了乙酰化H3K9，H3K14和H3K27的显着增加。

2。材料和方法

2.1。蝾螈，尾巴截肢和组织制剂

Iberian Ribbed Newts是从鸟取大学获得的[9.］.九个男性成人蝾螈（6-8个月， ）被用于这个实验。这项研究得到了长崎大学原子弹疾病研究所动物保护和使用委员会的批准(#2017-1)。所有动物手术均按照机构和国家指南进行。

纽特斯在0.2％MS-222（东京化学工业，日本）浸泡15分钟，随后截然约1.5厘米的尾部（补充图1)．所有雄性蝾螈均在一个带有服务温度控制的房间里出血（25±1.5°C）。截肢后不久，我们将这些蝾螈退回到日常生活水浴上。

在截肢后3天从尾部的远端部分的残留树桩中收获再生组织（截肢组， )．作为完整的控制，我们还收集了近端部分的切除尾部组织（完整组， )．将组织立即固定在4％多聚甲醛中24小时并嵌入石蜡中（补充图1)．5个部分 μM厚用于免疫组化分析。

2.2。免疫组织化学分析

将石蜡切片化成羟烷化，然后在室温下与封闭溶液（PBS中1％BSA）温育30分钟。封闭后，将这些部分与兔抗组蛋白H3（乙酰K9）单克隆抗体（Abcam; 1：1000稀释）一起温育，兔抗组蛋白H3（乙酰K14）单克隆抗体（Abcam; 1：500稀释），兔抗- 静止的H3（乙酰K27）单克隆抗体（Abcam; 1：1000稀释），小鼠抗组蛋白H3（二甲基K27，三甲基K27）单克隆抗体（Abcam; 1：500稀释），大鼠抗小鼠PCNA单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology; 1：100稀释），以及大鼠抗小鼠CD117 / c-kit单克隆抗体（R＆D Systems; 1：100稀释），在4℃下过夜。将该部分用PBS洗涤三次，然后用与AlexaFluor®488，AlexaFluor®546，AlexaFluor®594缀合的适当的二抗，在室温下孵育60分钟。通过阳性对照（小鼠骨髓和肝脏组织）或阴性对照（单独使用第二抗体）来确认所有原发性抗体的特异性。用PBS洗涤三次后，用DAPI（Invitrogen）标记细胞核。

在共聚焦激光扫描显微镜（FV10i-LIV，奥林巴斯）下检测阳性染色的细胞，并且使用具有60倍放大镜的FV10-ASW软件（OLYMPU）来获取数字图像。每个组织样品的两个部分染色每个初级抗体。从每个组织样品的两个染色的载玻片中随机获取十个图像，用于定量分析。通过相同的阈值（最大255，min.106）计算PCNA和C-kit阳性细胞。然而，通过测量免疫抑制的信号强度并通过DAPI使用图像J（Ver1.8.0，NIH）来评估组蛋白修饰。为了减少技术变异，我们尽力标准化每个实验步骤。

２.３.统计分析

所有的结果都以 。未配对的双尾 -测试用于统计分析。所有分析均采用SPSS19.0统计软件（IBM SPSS Co.，USA）进行。 被认为是统计学意义的。

结果

3.1。在截肢后尾部残留树桩周围的PCNA阳性增殖细胞和C-kit阳性干细胞的数量增加

为了确认再生的开始，我们在免疫组织化学染色截肢后3天围绕尾部组织的残留树桩周围的PCNA阳性增殖细胞和C-kit阳性干细胞（补充图1)．截肢后3天在尾部组织中的大多数（高达70％）细胞被PCNA呈正染色（图1)．与完整尾组织相比，断肢后第3天残端周围pcna阳性细胞百分比显著增加( vs. 那 那数字1)．此外，在完整的尾部组织中很少检测到C- kit阳性干细胞，但在截肢后3天在尾部组织的残留树桩周围更频繁地检测到（图2)．定量数据显示，截肢组中的C-kit阳性干细胞的百分比显着高于完整组（ vs. 那 那数字2)．与表皮中PCNA阳性细胞的广泛分布相反，这些C-kit阳性细胞几乎发现在Stratum Basale表皮中。

３．２．截肢显著诱导H3K9、H3K14和H3K27的乙酰化，但不显著改变H3K27的甲基化

通过免疫组织化学染色也评估尾部组织细胞中的组蛋白修饰。乙酰化的H3K9，H3K14和H3K27可以在细胞的核中以完整的尾部或截肢尾巴检测（图3.-5.,补充图2-4)．与完整组相比，在截肢组中检测到广泛的阳性染色。定量数据表明，乙酰化H3K9上的染色信号强度（ vs. 那 ），H3K14 ( vs. 那 ），和h3k27（ vs. 那 ）截肢组明显高于完整组(图3.-5.;补充图2-4)．

与截肢后3天在尾部组织的残留树桩周围的乙酰化H3K27周围的增强表达相反，H3K27的甲基化表明完整组和截肢组之间的组织细胞没有显着差异（ vs. 那 那数字6.;补充图5.)．

4.讨论

与脊椎动物的有限的再生效力不同，两栖动物，尤其是蝾螈，展示更显着的再生效力。然而，尚未完全理解蝾螈中受伤组织/器官显着再生的潜在机制。由于已知表观遗传修饰来调节组织细胞的增殖和去分化，我们推测的是，组蛋白修饰也可能涉及蝾螈中的再生过程。使用尾部截肢模型，我们观察到截肢后3天尾尾的残留树桩周围的PCNA阳性增殖细胞显着增加，确认了截肢尾巴的鲁棒再生。在截肢尾巴的残留树桩周围也显着增加了C-kit阳性干细胞，这表明消化不良事件发生了可能。正如预期的那样，免疫组织化学分析表明，截肢诱导H3K9，H3K14和H3K27的乙酰化，但没有显着改变H3K27的甲基化。

受伤组织/器官的再生是复杂的过程[10.那11.]，包括剩余组织细胞的增殖和去分化和驻留茎/祖细胞的分化和成熟。PCNA阳性细胞的显着增加表明增殖活性可能主要导致蝾螈中截肢的再生。尚已知将分化/良性细胞的生物转化为未分化/未饱和细胞的生物转化，用于有助于各种动物中受伤组织/器官的再生[12.那13.］.虽然哺乳动物细胞也具有去除了适当的触发器的能力[14.，脱分化现象在两栖动物中非常普遍。因此，成熟组织细胞可能被诱导去分化，主要促进断尾的再生。

以前的研究报道了在蝾螈中再生过程中的多能因素的诱导[15.]但它仍然对蝾螈中干细胞的数量，起源和潜在作用保持争议[16.］.使用C-kit的常见干细胞标记物，我们可以在完整的尾肤皮肤组织的层状基础表皮周围找到一些C-kit阳性细胞，表明蝾螈中有驻留干细胞。然而，围绕与完整的尾部组织相比，围绕截肢尾部的残留树桩检测到一倍的C-kit阳性干细胞，并且这些C-kit阳性干细胞在地层基础表皮中大部分地检测到。因此，我们认为可以从驻留干细胞的增殖产生增加的C-套件阳性干细胞数量。虽然干细胞数量增加，但是在本研究中的截肢尾部未观察到常规组织细胞的广泛消化。

表观遗传性状是由染色体的变化导致的稳定遗传表型，而不在DNA序列中改变[17.］.众所周知，组蛋白乙酰化，一种最佳表征的表观遗传修饰之一是通过转录激活增加基因的表达[18.］.已知组蛋白H3的表观遗传修饰来调节细胞去分化和个体发展[4.]，乙酰化是一个很好的候选标记，以区分活性和预期的增强剂状态[8.］.通常已知组蛋白乙酰化用于激活基因的转录，并先前已经证明H3K9和H3K27的乙酰化与染色质的转录活化相关[19.那20.］.在本研究中，我们还发现乙酰化的H3K9、H3K14和H3K27在断尾残肢周围有更广泛的表达，表明表观遗传修饰在调控再生过程中的潜在作用。

组蛋白甲基化是通过添加一种，两个或三个甲基在组蛋白中的某些氨基酸的修饰。H3K27的甲基化通常与转录抑制有关[21.那22.］.据报道，完整的斑马鱼沉默的发育调节基因，但通过在翅片时失去MEH3K27改性，将沉默的基因转化为活性状态[4.］.与乙酰化H3K27的增强表达相比，我们的数据显示H3K27的甲基化未在3天内围绕截肢尾部的残留树桩显着诱导。因此，我们推测H3K27的甲基化不太可能发挥关键作用在造成后不久的蝾螈中的再生过程。

先前的研究报告了我们的数据，报道了甲基化H3K27的表达增加以及乙酰化H3K9的表达降低，用于在蝾螈中引发甜切除术后的虹膜细胞的转化细胞的转化[23.］.还报道了DNA甲基化确保了在视网膜再生期间控制麦芽胶细胞的基因表达程序，以控制斑马鱼中的神经元的神经元[24.］.由于根据全身和局部条件，研究中，研究中这些不同发现的原因不明确，因此表观遗传调节的灵活性。实际上，据报道了乙酰化H3K9在干细胞分化中的双重作用[25.］.

这项研究有几个局限性。首先，由于本研究被设计用于概念验证，我们只在截肢后3天执行所有调查。虽然在动物种类中大大变化，但是可以快速诱导常驻细胞的组蛋白乙酰化以在损伤后开始再生过程。因此，在截肢后，可以很快在蝾螈尾部组织细胞中诱导组蛋白乙酰化。实际上，先前已经据报道，在截肢后24小时内举报了组蛋白乙酰化在Xenopus Tadpole尾部的24小时内增加[26.］.当我们在截肢后仅3天内分析组蛋白乙酰化时，在未来截肢后，非常需要进一步的研究来揭示尾部组织细胞中组织乙酰化的动态变化。第二，我们在本研究中使用免疫组织化学分析。这是因为我们想知道在截肢后是否围绕边缘地区围绕边缘地区观察的组蛋白修改。然而，其他方法，例如Western印迹将更好地定量组蛋白修饰。否则，我们很难完全定义尾部组织中的特殊细胞类型以进行分析。虽然在皮肤组织的表皮上均匀地检测到用PCNA，ACH3K9，ACH3K14和ACH3K27呈阳性染色的大多数细胞，但我们未能通过双染色确认增殖细胞和组蛋白乙酰化之间的关系。

总之，来自我们的初步数据体内实验表明乙酰化H3K9，H3K14和H3K27的增强表达在截肢尾巴的残留树桩周围的组织细胞中。虽然在没有直接证据的情况下，表观遗传修饰可能涉及再生截肢的蝾螈尾巴。

数据可用性

支持本研究结果的所有数据都在纸上提供，并且在合理的请求时也可从相应的作者获得。

披露

资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或编写手稿。

的利益冲突

作者声明没有竞争的财务利益。

作者的贡献

J.W.和T. L.，构思和设计了实验。J.W.，X.Z.，S.R.和T.L.，执行了实验。J.W.，K.A.和T.L.分析了数据。J.W和T.L.，写了主要的稿件文本。

致谢

作者希望感谢Nagasaki大学组织学和细胞生物学系的Takehiko Koji和其他员工的教授，以便于支持这项研究。这项工作主要由教育部，科学，体育，文化和技术部的授予资助，并由广岛辐射灾害医学科学的网络型联合使用/研究中心部分得到了部分支持大学，长崎大学，福岛医科大学。

补充材料

补充图1-5。（补充材料）

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