在许多生物体组织再生能力是非常重要的;然而,不同的生物有不同的组织再生能力 再生是一个非常复杂的过程,包括增殖、迁移、去分化,组织细胞分化转移,以及增殖,分化,成熟的居民组织干细胞/祖细胞。它仍然知之甚少蝾螈的再生过程的分子机制( 表观遗传修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化ubiquitylation, sumoylation。组蛋白乙酰化作用,其中最流行的表观遗传事件,已被证实能参与多样的生物过程,包括受伤组织的再生( 使用截尾模型对初始的再生过程,本文调查了组织细胞的组蛋白修饰的成年蝾螈。我们证实乙酰化H3K9的显著增加,H3K14, H3K27尾巴组织细胞在截肢后3天。
伊比利亚肋蝾螈得到各级大学( 蝾螈被浸泡在0.2% - 222女士麻醉(化工、日本东京)15分钟,其次是切断长度约1.5厘米的反面(补充图 再生组织从残树桩收获的远端部分尾巴截肢后3天(切除组,
石蜡切片与阻塞deparaffinized然后孵化解决方案(1% BSA在PBS)在室温下30分钟。阻塞后,部分与兔子孵化anti-Histone H3(乙酰K9)单克隆抗体(Abcam;1:1000稀释),兔子anti-Histone H3(乙酰K14)单克隆抗体(Abcam;1:500稀释),兔子anti-Histone H3(乙酰K27)单克隆抗体(Abcam;1:1000稀释),鼠标anti-Histone H3 (di甲基K27,三甲基K27)单克隆抗体(Abcam;1:500稀释),鼠anti-mouse PCNA单克隆抗体(圣克鲁斯生物技术;1:100稀释),鼠anti-mouse CD117 / c - kit单克隆抗体(研发系统;1:100稀释),分别在4°C的过夜。PBS的部分被洗了三次,然后孵化与适当的二次抗体共轭Alexa萤石®488,Alexa萤石®546,或Alexa萤石在室温下®594 60分钟。所有主要的特异性抗体也证实了积极的控制(小鼠骨髓和肝脏组织)或负控制(单独使用第二抗体)。 After washing three times with PBS, the nuclei were labelled with DAPI (Invitrogen).
积极染色细胞被发现在共焦激光扫描显微镜(FV10i-LIV,奥林巴斯)和数字图像获得使用FV10-ASW软件(奥林巴斯)60倍放大镜头。两个部分从每个组织样本染色为每个主要抗体。十图像被随机获得两个彩色幻灯片的每个组织样本进行定量分析。PCNA和c-kit-positive细胞数相同的阈值(Max。255年,Min.106)。然而,组蛋白修饰被测量信号强度评估免疫染色和规范化的DAPI使用图像J (ver1.8.0, NIH)。减少技术变化,我们尝试努力规范每个实验步骤。
所有的结果了
确认开始再生,我们调查了PCNA-positive增殖细胞和c-kit-positive干细胞残树桩的尾巴组织3天截肢后免疫组织化学染色(补充图 免疫组织化学分析c-kit-positive干细胞尾巴截肢后3天。代表图像(a) (b)和定量数据显示c-kit-positive干细胞在完整的尾巴和截肢的尾巴。酒吧规模:20
组蛋白修饰在尾部组织细胞同时进行免疫组织化学染色。的乙酰化H3K9、H3K14 H3K27可以检测到细胞的核完整的尾巴或切除尾(数字 免疫组织化学分析H3K9的乙酰化组织细胞截肢后3天。代表图像(a)和(b)定量数据显示乙酰化的表达H3K9 (AcH3K9)完整的反面和截肢反面。定量数据被DAPI规范化。酒吧规模:20 免疫组织化学分析H3K14乙酰化作用的组织细胞截肢后3天。代表图像(a)和(b)定量数据显示乙酰化的表达H3K14 (AcH3K14)完整的反面和截肢反面。定量数据被DAPI规范化。酒吧规模:20 免疫组织化学分析H3K27乙酰化作用的组织细胞截肢后3天。代表图像(a)和(b)定量数据显示乙酰化的表达H3K27 (AcH3K27)完整的反面和截肢反面。定量数据被DAPI规范化。酒吧规模:20 与乙酰化的增强表现H3K27残树桩的尾巴组织截肢后3天,H3K27表示没有显著差异的甲基化之间的组织细胞完整组和切除组( 免疫组织化学分析H3K27在组织细胞的甲基化截肢后3天。代表图像(a) (b)的数据显示和定量表达与甲基化H3K27 (MeH3K27)完整的反面和截肢反面。定量数据被DAPI规范化。酒吧规模:20
不同于有限的再生力量在脊椎动物,两栖动物,尤其是纽特,显示一个更惊人的再生能力。然而,它还没有完全理解底层机制受伤非凡的再生组织/器官在纽特。如众所周知的表观遗传修饰来调节组织细胞的扩散和去分化,我们推测,组蛋白修饰在蝾螈再生过程中还可能涉及到。使用截尾模型,我们观察到显著增加PCNA-positive增殖细胞残树桩的尾巴截肢后3天,确认截肢的健壮的再生尾巴。c-kit-positive干细胞也显著增加截肢残树桩的反面,暗示可能发生去分化。正如所料,免疫组织化学分析表明,截肢诱导H3K9的乙酰化作用,H3K14, H3K27,但并没有显著改变H3K27的甲基化。 受伤的组织/器官再生是复杂的过程 先前的研究已经报道了诱导多能性因素在蝾螈的再生( 表观遗传性状是稳定遗传的表型变化所产生的一个染色体DNA序列没有改变的( 组蛋白甲基化是某些氨基酸的修饰组蛋白蛋白质通过添加一个,两个,三个甲基。的甲基化H3K27通常是与转录镇压[ 不同意我们的数据,一项研究报告了甲基化H3K27表达的增加和减少乙酰化H3K9的表情开始后虹膜细胞的分化转移lentectomy纽特( 本研究也有一些局限性。第一,本研究为概念设计的,我们只执行所有调查截肢后3天。尽管它将在很大程度上不同动物的物种中,组蛋白乙酰化作用的居民可以快速诱导细胞损伤后的再生过程。因此,组蛋白乙酰化作用可能在纽特尾组织细胞诱导截肢后很快。的确,组蛋白乙酰化作用之前已经报道过了24小时内增加在非洲爪蟾蜍蝌蚪的尾巴截肢( 总之,从我们的初步数据
所有数据支持本研究的发现可以在纸上,也可以从相应的作者在合理的请求。
投资者没有参与研究设计、数据收集、分析、发布决定,或准备手稿。
作者声明没有竞争的经济利益。
J.W.,and T. L., conceived and designed the experiments. J.W., X.Z., S.R., and T.L., performed the experiments. J.W., K.A., and T.L., analyzed the data. J.W and T.L., wrote the main manuscript text.
作者要感谢Takehiko Koji教授和其他员工的组织学和细胞生物学长崎大学的支持本研究。这项工作主要是由教育部的补助金,科学,体育,文化和技术,日本和部分支持网络类型的程序使用/联合研究中心辐射灾难医学广岛大学的长崎大学、福岛医科大学。
补充图1 - 5。