SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2021/8828931 8828931 研究文章 免疫组织化学分析组蛋白H3修改在纽特尾巴截肢后组织细胞 Ji-Wen 1 2 3 1 漫画家关谷神奇 玲子 1 Aoyagi 3 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7653 - 8873 Tao-Sheng 1 迪亚斯-达-席尔瓦 Valdo穆 1 干细胞生物学 原子弹疾病研究所 长崎大学 长崎852 - 8523 日本 nagasaki-u.ac.jp 2 的人体解剖学 组织学与胚胎学 学校基本的医学科学 福建医科大学 福州350108年 中国 fjmu.edu.cn 3 公共卫生部门 长崎大学生物医学科学研究生院 长崎852 - 8523 日本 nagasaki-u.ac.jp 2021年 6 1 2021年 2021年 14 7 2020年 6 12 2020年 15 12 2020年 6 1 2021年 2021年 版权©2021吴Ji-Wen et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。蝾螈再生能力令人印象深刻,但目前尚不清楚在再生过程中表观遗传调控的作用。我们在此研究了组蛋白修饰在纽特尾巴截肢后组织细胞。 方法和结果。伊比利亚肋男性蝾螈(6 - 8个月大)遭受了约1.5厘米长度的截肢的尾巴开始再生过程,和剩余的尾组织收集免疫组织化学分析3天后。组织细胞相比完整的反面,c-kit-positive干细胞和PCNA-positive增殖细胞明显高于在反面遭遇截肢( P < 0.001 )。截肢也显著诱导H3K9的乙酰化作用,H3K14, H3K27反面截肢(细胞 P < 0.001 ),但并没有显著改变H3K27的甲基化( P = 0.063 )。 结论。这些结果表明,表观遗传调控可能涉及到纽特尾巴截肢后再生。 程序网络类型的联合使用/辐射灾难广岛大学的医学研究中心,长崎大学、福岛医科大学 补助金从教育部、科学、体育、文化和技术,日本 1。介绍<gydF4y2Ba/title> <p>在许多生物体组织再生能力是非常重要的;然而,不同的生物有不同的组织再生能力<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B1"> 1<gydF4y2Ba/xref>]。不同于哺乳动物、两栖动物保持重要的再生能力(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B2"> 2<gydF4y2Ba/xref>]。例如,蝾螈可以完全截肢后再生尾巴和四肢。<gydF4y2Ba/p> <p>再生是一个非常复杂的过程,包括增殖、迁移、去分化,组织细胞分化转移,以及增殖,分化,成熟的居民组织干细胞/祖细胞。它仍然知之甚少蝾螈的再生过程的分子机制(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B3"> 3<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B4"> 4<gydF4y2Ba/xref>),特别是组蛋白和染色质的表观遗传修饰的作用。<gydF4y2Ba/p> <p>表观遗传修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化ubiquitylation, sumoylation。组蛋白乙酰化作用,其中最流行的表观遗传事件,已被证实能参与多样的生物过程,包括受伤组织的再生(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B5"> 5<gydF4y2Ba/xref>]。组蛋白H3是一种最广泛的修改组蛋白的五个主要的组蛋白蛋白质。在大多数物种中,组蛋白H3主要是在赖氨酸乙酰化9 (H3K9)、14 (H3K14), 27 (H3K27)。据报道,乙酰化H3K9 H3K14, H3K27丰富转录起始点的附近(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B6"> 6<gydF4y2Ba/xref>]。乙酰化H3K9一直在积极转录启动子,观察与活跃转录(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B7"> 7<gydF4y2Ba/xref>]。乙酰化H3K27也被定义为一个活跃的增强剂在核重编程(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B8"> 8<gydF4y2Ba/xref>]。然而,据报道乙酰化H3K9的下降表现在纽特镜头再生(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B4"> 4<gydF4y2Ba/xref>]。因此,它一直不清楚现实和潜在作用的组蛋白修饰在蝾螈再生过程。<gydF4y2Ba/p> <p>使用截尾模型对初始的再生过程,本文调查了组织细胞的组蛋白修饰的成年蝾螈。我们证实乙酰化H3K9的显著增加,H3K14, H3K27尾巴组织细胞在截肢后3天。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2"> <title>2。材料和方法<gydF4y2Ba/title> <sec id="sec2.1"> <title>2.1。蝾螈、截尾和组织准备<gydF4y2Ba/title> <p>伊比利亚肋蝾螈得到各级大学(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B9"> 9<gydF4y2Ba/xref>]。九个男性成年蝾螈(6 - 8个月大的时候,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M4"> <mml:mn> 28.4<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 1.7<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mtext> </mml:mtext> <mml:mtext> g<gydF4y2Ba/mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>)被用于实验。本研究机构批准的动物保健和使用委员会原子弹疾病研究所,长崎大学(# 2017 - 1)。所有动物程序依法进行机构和国家的指导方针。<gydF4y2Ba/p> <p>蝾螈被浸泡在0.2% - 222女士麻醉(化工、日本东京)15分钟,其次是切断长度约1.5厘米的反面(补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1<gydF4y2Ba/xref>)。所有男性蝾螈流血与服务在一个房间里温度控制(25±1.5°C)。截肢后不久,我们返回这些蝾螈回到日常生活水浴。<gydF4y2Ba/p> <p>再生组织从残树桩收获的远端部分尾巴截肢后3天(切除组,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M5"> <mml:mi> n<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> =<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 9<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)。作为一个完整的控制,我们也收集了近端部分的切除尾组织(完整的集团,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M6"> <mml:mi> n<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> =<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 9<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)。组织立即固定在4%多聚甲醛24 h和嵌入在石蜡(补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1<gydF4y2Ba/xref>)。部分5<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>米厚的被用于免疫组织化学分析。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>2.2。免疫组织化学分析<gydF4y2Ba/title> <p>石蜡切片与阻塞deparaffinized然后孵化解决方案(1% BSA在PBS)在室温下30分钟。阻塞后,部分与兔子孵化anti-Histone H3(乙酰K9)单克隆抗体(Abcam;1:1000稀释),兔子anti-Histone H3(乙酰K14)单克隆抗体(Abcam;1:500稀释),兔子anti-Histone H3(乙酰K27)单克隆抗体(Abcam;1:1000稀释),鼠标anti-Histone H3 (di甲基K27,三甲基K27)单克隆抗体(Abcam;1:500稀释),鼠anti-mouse PCNA单克隆抗体(圣克鲁斯生物技术;1:100稀释),鼠anti-mouse CD117 / c - kit单克隆抗体(研发系统;1:100稀释),分别在4°C的过夜。PBS的部分被洗了三次,然后孵化与适当的二次抗体共轭Alexa萤石®488,Alexa萤石®546,或Alexa萤石在室温下®594 60分钟。所有主要的特异性抗体也证实了积极的控制(小鼠骨髓和肝脏组织)或负控制(单独使用第二抗体)。 After washing three times with PBS, the nuclei were labelled with DAPI (Invitrogen).</p> <p>积极染色细胞被发现在共焦激光扫描显微镜(FV10i-LIV,奥林巴斯)和数字图像获得使用FV10-ASW软件(奥林巴斯)60倍放大镜头。两个部分从每个组织样本染色为每个主要抗体。十图像被随机获得两个彩色幻灯片的每个组织样本进行定量分析。PCNA和c-kit-positive细胞数相同的阈值(Max。255年,Min.106)。然而,组蛋白修饰被测量信号强度评估免疫染色和规范化的DAPI使用图像J (ver1.8.0, NIH)。减少技术变化,我们尝试努力规范每个实验步骤。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>2.3。统计分析<gydF4y2Ba/title> <p>所有的结果了<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M7"> <mml:mtext> 的意思是<gydF4y2Ba/mml:mtext> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mtext> SD<gydF4y2Ba/mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>。未配对的双尾<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M8"> <mml:mi> t<gydF4y2Ba/mml:mi> </mml:math> </inline-formula>以及用于统计分析。所有与SPSS19.0进行分析统计软件(美国IBM SPSS有限公司)。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M9"> <mml:mi> P<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.05<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>被认为是具有统计学意义。<gydF4y2Ba/p> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>3所示。结果<gydF4y2Ba/title> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。PCNA-Positive和c-Kit-Positive干细胞增殖细胞数量的增加在截肢后剩余的尾巴<gydF4y2Ba/title> <p>确认开始再生,我们调查了PCNA-positive增殖细胞和c-kit-positive干细胞残树桩的尾巴组织3天截肢后免疫组织化学染色(补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 1<gydF4y2Ba/xref>)。绝大多数(70%)尾积极组织被染色的细胞PCNA在截肢后3天(图<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1<gydF4y2Ba/xref>)。与完整的尾巴组织相比,PCNA-positive细胞的百分比显著增加的剩余残尾组织截肢后3天(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M10"> <mml:mn> 5.63<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 5.40<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>vs。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M11"> <mml:mn> 76.80<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 18.79<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M12"> <mml:mi> P<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.001<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,图<gydF4y2Baxref rid="fig1" ref-type="fig"> 1<gydF4y2Ba/xref>)。此外,c-kit-positive干细胞很少是在完整的尾巴组织发现,但是更频繁地发现残树桩的尾巴组织截肢(图3天后<gydF4y2Baxref rid="fig2" ref-type="fig"> 2<gydF4y2Ba/xref>)。定量数据显示c-kit-positive干细胞的比例明显高于截肢组比完整组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M13"> <mml:mn> 5.57<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 4.97<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>vs。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M14"> <mml:mn> 14.87<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 13.81<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M15"> <mml:mi> P<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.001<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,图<gydF4y2Baxref rid="fig2" ref-type="fig"> 2<gydF4y2Ba/xref>)。相比之下PCNA-positive表皮细胞的广泛分布,这些c-kit-positive几乎在表皮基底层细胞。<gydF4y2Ba/p> <fig-group id="fig1"> <label>图1<gydF4y2Ba/label> <p>免疫组织化学分析PCNA-positive增殖细胞尾巴截肢后3天。代表图像(a) (b)和定量数据显示PCNA-positive细胞完整的反面和截肢反面。酒吧规模:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>m。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig1a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.001a"></graphic> </fig> <fig id="fig1b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.001b"></graphic> </fig> </fig-group> <fig-group id="fig2"> <label>图2<gydF4y2Ba/label> <p>免疫组织化学分析c-kit-positive干细胞尾巴截肢后3天。代表图像(a) (b)和定量数据显示c-kit-positive干细胞在完整的尾巴和截肢的尾巴。酒吧规模:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>m。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig2a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.002a"></graphic> </fig> <fig id="fig2b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.002b"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。截肢显著诱导H3K9的乙酰化作用,H3K14, H3K27,但并没有显著改变H3K27的甲基化<gydF4y2Ba/title> <p>组蛋白修饰在尾部组织细胞同时进行免疫组织化学染色。的乙酰化H3K9、H3K14 H3K27可以检测到细胞的核完整的尾巴或切除尾(数字<gydF4y2Baxref rid="fig3" ref-type="fig"> 3<gydF4y2Ba/xref>- - - - - -<gydF4y2Baxref rid="fig5" ref-type="fig"> 5<gydF4y2Ba/xref>,补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 2 - 4<gydF4y2Ba/xref>)。与完整的组相比,广泛切除组的阳性染色检测。定量数据显示,染色的乙酰化H3K9的信号强度(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M16"> <mml:mn> 41.00<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 18.59<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>vs。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M17"> <mml:mn> 91.40<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 7.60<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M18"> <mml:mi> P<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.001<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>),H3K14 (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M19"> <mml:mn> 44.97<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 12.77<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>vs。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M20"> <mml:mn> 70.67<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 24.70<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M21"> <mml:mi> P<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.001<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>)和H3K27 (<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M22"> <mml:mn> 54.87<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 15.11<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>vs。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M23"> <mml:mn> 73.70<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 25.37<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M24"> <mml:mi> P<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> <<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.001<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>切除组)显著高于完整组(数字<gydF4y2Baxref rid="fig3" ref-type="fig"> 3<gydF4y2Ba/xref>- - - - - -<gydF4y2Baxref rid="fig5" ref-type="fig"> 5<gydF4y2Ba/xref>;补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 2 - 4<gydF4y2Ba/xref>)。<gydF4y2Ba/p> <fig-group id="fig3"> <label>图3<gydF4y2Ba/label> <p>免疫组织化学分析H3K9的乙酰化组织细胞截肢后3天。代表图像(a)和(b)定量数据显示乙酰化的表达H3K9 (AcH3K9)完整的反面和截肢反面。定量数据被DAPI规范化。酒吧规模:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>m。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig3a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.003a"></graphic> </fig> <fig id="fig3b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.003b"></graphic> </fig> </fig-group> <fig-group id="fig4"> <label>图4<gydF4y2Ba/label> <p>免疫组织化学分析H3K14乙酰化作用的组织细胞截肢后3天。代表图像(a)和(b)定量数据显示乙酰化的表达H3K14 (AcH3K14)完整的反面和截肢反面。定量数据被DAPI规范化。酒吧规模:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>m。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig4a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.004a"></graphic> </fig> <fig id="fig4b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.004b"></graphic> </fig> </fig-group> <fig-group id="fig5"> <label>图5<gydF4y2Ba/label> <p>免疫组织化学分析H3K27乙酰化作用的组织细胞截肢后3天。代表图像(a)和(b)定量数据显示乙酰化的表达H3K27 (AcH3K27)完整的反面和截肢反面。定量数据被DAPI规范化。酒吧规模:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>m。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig5a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.005a"></graphic> </fig> <fig id="fig5b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.005b"></graphic> </fig> </fig-group> <p>与乙酰化的增强表现H3K27残树桩的尾巴组织截肢后3天,H3K27表示没有显著差异的甲基化之间的组织细胞完整组和切除组(<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M25"> <mml:mn> 39.63<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 15.45<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>vs。<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M26"> <mml:mn> 52.40<gydF4y2Ba/mml:mn> <mml:mo> ±<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 26.33<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,<gydF4y2Bainline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M27"> <mml:mi> P<gydF4y2Ba/mml:mi> <mml:mo> =<gydF4y2Ba/mml:mo> <mml:mn> 0.063<gydF4y2Ba/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>,图<gydF4y2Baxref ref-type="fig" rid="fig6"> 6<gydF4y2Ba/xref>;补充图<gydF4y2Baxref ref-type="supplementary-material" rid="supplementary-material-1"> 5<gydF4y2Ba/xref>)。<gydF4y2Ba/p> <fig-group id="fig6"> <label>图6<gydF4y2Ba/label> <p>免疫组织化学分析H3K27在组织细胞的甲基化截肢后3天。代表图像(a) (b)的数据显示和定量表达与甲基化H3K27 (MeH3K27)完整的反面和截肢反面。定量数据被DAPI规范化。酒吧规模:20<gydF4y2Baitalic> μ<gydF4y2Ba/italic>m。<gydF4y2Ba/p> <fig id="fig6a"> <label>(一)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.006a"></graphic> </fig> <fig id="fig6b"> <label>(b)<gydF4y2Ba/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.fig.006b"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4所示。讨论<gydF4y2Ba/title> <p>不同于有限的再生力量在脊椎动物,两栖动物,尤其是纽特,显示一个更惊人的再生能力。然而,它还没有完全理解底层机制受伤非凡的再生组织/器官在纽特。如众所周知的表观遗传修饰来调节组织细胞的扩散和去分化,我们推测,组蛋白修饰在蝾螈再生过程中还可能涉及到。使用截尾模型,我们观察到显著增加PCNA-positive增殖细胞残树桩的尾巴截肢后3天,确认截肢的健壮的再生尾巴。c-kit-positive干细胞也显著增加截肢残树桩的反面,暗示可能发生去分化。正如所料,免疫组织化学分析表明,截肢诱导H3K9的乙酰化作用,H3K14, H3K27,但并没有显著改变H3K27的甲基化。<gydF4y2Ba/p> <p>受伤的组织/器官再生是复杂的过程<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B10"> 10<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B11"> 11<gydF4y2Ba/xref>),包括扩散和保持组织细胞的去分化和居民干细胞/祖细胞的分化和成熟。表示PCNA-positive细胞增殖活动的大幅增加可能主要贡献截肢反面蝾螈的再生。去分化,分化成熟细胞未分化/生物转换immaturated细胞,也是造成受伤的组织/器官再生的不同种类的动物(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B12"> 12<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B13"> 13<gydF4y2Ba/xref>]。尽管哺乳动物细胞也有能力去分化如果适当的触发(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B14"> 14<gydF4y2Ba/xref>),去分化在两栖动物很常见。因此,成熟组织细胞的去分化可能诱发贡献主要是切除反面的再生。<gydF4y2Ba/p> <p>先前的研究已经报道了诱导多能性因素在蝾螈的再生(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B15"> 15<gydF4y2Ba/xref>),但它仍然是保持争议数量,干细胞的起源和潜在作用蝾螈(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B16"> 16<gydF4y2Ba/xref>]。使用常见的c - kit干细胞标记,我们能找到一些c-kit-positive在表皮基底层细胞的完整的尾部皮肤组织建议居民有干细胞在蝾螈。然而,c-kit-positive干细胞的数量翻了一番发现截肢残树桩的尾巴比较完整的尾部组织,和这些c-kit-positive干细胞也主要是检测表皮基底层。因此,我们认为c-kit-positive干细胞数量的增加可能会导致居民干细胞的增殖。虽然有增加数量的干细胞,广泛的去分化成熟的组织细胞没有切除尾巴在这项研究中观察到。<gydF4y2Ba/p> <p>表观遗传性状是稳定遗传的表型变化所产生的一个染色体DNA序列没有改变的(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B17"> 17<gydF4y2Ba/xref>]。组蛋白乙酰化作用,最好的表观遗传修饰特征,增加表达的基因通过转录激活<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B18"> 18<gydF4y2Ba/xref>]。表观遗传修饰的组蛋白H3已知能够调节细胞去分化和个人发展<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B4"> 4<gydF4y2Ba/xref>),乙酰化是一个很好的候选标记区分积极准备增强器状态(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B8"> 8<gydF4y2Ba/xref>]。组蛋白乙酰化作用通常是激活基因的转录,H3K9的乙酰化和H3K27之前已被证明与染色质的转录激活<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B19"> 19<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.<gydF4y2Ba/xref>]。在这项研究中,我们还发现乙酰化H3K9的更广泛的表达,H3K14,和H3K27截肢残树桩的反面,表明潜在作用的表观遗传修饰在调节再生过程。<gydF4y2Ba/p> <p>组蛋白甲基化是某些氨基酸的修饰组蛋白蛋白质通过添加一个,两个,三个甲基。的甲基化H3K27通常是与转录镇压[<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B21"> 21<gydF4y2Ba/xref>,<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B22"> 22<gydF4y2Ba/xref>]。据报道,完整的斑马鱼沉默发育调控基因,但沉默基因转换为一个活跃的状态,失去MeH3K27修改在鳍的一代(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B4"> 4<gydF4y2Ba/xref>]。与乙酰化H3K27的增强表现相比,我们的数据显示,甲基化H3K27没有明显诱导截肢残树桩的反面3天内。因此,我们推测H3K27可能发挥关键作用的甲基化启动蝾螈的再生过程损伤后不久。<gydF4y2Ba/p> <p>不同意我们的数据,一项研究报告了甲基化H3K27表达的增加和减少乙酰化H3K9的表情开始后虹膜细胞的分化转移lentectomy纽特(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B23"> 23<gydF4y2Ba/xref>]。它还报道称,DNA甲基化确保基因表达程序控制穆勒在斑马鱼视网膜神经胶质细胞重编程为神经元再生(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B24"> 24<gydF4y2Ba/xref>]。这些不同结果的原因的研究一直不清楚因为表观遗传调控的灵活性高根据系统性和当地条件。实际上,它报告了双重角色的乙酰化H3K9在干细胞分化<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B25"> 25<gydF4y2Ba/xref>]。<gydF4y2Ba/p> <p>本研究也有一些局限性。第一,本研究为概念设计的,我们只执行所有调查截肢后3天。尽管它将在很大程度上不同动物的物种中,组蛋白乙酰化作用的居民可以快速诱导细胞损伤后的再生过程。因此,组蛋白乙酰化作用可能在纽特尾组织细胞诱导截肢后很快。的确,组蛋白乙酰化作用之前已经报道过了24小时内增加在非洲爪蟾蜍蝌蚪的尾巴截肢(<gydF4y2Baxref ref-type="bibr" rid="B26"> 26<gydF4y2Ba/xref>]。我们分析了组蛋白乙酰化作用在截肢后仅3天,非常需要进一步的研究来发现组蛋白乙酰化作用的动态变化在截肢后的尾组织细胞在未来。第二,我们使用免疫组织化学分析在这项研究。因为我们怀疑组蛋白修饰主要是观察在截肢后的边缘地区。然而,其他方法,如免疫印迹将更好的组蛋白修饰的量化。否则,我们很难准确定义的特殊细胞类型的尾巴组织进行分析。尽管大多数的细胞增殖细胞核抗原,积极沾AcH3K9, AcH3K14,和AcH3K27一致发现皮肤的表皮组织,我们未能证实增殖细胞之间的关系和组蛋白乙酰化双染色。<gydF4y2Ba/p> <p>总之,从我们的初步数据<gydF4y2Baitalic> 在活的有机体内<gydF4y2Ba/italic>实验表明一个增强的乙酰化H3K9的表达,H3K14, H3K27残树桩周围组织细胞切除尾巴。虽然没有直接证据,表观遗传修饰可能涉及再生蝾螈的截肢的尾巴。<gydF4y2Ba/p> </sec> <back> <sec sec-type="data-availability"> <title>数据可用性<gydF4y2Ba/title> <p>所有数据支持本研究的发现可以在纸上,也可以从相应的作者在合理的请求。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec> <title>信息披露<gydF4y2Ba/title> <p>投资者没有参与研究设计、数据收集、分析、发布决定,或准备手稿。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec sec-type="COI-statement"> <title>的利益冲突<gydF4y2Ba/title> <p>作者声明没有竞争的经济利益。<gydF4y2Ba/p> </sec> <sec> <title>作者的贡献<gydF4y2Ba/title> <p>J.W.,and T. L., conceived and designed the experiments. J.W., X.Z., S.R., and T.L., performed the experiments. J.W., K.A., and T.L., analyzed the data. J.W and T.L., wrote the main manuscript text.</p> </sec> <ack> <title>确认<gydF4y2Ba/title> <p>作者要感谢Takehiko Koji教授和其他员工的组织学和细胞生物学长崎大学的支持本研究。这项工作主要是由教育部的补助金,科学,体育,文化和技术,日本和部分支持网络类型的程序使用/联合研究中心辐射灾难医学广岛大学的长崎大学、福岛医科大学。<gydF4y2Ba/p> </ack> <sec sec-type="supplementary-material" id="supplementary-material-1"> <title>补充材料<gydF4y2Ba/title> <supplementary-material xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/sci/2021/8828931.f1.pdf" id="supp-1" mimetype="application/pdf"> <label>补充材料<gydF4y2Ba/label> <p>补充图1 - 5。<gydF4y2Ba/p> </supplementary-material> </sec> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 卡夫<gydF4y2Ba/surname> <given-names> k P。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 组织修复:隐藏的戏剧<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 器官发生<gydF4y2Ba/italic> <year> 2014年<gydF4y2Ba/year> <volume> 6<gydF4y2Ba/volume> <issue> 4<gydF4y2Ba/issue> <fpage> 225年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 233年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.4161 / org.6.4.12555<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 77956404516<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B2" content-type="article"> <label>2<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Joven<gydF4y2Ba/surname> <given-names> 一个。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 西蒙<gydF4y2Ba/surname> <given-names> 一个。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 稳态和蝾螈再生神经发生<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 神经生物学的进展<gydF4y2Ba/italic> <year> 2018年<gydF4y2Ba/year> <volume> 170年<gydF4y2Ba/volume> <fpage> 81年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 98年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1016 / j.pneurobio.2018.04.006<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 85046133643<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 29654836<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B3" content-type="article"> <label>3<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Chaar<gydF4y2Ba/surname> <given-names> z Y。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Tsilfidis<gydF4y2Ba/surname> <given-names> C。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 纽特理解去分化过程的机会<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 科学世界杂志<gydF4y2Ba/italic> <year> 2006年<gydF4y2Ba/year> <volume> 6<gydF4y2Ba/volume> <supplement> 补充1<gydF4y2Ba/supplement> <fpage> 55<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 64年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1100 / tsw.2006.327<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 33846516346<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 17205187<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B4" content-type="article"> <label>4<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 斯图尔特<gydF4y2Ba/surname> <given-names> 年代。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 兽形杯<gydF4y2Ba/surname> <given-names> Z.-Y。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Belmonte<gydF4y2Ba/surname> <given-names> j . c。I。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 一个组蛋白demethylase在斑马鱼再生所必需的<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国<gydF4y2Ba/italic> <year> 2009年<gydF4y2Ba/year> <volume> 106年<gydF4y2Ba/volume> <issue> 47<gydF4y2Ba/issue> <fpage> 19889年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 19894年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1073 / pnas.0904132106<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 73949090015<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 19897725<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B5" content-type="article"> <label>5<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 李<gydF4y2Ba/surname> <given-names> E。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 染色质修饰和表观遗传重编程在哺乳动物的发展<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 自然遗传学评论<gydF4y2Ba/italic> <year> 2002年<gydF4y2Ba/year> <volume> 3<gydF4y2Ba/volume> <issue> 9<gydF4y2Ba/issue> <fpage> 662年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 673年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1038 / nrg887<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 0036733675<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 12209141<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B6" content-type="article"> <label>6<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 王<gydF4y2Ba/surname> <given-names> Z。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 藏<gydF4y2Ba/surname> <given-names> C。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 罗森菲尔德<gydF4y2Ba/surname> <given-names> j . A。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 周末<gydF4y2Ba/surname> <given-names> d E。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Barski<gydF4y2Ba/surname> <given-names> 一个。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Cuddapah<gydF4y2Ba/surname> <given-names> 年代。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 崔<gydF4y2Ba/surname> <given-names> K。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 卢武铉<gydF4y2Ba/surname> <given-names> t Y。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 彭<gydF4y2Ba/surname> <given-names> W。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 张<gydF4y2Ba/surname> <given-names> m Q。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 赵<gydF4y2Ba/surname> <given-names> K。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 组蛋白乙酰化和甲基化的组合模式在人类基因组中<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 自然遗传学<gydF4y2Ba/italic> <year> 2008年<gydF4y2Ba/year> <volume> 40<gydF4y2Ba/volume> <issue> 7<gydF4y2Ba/issue> <fpage> 897年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 903年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1038 / ng.154<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 46249112085<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 18552846<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B7" content-type="article"> <label>7<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 盖茨<gydF4y2Ba/surname> <given-names> l。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 史<gydF4y2Ba/surname> <given-names> J。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Rohira<gydF4y2Ba/surname> <given-names> 答:D。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 冯<gydF4y2Ba/surname> <given-names> Q。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 朱<gydF4y2Ba/surname> <given-names> B。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 贝德福德<gydF4y2Ba/surname> <given-names> m . T。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Sagum<gydF4y2Ba/surname> <given-names> c。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 荣格<gydF4y2Ba/surname> <given-names> s Y。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 秦<gydF4y2Ba/surname> <given-names> J。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 蔡<gydF4y2Ba/surname> <given-names> m·J。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 蔡<gydF4y2Ba/surname> <given-names> s Y。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 李<gydF4y2Ba/surname> <given-names> W。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 福尔兹<gydF4y2Ba/surname> <given-names> c, E。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 奥马利<gydF4y2Ba/surname> <given-names> b·W。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 乙酰化组蛋白H3赖氨酸9调节开关从转录起始到伸长<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 《生物化学》杂志上<gydF4y2Ba/italic> <year> 2017年<gydF4y2Ba/year> <volume> 292年<gydF4y2Ba/volume> <issue> 35<gydF4y2Ba/issue> <fpage> 14456年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 14472年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1074 / jbc.M117.802074<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 85028879573<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 28717009<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B8" content-type="article"> <label>8<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Creyghton<gydF4y2Ba/surname> <given-names> m P。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 程<gydF4y2Ba/surname> <given-names> 答:W。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Welstead<gydF4y2Ba/surname> <given-names> G·G。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Kooistra<gydF4y2Ba/surname> <given-names> T。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 凯里<gydF4y2Ba/surname> <given-names> b·W。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Steine<gydF4y2Ba/surname> <given-names> e . J。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 汉娜<gydF4y2Ba/surname> <given-names> J。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Lodato<gydF4y2Ba/surname> <given-names> m·A。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 弗兰普顿<gydF4y2Ba/surname> <given-names> g . M。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 锋利的<gydF4y2Ba/surname> <given-names> p。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 波伊尔<gydF4y2Ba/surname> <given-names> l。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 年轻的<gydF4y2Ba/surname> <given-names> r。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> Jaenisch<gydF4y2Ba/surname> <given-names> R。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 组蛋白H3K27ac分离活性的增强剂,预测发展状态<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国<gydF4y2Ba/italic> <year> 2010年<gydF4y2Ba/year> <volume> 107年<gydF4y2Ba/volume> <issue> 50<gydF4y2Ba/issue> <fpage> 21931年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 21936年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1073 / pnas.1016071107<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 78650758676<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="pmid"> 21106759<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B9" content-type="article"> <label>9<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 哈亚希<gydF4y2Ba/surname> <given-names> T。<gydF4y2Ba/given-names> </name> <name> <surname> 竹内<gydF4y2Ba/surname> <given-names> T。<gydF4y2Ba/given-names> </name> </person-group> <article-title> 基因操作使用伊比利亚肋蝾螈的再生研究,Pleurodeles waltl<gydF4y2Ba/article-title> <source> <italic> 分子生物学方法<gydF4y2Ba/italic> <year> 2015年<gydF4y2Ba/year> <volume> 1290年<gydF4y2Ba/volume> <fpage> 297年<gydF4y2Ba/fpage> <lpage> 305年<gydF4y2Ba/lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1007 / 978 - 1 - 4939 - 2495 - 0 - _23<gydF4y2Ba/pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84924365789<gydF4y2Ba/pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B10" content-type="article"> <label>10<gydF4y2Ba/label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Guedelhoefer<gydF4y2Ba/surname> <given-names> o . 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